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Die ESCRT Maschinerie ist eine Proteinkomplex mit mehreren Untereinheiten, die für die Bildung intraluminaler Vesikel in multivesikulären Körpern, die Zytokinese, das Knospen von Viren und die Reparatur mehrerer Membranen in der Zelle wesentlich ist. Obwohl sich der Rekrutierungsmechanismus zwischen Funktion und Organgellen unterscheidet, sind ESCRT-III und die AAA-ATPase Vps4 die gemeinsamen Nenner für die meisten dieser Prozesse. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae besteht der ESCRT-III Komplex aus vier Kernuntereinheiten: Vps20, Snf7, Vps24 und Vps2. Während diese Proteine wahrscheinlich ähnliche Strukturmerkmale und eine hohe Sequenzhomologie auf Aminosäureebene aufweisen, sind sie in ihrer Funktion nicht redundant. Informationen zur ESCRT-III Organisierung stammen hauptsächlich aus in-vitro Systemen, die klar beschreiben, dass ESCRT-III Untereinheiten miteinander interagieren, um in verschiedenen Formen zu polymerisieren, von kurzen gekrümmten Filamenten und Ringen bis zu helikalen Filamenten, Spiralen und röhrenförmigen Polymeren. Während diese in-vitro Experimente eindeutig die Fähigkeit von ESCRT-III Untereinheiten zur Polymerisation zeigen ist nicht klar, wie ESCRT-III in vivo unter Bildung von Polymeren auf verschiedenen Organellen interagiert. In meiner Doktorarbeit verwendete ich eine Kombination aus Hefegenetik, Fluoreszenzmikroskopie und biochemischer Analyse, um die Organisation von ESCRT-III Filamenten auf Endosomen zu untersuchen. Meine Ergebnisse zeigen wichtige Regionen in den beiden ESCRT-III Kernuntereinheiten Vps24 und Vps2, welche für die Funktion der Proteine essentiell sind. Die Bildung von Vps24 / Vps2 an das Snf7-Protofilament verhindert das Wachstum von Snf7 in lateraler Richtung und steuert dadurch den Aufbau eines funktionellen ESCRT-III-Komplexes. Diese Ergebnisse identifizieren die wichtigsten Wechselwirkungen zwischen diesen ESCRTIII Kernuntereinheiten und ermöglichen die Beschreibung eines Modells, das den Selbstorganisations, The endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) form a multi subunit protein machinery, which is essential for the formation of intraluminal vesicles in multivesicular bodies, cytokinesis, viral budding and repair of several membranes in the cell. Although the recruitment mechanism differs between function and organelles, ESCRT-III and the AAA ATPase Vps4 are the common denominators for most of these processes. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ESCRT-III consists of four core subunits: Vps20, Snf7, Vps24 and Vps2. While these proteins probably share similar structural features and a high sequence homology on amino acid level, they are not redundant in function. All four core subunits are essential to assemble a functional ESCRT-III complex. Information on ESCRT-III assembly is mainly derived from in vitro systems, which describe clearly that ESCRT-III subunits interact with each other to polymerize in various forms, ranging from short curved filaments and rings to helical filaments, spirals and tubular polymers. While these in vitro experiments unambiguously demonstrate the capacity of ESCRT-III subunits to polymerize, it is not clear how ESCRT-III subunits interact to form polymers on different organelles in vivo and how the formation of ESCRT-III polymers leads to the remodelling of their target membranes. In my thesis, I used a combination of yeast genetics, fluorescence microscopy and biochemical analysis to study the subunit organization of ESCRT-III filament on endosomes, and to define how ESCRT-III subunits interact with each other. My results identify important residues in Vps24 and Vps2, which are required for ESCRT-III filament formation. It seems that Vps24 and Vps2 form a heterofilament, in which the two subunits alternate. Furhtermore, the interaction of the Vps24/Vps2 heterofilament alongside the Snf7 protofilament prevents Snf7 growth in lateral direction. This completes the self-assembly process of the ESCRT-III core subuni, vorgelegt von Simon Sprenger, MSc, in deutscher Sprache, Kumulative Dissertation aus vier Artikeln, Dissertation Medical University Innsbruck 2022

