Search

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Multiplex real-time PCR-HRM is an approach which has gained some attention in recent years. It has already found applications in clinical diagnostics and food authenticity and safety control. Compared to its corresponding singleplex PCR assays, an optimized multiplex PCR assay provides the same information in a fraction of time. First part of this work dealt with isolation of DNA from both fresh fruits and processed commercial products. Six different DNA isolation protocols were tested with fresh fruits – three silica column-based kits, two magnetic carrier-based kits and one conventional protocol. One method was chosen as the most suitable and was applied to DNA isolation from commercial products. These experiments also involved optimisation of the chosen method. The second part of this work was focused on the development of a triplex real-time PCR assay for simultaneous detection of blueberry, strawberry and raspberry, and its application on DNA isolated from commercial products. During DNA isolation, calcium chloride was shown to be a promising agent for removal of pectin from samples. In several samples, presence of raspberry DNA was confirmed by singleplex PCR. We found out that for accurate results of food analysis by this assay, further optimization of its parameters would be needed., Multiplex real-time PCR-HRM je analytická metoda, která v posledních letech získává pozornost. Našla si využití např. v diagnostických aplikacích, při kontrole bezpečnosti potravin, i při ověřování jejich autenticity. Optimalizovaná multiplex PCR reakce dokáže poskytnout stejné informace jako odpovídající singleplex PCR reakce za výrazně kratší dobu. První část této práce byla zaměřena na izolaci DNA jak z čerstvého ovoce, tak i z vybraných průmyslově zpracovaných potravin. Na čerstvém ovoci bylo testováno šest různých metod pro izolaci DNA – tři kolonkové kity, dva kity s magnetickými nosiči a jedna konvenční metoda. Z těchto metod byla vybrána jedna, která byla využita pro izolace DNA z různých typů potravin rostlinného původu. Posledně zmíněné experimenty zahrnovaly i optimalizaci zvolené metody. Druhá část této práce byla zaměřena na vývoj triplex PCR metody pro simultánní detekci borůvek, malin a jahod ve vybraných potravinách. Během izolace DNA se chlorid vápenatý ukázal jako vhodný prostředek k odstranění pektinu ze vzorků, a v několika komerčních výrobcích byla prokázána přítomnost malin pomocí sigleplex PCR, ale z naměřených dat byl vyvozen závěr, že pro získání spolehlivějších výsledků jsou potřebné další optimalizace vyvinuté triplex PCR metody.

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Multiplex real-time PCR-HRM is an approach which has gained some attention in recent years. It has already found applications in clinical diagnostics and food authenticity and safety control. Compared to its corresponding singleplex PCR assays, an optimized multiplex PCR assay provides the same information in a fraction of time. First part of this work dealt with isolation of DNA from both fresh fruits and processed commercial products. Six different DNA isolation protocols were tested with fresh fruits – three silica column-based kits, two magnetic carrier-based kits and one conventional protocol. One method was chosen as the most suitable and was applied to DNA isolation from commercial products. These experiments also involved optimisation of the chosen method. The second part of this work was focused on the development of a triplex real-time PCR assay for simultaneous detection of blueberry, strawberry and raspberry, and its application on DNA isolated from commercial products. During DNA isolation, calcium chloride was shown to be a promising agent for removal of pectin from samples. In several samples, presence of raspberry DNA was confirmed by singleplex PCR. We found out that for accurate results of food analysis by this assay, further optimization of its parameters would be needed., Multiplex real-time PCR-HRM je analytická metoda, která v posledních letech získává pozornost. Našla si využití např. v diagnostických aplikacích, při kontrole bezpečnosti potravin, i při ověřování jejich autenticity. Optimalizovaná multiplex PCR reakce dokáže poskytnout stejné informace jako odpovídající singleplex PCR reakce za výrazně kratší dobu. První část této práce byla zaměřena na izolaci DNA jak z čerstvého ovoce, tak i z vybraných průmyslově zpracovaných potravin. Na čerstvém ovoci bylo testováno šest různých metod pro izolaci DNA – tři kolonkové kity, dva kity s magnetickými nosiči a jedna konvenční metoda. Z těchto metod byla vybrána jedna, která byla využita pro izolace DNA z různých typů potravin rostlinného původu. Posledně zmíněné experimenty zahrnovaly i optimalizaci zvolené metody. Druhá část této práce byla zaměřena na vývoj triplex PCR metody pro simultánní detekci borůvek, malin a jahod ve vybraných potravinách. Během izolace DNA se chlorid vápenatý ukázal jako vhodný prostředek k odstranění pektinu ze vzorků, a v několika komerčních výrobcích byla prokázána přítomnost malin pomocí sigleplex PCR, ale z naměřených dat byl vyvozen závěr, že pro získání spolehlivějších výsledků jsou potřebné další optimalizace vyvinuté triplex PCR metody.