Die ESCRT Maschinerie ist eine Proteinkomplex mit mehreren Untereinheiten, die für die Bildung intraluminaler Vesikel in multivesikulären Körpern, die Zytokinese, das Knospen von Viren und die Reparatur mehrerer Membranen in der Zelle wesentlich ist. Obwohl sich der Rekrutierungsmechanismus zwischen Funktion und Organgellen unterscheidet, sind ESCRT-III und die AAA-ATPase Vps4 die gemeinsamen Nenner für die meisten dieser Prozesse. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae besteht der ESCRT-III Komplex aus vier Kernuntereinheiten: Vps20, Snf7, Vps24 und Vps2. Während diese Proteine wahrscheinlich ähnliche Strukturmerkmale und eine hohe Sequenzhomologie auf Aminosäureebene aufweisen, sind sie in ihrer Funktion nicht redundant. Informationen zur ESCRT-III Organisierung stammen hauptsächlich aus in-vitro Systemen, die klar beschreiben, dass ESCRT-III Untereinheiten miteinander interagieren, um in verschiedenen Formen zu polymerisieren, von kurzen gekrümmten Filamenten und Ringen bis zu helikalen Filamenten, Spiralen und röhrenförmigen Polymeren. Während diese in-vitro Experimente eindeutig die Fähigkeit von ESCRT-III Untereinheiten zur Polymerisation zeigen ist nicht klar, wie ESCRT-III in vivo unter Bildung von Polymeren auf verschiedenen Organellen interagiert. In meiner Doktorarbeit verwendete ich eine Kombination aus Hefegenetik, Fluoreszenzmikroskopie und biochemischer Analyse, um die Organisation von ESCRT-III Filamenten auf Endosomen zu untersuchen. Meine Ergebnisse zeigen wichtige Regionen in den beiden ESCRT-III Kernuntereinheiten Vps24 und Vps2, welche für die Funktion der Proteine essentiell sind. Die Bildung von Vps24 / Vps2 an das Snf7-Protofilament verhindert das Wachstum von Snf7 in lateraler Richtung und steuert dadurch den Aufbau eines funktionellen ESCRT-III-Komplexes. Diese Ergebnisse identifizieren die wichtigsten Wechselwirkungen zwischen diesen ESCRTIII Kernuntereinheiten und ermöglichen die Beschreibung eines Modells, das den Selbstorganisations, The endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) form a multi subunit protein machinery, which is essential for the formation of intraluminal vesicles in multivesicular bodies, cytokinesis, viral budding and repair of several membranes in the cell. Although the recruitment mechanism differs between function and organelles, ESCRT-III and the AAA ATPase Vps4 are the common denominators for most of these processes. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae ESCRT-III consists of four core subunits: Vps20, Snf7, Vps24 and Vps2. While these proteins probably share similar structural features and a high sequence homology on amino acid level, they are not redundant in function. All four core subunits are essential to assemble a functional ESCRT-III complex. Information on ESCRT-III assembly is mainly derived from in vitro systems, which describe clearly that ESCRT-III subunits interact with each other to polymerize in various forms, ranging from short curved filaments and rings to helical filaments, spirals and tubular polymers. While these in vitro experiments unambiguously demonstrate the capacity of ESCRT-III subunits to polymerize, it is not clear how ESCRT-III subunits interact to form polymers on different organelles in vivo and how the formation of ESCRT-III polymers leads to the remodelling of their target membranes. In my thesis, I used a combination of yeast genetics, fluorescence microscopy and biochemical analysis to study the subunit organization of ESCRT-III filament on endosomes, and to define how ESCRT-III subunits interact with each other. My results identify important residues in Vps24 and Vps2, which are required for ESCRT-III filament formation. It seems that Vps24 and Vps2 form a heterofilament, in which the two subunits alternate. Furhtermore, the interaction of the Vps24/Vps2 heterofilament alongside the Snf7 protofilament prevents Snf7 growth in lateral direction. This completes the self-assembly process of the ESCRT-III core subuni, vorgelegt von Simon Sprenger, MSc, in deutscher Sprache, Kumulative Dissertation aus vier Artikeln, Dissertation Medical University Innsbruck 2022

The endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) is a part of the heteromeric complex machinery consisting of ESCRT-0, -I, -II, and -III ensuring functional protein traffic of endocytic and biosynthetic cargo. Stepwise sorting of labeled cargo material inside the lumen of the endosome by invagination and abscission of the endosomal membrane to form intraluminal vesicles (ILV’s) is mediated by the ESCRT-III complex. The complex consists of eight members of which Vps20, Snf7, Vps2, and Vps24 are considered ESCRT-III essential subunits, and Chm7, Did2, Ist1, and Mos10/Vps60 are commonly labeled as complex associated proteins. The correct interplay between the proteins ensures cargo sorting into the MVB (multivesicular body) pathway and transport from the late endosome into the vacuolar lumen for degradation. Besides the initial function of vacuolar protein sorting (vps), the complex is involved in a multitude of cellular processes like cell abscission, virus budding, autophagy, and remaining nuclear envelope integrity. The step-wise assembly of the ESCRT-III complex is mediated after the cascade-like ESCRT-0 to ESCRT-II complex formation at the membrane budding site, collecting cargo protein for invagination into the endosomal lumen. ESCRT-III Vps20 is recruited to the membrane by the ESCRT-II member Vps25, then nucleating Snf7 association and oligomerization. Additional assembly of ESCRT-III members like Vps24 and Vps2 further drives membrane bending away from the cytosol to the final abscission event, before being recycled back to cytosolic monomers by Vps4. Although Mos10 has been implicated in the recycling step of the ESCRT-III units by interacting with the Vps4/Vta1 complex, the protein’s function remains poorly characterized. This thesis tried to find new insights in Mos10 functionality by finding yet uncharacterized interacting partners, thus connecting the protein to new putative non-endosomal functions or understanding its role in the established, Der für den endosomalen Protein-Transport erforderliche ESCRT (endosomal sorting complex required for transport)-III Komplex ist ein Teil der heteromeren Komplexmaschinerie, die aus ESCRT-0, -I, -II und -III besteht und die Sortierung von endozytischem und biosynthetischem Cargo in intraluminäre Vesikel (ILVs) bewerkstelligt. Der ESCRT-III Komplex besteht aus acht Mitgliedern, von denen Vps20, Snf7, Vps2 und Vps24 als essentielle Untereinheiten des ESCRT-III-Komplexes angesehen werden, während Chm7, Did2, Ist1 und Mos10/Vps60 gemeinhin als komplexassoziierte Proteine bezeichnet werden. Das korrekte Zusammenspiel der Proteine gewährleistet die Sortierung des Cargos in den MVB (multivesicular body)-Weg und den Transport aus dem späten Endosom in das vakuoläre Lumen zur Degradation. Neben der ursprünglichen Funktion der vakuolären Proteinsortierung (vps) ist der Komplex an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Zellteilung, Virusknospung, Autophagozytose und Aufrechterhaltung der Kernhüllenintegrität beteiligt. Der schrittweise Aufbau des ESCRT-III-Komplexes erfolgt kaskadenartig beginnend mit ESCRT-0- bis zu ESCRT-II an der Knospungsstelle der Membran und sammelt das Cargo-Protein für die Einschleusung in das endosomale Lumen. Das ESCRT-III Protein Vps20 wird durch die ESCRT-II-Untereinheit Vps25 an die Membran rekrutiert, wodurch die Assoziation und Oligomerisierung von Snf7 ausgelöst wird. Weitere ESCRT-III-Mitglieder wie Vps24 und Vps2 sorgen dafür, dass sich die Membran bis zur endgültigen Abtrennung der ILVs vom Zytosol zum Lumen hin verbiegt. Sodann wird der Komplex durch Vps4 wieder aufgelöst. Mos10 wird eine Funktion bei der Auflösung der ESCRT-III Komplexe über den Vps4/Vta1 Komplex zugesprochen, doch ist die Funktion des Proteins nach wie vor unzureichend geklärt. In dieser Arbeit wurde durch Identifizierung bislang nicht charakterisierter Interaktionspartner versucht, neue Einblicke in die Funktionalität von Mos10 zu gewinnen, um einerseits Verbindunge