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Multiplex real-time PCR-HRM is an approach which has gained some attention in recent years. It has already found applications in clinical diagnostics and food authenticity and safety control. Compared to its corresponding singleplex PCR assays, an optimized multiplex PCR assay provides the same information in a fraction of time. First part of this work dealt with isolation of DNA from both fresh fruits and processed commercial products. Six different DNA isolation protocols were tested with fresh fruits – three silica column-based kits, two magnetic carrier-based kits and one conventional protocol. One method was chosen as the most suitable and was applied to DNA isolation from commercial products. These experiments also involved optimisation of the chosen method. The second part of this work was focused on the development of a triplex real-time PCR assay for simultaneous detection of blueberry, strawberry and raspberry, and its application on DNA isolated from commercial products. During DNA isolation, calcium chloride was shown to be a promising agent for removal of pectin from samples. In several samples, presence of raspberry DNA was confirmed by singleplex PCR. We found out that for accurate results of food analysis by this assay, further optimization of its parameters would be needed., Multiplex real-time PCR-HRM je analytická metoda, která v posledních letech získává pozornost. Našla si využití např. v diagnostických aplikacích, při kontrole bezpečnosti potravin, i při ověřování jejich autenticity. Optimalizovaná multiplex PCR reakce dokáže poskytnout stejné informace jako odpovídající singleplex PCR reakce za výrazně kratší dobu. První část této práce byla zaměřena na izolaci DNA jak z čerstvého ovoce, tak i z vybraných průmyslově zpracovaných potravin. Na čerstvém ovoci bylo testováno šest různých metod pro izolaci DNA – tři kolonkové kity, dva kity s magnetickými nosiči a jedna konvenční metoda. Z těchto metod byla vybrána jedna, která byla využita pro izolace DNA z různých typů potravin rostlinného původu. Posledně zmíněné experimenty zahrnovaly i optimalizaci zvolené metody. Druhá část této práce byla zaměřena na vývoj triplex PCR metody pro simultánní detekci borůvek, malin a jahod ve vybraných potravinách. Během izolace DNA se chlorid vápenatý ukázal jako vhodný prostředek k odstranění pektinu ze vzorků, a v několika komerčních výrobcích byla prokázána přítomnost malin pomocí sigleplex PCR, ale z naměřených dat byl vyvozen závěr, že pro získání spolehlivějších výsledků jsou potřebné další optimalizace vyvinuté triplex PCR metody.

Multiplex real-time PCR-HRM is an approach which has gained some attention in recent years. It has already found applications in clinical diagnostics and food authenticity and safety control. Compared to its corresponding singleplex PCR assays, an optimized multiplex PCR assay provides the same information in a fraction of time. First part of this work dealt with isolation of DNA from both fresh fruits and processed commercial products. Six different DNA isolation protocols were tested with fresh fruits – three silica column-based kits, two magnetic carrier-based kits and one conventional protocol. One method was chosen as the most suitable and was applied to DNA isolation from commercial products. These experiments also involved optimisation of the chosen method. The second part of this work was focused on the development of a triplex real-time PCR assay for simultaneous detection of blueberry, strawberry and raspberry, and its application on DNA isolated from commercial products. During DNA isolation, calcium chloride was shown to be a promising agent for removal of pectin from samples. In several samples, presence of raspberry DNA was confirmed by singleplex PCR. We found out that for accurate results of food analysis by this assay, further optimization of its parameters would be needed., Multiplex real-time PCR-HRM je analytická metoda, která v posledních letech získává pozornost. Našla si využití např. v diagnostických aplikacích, při kontrole bezpečnosti potravin, i při ověřování jejich autenticity. Optimalizovaná multiplex PCR reakce dokáže poskytnout stejné informace jako odpovídající singleplex PCR reakce za výrazně kratší dobu. První část této práce byla zaměřena na izolaci DNA jak z čerstvého ovoce, tak i z vybraných průmyslově zpracovaných potravin. Na čerstvém ovoci bylo testováno šest různých metod pro izolaci DNA – tři kolonkové kity, dva kity s magnetickými nosiči a jedna konvenční metoda. Z těchto metod byla vybrána jedna, která byla využita pro izolace DNA z různých typů potravin rostlinného původu. Posledně zmíněné experimenty zahrnovaly i optimalizaci zvolené metody. Druhá část této práce byla zaměřena na vývoj triplex PCR metody pro simultánní detekci borůvek, malin a jahod ve vybraných potravinách. Během izolace DNA se chlorid vápenatý ukázal jako vhodný prostředek k odstranění pektinu ze vzorků, a v několika komerčních výrobcích byla prokázána přítomnost malin pomocí sigleplex PCR, ale z naměřených dat byl vyvozen závěr, že pro získání spolehlivějších výsledků jsou potřebné další optimalizace vyvinuté triplex PCR metody.

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Předložená disertační práce se zabývá charakterizací bakteriálních buněk schopných akumulace polyhydroxyalkanoátů (PHA). Disertační práce je vypracovaná formou komentované diskuse publikovaných prací, které jsou součástí příloh. Práce rozvíjí aktuální téma studia protektivních funkcí PHA a nově objasňuje některé protektivní mechanismy vůči vybraným stresorům. V rámci práce byly studovány protektivní účinky PHA granulí před UV zářením a osmotickým stresem, konkrétně hypotonickým prostředím. V případě expozice buněk UV zářením jsou buňky chráněny především díky rozptylu UV záření na granulích, které se vyskytují v těsné blízkosti nukleoidu. U osmotického stresu hraje klíčovou roli amorfní stav PHA granulí, který stabilizuje buněčné membrány při hypertonickém namáhání buněk, načež jsou bakteriální buňky lépe schopné odolávat přechodu do hypotonického prostředí a udržet si svoji buněčnou integritu. Obecně je možné konstatovat, že amorfní stav PHA granulí je klíčový pro zajištění správné biologické funkce PHA, ať už jako zásobního nebo protektivního polymeru. Proto jsme se v další části této práce věnovali objasnění podstaty stabilizačního mechanismu, který chrání nativní PHA granule před krystalizací a udržují tak intracelulární polymer v termodynamicky nevýhodném fázovém stavu. Na základě experimentálních poznatků, kde jsme aplikovali vybrané stresy, jsme navrhli nový model stabilizace amorfního stavu PHA granulí in vivo. Jedná se o kombinaci dvou mechanismů, kdy je z důvodu malého objemu granulí snížena rychlost krystalizace a zároveň voda přítomná v granulích plní roli nízkomolekulárního plastifikátoru. Díky metabolickému aparátu buněk jsou PHA neustále syntetizovány a zároveň degradovány, což vede k navýšení intracelulární koncentrace monomerů, které rovněž figurují v protektivním efektu PHA. V tomto kontextu jsme se tedy zaměřili na popis mechanismu kryoprotektivního účinku 3-hydroxybutyráru, monomeru nejrozšířenějšího zástupce PHA, poly(3-hydroxybutyrátu). Byl ses, This thesis deals with the characterization of bacterial cells capable of polyhydroxyalkanoates (PHA) accumulation. The dissertation thesis is written in the form of a discussed published publications which are attached to the thesis as appendixes. The work develops a study of the current topic of the protective functions of PHA and clarifies protective mechanisms against selected stressors. Firstly, we focused on the protective effects of PHA granules against UV radiation and osmotic stress, specifically hypotonic conditions. In the case of UV exposition, the cells protected themselves by scattering UV radiation on the intracellular granules protecting especially nucleoid. When exposed to osmotic stress, the amorphous state of PHA granules is very important since it is capable of stabilization of cell membranes under hypertonic stress, afterwards, bacterial cells can maintain their integrity during the subsequent hypotonic challenge. In general, the amorphous state of PHA granules is key to ensure the proper biological functions of PHA whether as storage or protective polymer. Therefore, in the next part of this work, we focused on the core of the stabilization mechanism that protects native PHA granules from crystallization and thus the intracellular polymer maintains in a thermodynamically unfavorable amorphous phase state. Based on experimental work, we applied selected stresses because we proposed a new model of stabilization of the amorphous state of PHA granules in vivo. It consists of two mechanisms, where small volumes of PHA granules reduce the rates of crystallization and at the same time the water present in the granules plays the role of a low molecular plasticizer. Due to the metabolic apparatus of bacterial cells, PHA are simultaneously synthesized and degraded which leads to an increment of intracellular concentration of monomers that also figure in the protective effect of PHA. In this context, we aimed at the description of the mechanism of cryopro