Proteomics ist ein vergleichsweise neues Teilgebiet der Biochemie, das sich auf die Analyse von Biomolekülen im großen Stil konzentriert. Da der dynamische Bereich von Proteinen sehr groß ist, bleibt die Messung von vielen Proteinen auf ein Mal eine Herausforderung. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll für die Extraktion und Messung des Hefe-Proteoms unter verschiedenen Einflüssen optimiert. Hefe eignet sich sehr gut als biologischer Modellorganismus, da viele Stoffwechselwege zwischen Hefe- und Säugetierzellen konserviert sind. Proteine wurden mit einem LC-MS-System mit normalen Flussgeschwindigkeiten und 5-Minuten-Gradienten gemessen, was einen sehr hohen Probendurchsatz ermöglicht. Für die Aufnahme von Daten wurde ein datenunabhängiger Ansatz (data independent approach, DIA) gewählt. Unter Verwendung dieser Plattform wurde der Effekt von verschiedenen Medikamenten auf das Hefeproteom gemessen. Als Machbarkeitsnachweis wurde Hefe mit Medikamenten aus drei Klassen (Azole, Statine und Antifolate) behandelt und das resultierende Proteom gemessen. Mit 1000-1500 Proteinen, die in jeder Probe bestimmt und quantifiziert werden, können sowohl die Zielproteine der Medikamente als auch Off-Target-Effekte gemessen werden. Die Methode kann auch verwendet werden, um einen behandlungsspezifischen "Fingerabdruck" zu generieren. Die verschiedenen Medikamentenklassen erzeugen spezifische Proteinantworten, die als Tool für das Testen von neuen Medikamenten auf potentielle medizinische Nutzen verwendet werden kann. Obwohl die Messplattform primär für die Messung von Hefezellen etabliert wurde, kann die Probenvorbereitung in leicht abgewandelter Form auch für die Messung von Säugetierzellen verwendet werden. Dies eröffnet weitere mögliche Anwendungsgebiete wie etwa das Testen von verschiedenen Medikamenten auf Toxizität., Proteomics is a relative newcomer in biochemistry, concentrating on measuring proteins on a large scale. As the dynamic range of proteins is vast, the acquisition of large numbers of proteins remains challenging. However, measuring the proteome can reveal a lot of information about behaviour and function of organisms. In this thesis, a protocol for extracting and measuring the proteome of yeast cells under different conditions was optimised. Many biochemical pathways are conserved between yeast and mammalian cells, making yeast an attractive model organism for the analysis of biological functions. The proteome was measured on a standard flow LC-MS system using 5-minute gradients, which enables a very high throughput. A data independent approach (DIA) was taken. Using this platform, the effect of different drugs on the yeast proteome was measured. Yeast was treated with different compounds belonging to three classes (azoles, statins and antifolates) as a proof of concept study. With 1000 - 1500 unique proteins measured in each sample, the proteomic targets of the drugs as well as off-target-effects can be measured. We show that treatment leads to a differential expression in known biochemical pathways relating to the drug targets. This method can also be used to create a "fingerprint" of the drugs' effect on yeast. The different drug classes produce distinct proteomic profiles. This could be used as a tool for screening novel molecules for potential medical uses. While the proteomics platform was first established for measuring yeast cells, using the same sample preparation and acquisition methods for mammalian cell lines (both suspension lines and monolayer cells) leads to further potential areas of use. This could be especially useful in testing for toxicity of drugs against certain types of cells (e.g. liver toxicity)., Anna-Sophia Egger, Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers, in deutscher Sprache, Universität Innsbruck, Masterarbeit, 2020, (VLID)5331827

Aus Pressehefe wurden Milchsäurebakterien isoliert und bei der Herstellung von Weizenbrot eingesetzt. Erste vielversprechende Resultate zeigen klare Auswirkungen auf das Brotaroma. Weitere Untersuchungen sollen Aufschluss geben, ob sich ausgewählte Milchsäurebakterienstämme für Neuentwicklungen von Weizenbroten einsetzen lassen.

Aus Pressehefe wurden Milchsäurebakterien isoliert und bei der Herstellung von Weizenbrot eingesetzt. Erste vielversprechende Resultate zeigen klare Auswirkungen auf das Brotaroma. Weitere Untersuchungen sollen Aufschluss geben, ob sich ausgewählte Milchsäurebakterienstämme für Neuentwicklungen von Weizenbroten einsetzen lassen.