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Dalším způsobem izolace DNA je použití komerčně dostupných izolačních kitů, které jsou ovšem ekonomický náročné a neposkytují vysoké výtěžky. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou typů magnetických částic pro adsorpci DNA na pevnou fázi. Magnetické mikročástice P(HEMA – co – GMA) obsahující skupinu –NH2 a nanočástice PLL, které obsahují polylysin. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Následně byly optimalizovány eluční podmínky a nakonec byla testována izolace bakteriální DNA a metoda byla použita k izolaci DNA z reálných vzorků potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě vhodné pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, která je používána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - C, Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol-chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time-consuming and requires the use of toxic phenol. Alternative method of DNA isolation is use of commercially available kits which, however, are expensive and their efficiency is low. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solid-phase DNA extraction. Magnetic microparticles P(HEMA – co – GMA) containing –NH2 group and nanoparticles PLL, whitch contains polylysine. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed on the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. After optimalization, the developed method was used for DNA isolation from real food supplements. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this thesis, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F –

Izolace deoxyribonukleové kyseliny (DNA) je velmi důležitým krokem v molekulární diagnostice mikroorganismů. Pro amplifikaci DNA polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) je nezbytná vysoká kvalita izolované DNA. Izolace DNA pomocí konvenční fenol–chloroformové extrakce a srážení DNA ethanolem je časově náročná a vyžaduje použití toxického fenolu. Magnetické separační techniky využívající magnetické pevné částice jsou jednou z moderních metod, které urychlují izolaci nukleových kyselin. Cílem této práce bylo ověřit použití dvou různých typů magnetických částic pro extrakci DNA na pevné fázi. Množství DNA v separační směsi bylo měřeno za použití ultrafialové spektrofotometrie (UV). Metoda byla testována nejprve na DNA z kuřecích erytrocytů. Pro adsorpci DNA na magnetické částice byl použit fosfátový pufr (pH 7, 7,6 a 8). Ukázalo se, že přibližně polovina DNA byla adsorbována na částice. Eluční podmínky DNA byly také optimalizovány. Poté byla testována bakteriální DNA a metoda použita k izolaci z reálných vzorku potravinových doplňků stravy. Tato DNA eluovaná z částic byla v kvalitě pro PCR. Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je jednoduchá a levná metoda, použivána pro diskriminaci amplikonů po polymerázové řetězové reakci (PCR) v reálném čase. V této práci byla testována HRM-PCR pro rychlou identifikaci kmenů patřících do skupiny Lactobacillus. Byly použity tři různé metody izolace DNA: fenolová extrakce, separace pomocí magnetických částic a izolace pomocí komerčního kitu. K amplifikaci genu 16S rRNA bylo testováno 10 párů primerů pro cílové genové fragmenty (LAC1 - LAC2, LAC2 - LAC4, P1V1 - P2V1, Gro F - GroR, 3BA - 338f - Primer 1, V1F - V1R, CHAU - V3F - CHAU - V3R, CHAU - V6F - CHAU - V6R, poxcDNAFw - poxPromRVC, poxcDNAFw - poxPromRVT). Použitím párů primerů GroF/R a LAC2/4 byly úspěšně identifikovány druhy patřící do rodu Lactobacillus. Byly zjištěny rozdíly mezi použitými metodami extrakce z křivek tání HRM – PCR analýz., Isolation of deoxyribonucleic acid (DNA) is an important step in the molecular diagnostics of microorganisms. A high quality of isolated DNA is necessary for DNA amplification by the polymerase chain reaction (PCR). The conventional DNA isolation using phenol chloroform extraction and DNA precipitation in ethanol is time consuming and requires the use of toxic phenol. Magnetic separation techniques using magnetic solid particles are one of modern methods to speed up the nucleic acids isolation. The aim of this work was to use two different types of magnetic particles for solidphase DNA extraction. The amounts of DNA in separation mixtures were measured using ultraviolet spectrophotometry (UV). The first experimental conditions were tested on chicken erythrocytes DNA. Phosphate buffer (pH 7, 7.6 and 8) was used for adsorption of DNA on magnetic particles. It was shown that approximately almost one half of DNA was adsorbed to the particles. The elution conditions of DNA were also optimized. Secondly, bacterial DNA was tested. This DNA eluted from the particles was in PCR ready quality. High resolution melting (HRM) curve analysis is a simple, low-cost method for amplicon discrimination and easy connection with real-time polymerase chain reaction (PCR). In this contribution, we report rapid species identification of strains belonging to the Lactobacillus group using HRM-PCR. Three different DNA isolation methods were used in this work: phenol extraction, separation using magnetic particles and commercial kit. Ten sets of targeted gene fragments primers (LAC1 – LAC2, LAC2 – LAC4, P1V1 – P2V1, Gro F – Gro R, 3BA-338f – Primer 1, V1F – V1R, CHAU - V3F – CHAU - V3R, CHAU - V6F – CHAU - V6R, poxcDNAFw – poxPromRVC, poxcDNAFw – poxPromRVT) were tested for amplification of the 16S rRNA gene. Use of GroF/R and LAC2/4 primers pairs successfully identify strains belong to the Lactobacillus group. The variance between used extraction methods for evidence of HRM curves was found.

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.

Táto práca sa zaoberá transformáciou Silene vulgaris, ktorú sprostredkováva Agrobacterium tumefaciens a A. rhizogenes. S. vulgaris slúži ako modelová rastlina pre štúdium gynodioecických druhuv. Gynodioecia je evolučný medzistupeň medzi bisexualitou (hermafroditné druhy) a dvojdomosťou (dioecické druhy). Gynodioecické rastliny nesú na niektorých jedincoch bisexuálne kvety, zatiaľ čo iné jedince majú len samičie kvety. Cieľom tejto práce bolo vyvinúť techniku schopnú integrácie cudzieho génu do tejto rastliny, aby bolo možné študovať hlavne evolúciu pohlavnosti u rastlín. Použitím A. rhizogenes boli úspešne pripravené kultúry typu hairy roots, ktoré ale neposkytovali spontánne (transgénne) regeneranty. Podarilo sa experimentálne navrhnúť postup regenerácie S. vulgaris z listových fragmentov, ale tento prvý výsledok nepotvrdil, že agrobaktériom infikované rastliny vzniklé regeneráciou z kalusov ponesú transgénny reportérový systém. Ako pozitívna kontrola boli používané rastliny Nicotiana tabacum., This project is focused on transformation of Silene vulgaris mediated by Agrobacterium tumefaciens and A. rhizogenes. S. vulgaris is a good model plant to study gynodioecy, an evolutionary step from bisexuality to dioecy. Gynodioecious plants form in some individuals bisexual flowers, while the others possess only female flowers. The aim of this research is do develop a technique to introduce foreign genes into this plant to study its developmental consequences. Using A. rhizogenes we successfuly prepared hairy root cultures, which unfortunately do not form shoot regenerants. We have prepared a protocol to induce plant regenerants from S. vulgaris leaf fragments. The first results do not confirm that A. tumefaciens infected plant regenerants harbor reporter transgenes. We used Nicotiana tabacum as a positive control.