Prozesskontrolle hat einen entscheidenden Einfluss auf Effizienz und Wirtschaftlichkeit von Fermentationen. Um einen Prozess richtig zu steuern bedarf es Informationen die über die klassische Messtechnik hinausgehen (z.B. Zucker- oder Ethanolgehalt). Solche Analyten kann man z.B. mit Hilfe von spektroskopischen Methoden in Fermenterbrühen zeitnah ermitteln. Das Ziel dieser Arbeit war es verschiedene IR Messtechniken (MIR-ATR, NIR-Transmission, NIR-Transflexion) und zwei Probenvorbereitungsmethoden (mit oder ohne Zentrifugation) miteinander zu verglichen. Es sollten auch bereits bestehende Modelle mit neuen verglichen werden um die Robustheit der Methode zu zeigen. Neben Saccharomyces cerevisiae sollte Pichia pastoris als zusätzlicher Organsimus untersucht werden. Die Vorhersagemodelle sollten schließlich in der Praxis bei Fermentationen getestet werden mit dem Ziel die Ausbeute zu erhöhen. Es wurden Proben von Fermentationsprozessen in den verschiedenen IR-Messtechniken gemessen und über HPLC als Referenzanalytik gemessen. Dabei wurden Saccharose, Fructose, Glucose, Essigsäure, Ethanol und Glycerol als Analyten gewählt. Die daraus erhaltenen Spektren und Konzentrationen wurden verwendet um mittels Statistik Software PLS-Modelle zu erstellen. Mit Hilfe dieser Modelle wurden insgesamt vier neue Fed-Batch Fermentationen von S. cerevisiae at-line überwacht und gesteuert. Die MIR-ATR Technik lieferte die besten Modellkennzahlen wegen der höheren Empfindlichkeit im MIR Bereich. Damit können auch noch Fed-Batch Fermentationen in einem niedrigen Bereich von 1 - 3 g/L Zucker im Medium gesteuert werden. Bei der Probenvorbereitung ist die Zentrifugation die bessere Variante. Beim Vergleich der Modelle des Vorgänger-Projekts mit den neuen hat sich gezeigt, dass die Methodik generell sehr robust ist und zu reproduzierbaren Ergebnissen führt. P. pastoris konnte als zusätzlicher Organismus für die IR-Analytik etabliert werden. Der Versuch die PLS-Modelle von S. cerevisiae in der P

Wenn Hefe in einer kontinuierlichen Kultur wächst, kommt es zu einer spontanen Synchronisation der Zellen resultierend in einer stabilen respiratorischen Oszillation. Sowohl weite Teile des Transkriptoms als auch des Metaboloms oszillieren in klaren Phasenbeziehungen zu dieser respiratorischen Aktivität. In dieser Arbeit wird das Phänomen sowohl von theoretischer als auch experimenteller Seite untersucht. Es wird die Dynamik des Lipidoms analysiert und gezeigt, dass dieses ebenfalls oszillatorisches Verhalten aufweist. Dabei gibt es eine Gruppe an Lipiden, die ihre höchsten Konzentrationen in der Phase hoher Sauerstoffaufnahme zeigt und eine andere Gruppe in der Phase niedriger Sauerstoffaufnahme. Zudem werden vier Szenarien betrachtet, die in biochemischen Netzwerken zu Oszillationen führen können. Es wäre möglich, dass es sich um einen rein mechanistischen Effekt ohne eine unmittelbare Funktion - beruhend auf einer negativen Rückkopplung und einer intrinsischen Zeitverzögerung - handelt. Weiterhin könnten diese Oszillationen die sich ändernen physiologischen Anforderungen eines Prozesses, der in einer gegebenen Ordnung abzulaufen hat, widerspiegeln. Unter Verwendung von Minimalsystemen und in-silico Evolution wird gezeigt, dass Oszillationen zu einem Fitnessvorteil auf Einzelzellebene führen können. Dieser beruht zum einen darauf, dass Oszillationen eine zeitliche Trennung der Produktion toxischer Nebenprodukte von der Produktion der durch sie geschädigten Komponenten ermöglicht. Zum anderen erlaubt oszillatorisches Verhalten das Ablaufen von Reaktionen in dem für sie jeweils günstigsten Reaktionsmilieu. Basierend auf den experimentell bestimmten Austauschraten für Glucose, O2 und CO2 wird mittels FBA untersucht, wie sich die optimalen Syntheseraten von Biomasse und die Vorläufer selbiger über den Zyklus hinweg ändern. Die Ergebnisse deuten auf eine Trennung von Biosynthese und Stressantwort hin, was eine mögliche Funktion dieser Zyklen darstellen könnte., When grown in continuous culture, budding yeast tend to autosynchronize resulting in a stable respiratory oscillation. Thereby, respiration toggles between high and low oxygen uptake rates. In parallel with this toggling, most facets of cellular physiology oscillate with distinct phase relationships e.g the transcriptome and metabolome. In this work, the phenomenon is examined from a theoretical as well as an experimental point of view. It can be shown that also the lipidome is oscillatory whereby one group of lipids peaks in the phase of high oxygen uptake and the second group of lipids in the phase of low oxygen uptake. Furthermore, four scenarios are presented that might lead to oscillatory dynamics in biochemical networks: Oscillation might occur due to a negative feedback and an intrinsic time delay without bearing a certain function. They could further reflect the changing physiological requirements of a process that has to be performed in a certain order. Using generic models and in-silico evolution, it can be shown that oscillations can also be beneficial on a single cell level since they allow a temporal separation of the production of a toxic by-product and the synthesis of its target and also that reactions can occur in their respective favored reaction milieu. Using measured exchange rates for glucose, O2 and CO2 as constraints for FBA, it is examined how the optimal synthesis rates for biomass and its precursors vary over a cycle. The results suggest that there is a temporal separation of processes related to biosynthesis and stress response which might reflect a possible function of the yeast metabolic cycle.

Wenn Hefe in einer kontinuierlichen Kultur wächst, kommt es zu einer spontanen Synchronisation der Zellen resultierend in einer stabilen respiratorischen Oszillation. Sowohl weite Teile des Transkriptoms als auch des Metaboloms oszillieren in klaren Phasenbeziehungen zu dieser respiratorischen Aktivität. In dieser Arbeit wird das Phänomen sowohl von theoretischer als auch experimenteller Seite untersucht. Es wird die Dynamik des Lipidoms analysiert und gezeigt, dass dieses ebenfalls oszillatorisches Verhalten aufweist. Dabei gibt es eine Gruppe an Lipiden, die ihre höchsten Konzentrationen in der Phase hoher Sauerstoffaufnahme zeigt und eine andere Gruppe in der Phase niedriger Sauerstoffaufnahme. Zudem werden vier Szenarien betrachtet, die in biochemischen Netzwerken zu Oszillationen führen können. Es wäre möglich, dass es sich um einen rein mechanistischen Effekt ohne eine unmittelbare Funktion - beruhend auf einer negativen Rückkopplung und einer intrinsischen Zeitverzögerung - handelt. Weiterhin könnten diese Oszillationen die sich ändernen physiologischen Anforderungen eines Prozesses, der in einer gegebenen Ordnung abzulaufen hat, widerspiegeln. Unter Verwendung von Minimalsystemen und in-silico Evolution wird gezeigt, dass Oszillationen zu einem Fitnessvorteil auf Einzelzellebene führen können. Dieser beruht zum einen darauf, dass Oszillationen eine zeitliche Trennung der Produktion toxischer Nebenprodukte von der Produktion der durch sie geschädigten Komponenten ermöglicht. Zum anderen erlaubt oszillatorisches Verhalten das Ablaufen von Reaktionen in dem für sie jeweils günstigsten Reaktionsmilieu. Basierend auf den experimentell bestimmten Austauschraten für Glucose, O2 und CO2 wird mittels FBA untersucht, wie sich die optimalen Syntheseraten von Biomasse und die Vorläufer selbiger über den Zyklus hinweg ändern. Die Ergebnisse deuten auf eine Trennung von Biosynthese und Stressantwort hin, was eine mögliche Funktion dieser Zyklen darstellen könnte., When grown in continuous culture, budding yeast tend to autosynchronize resulting in a stable respiratory oscillation. Thereby, respiration toggles between high and low oxygen uptake rates. In parallel with this toggling, most facets of cellular physiology oscillate with distinct phase relationships e.g the transcriptome and metabolome. In this work, the phenomenon is examined from a theoretical as well as an experimental point of view. It can be shown that also the lipidome is oscillatory whereby one group of lipids peaks in the phase of high oxygen uptake and the second group of lipids in the phase of low oxygen uptake. Furthermore, four scenarios are presented that might lead to oscillatory dynamics in biochemical networks: Oscillation might occur due to a negative feedback and an intrinsic time delay without bearing a certain function. They could further reflect the changing physiological requirements of a process that has to be performed in a certain order. Using generic models and in-silico evolution, it can be shown that oscillations can also be beneficial on a single cell level since they allow a temporal separation of the production of a toxic by-product and the synthesis of its target and also that reactions can occur in their respective favored reaction milieu. Using measured exchange rates for glucose, O2 and CO2 as constraints for FBA, it is examined how the optimal synthesis rates for biomass and its precursors vary over a cycle. The results suggest that there is a temporal separation of processes related to biosynthesis and stress response which might reflect a possible function of the yeast metabolic cycle.

Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men., In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men., In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

Die toxische Wirkung von Kationen ist verantwortlich für eine Reihe biologischer und pathologischer Erscheinungen. Zu den übergreifenden Zielen des Gesamtvorhabens wurden als wissenschaftliche Arbeiten i) die Analyse, graphische Darstellung und darauf basierende Gewichtung spezifischer genomischer Promotor-Regionen, ii) die Verarbeitung, Auswertung und genomweite Analyse von Mikro-Array Experimenten über die Auswirkung verschiedener Schwermetalle auf S. cerevisiae, iii) Mitarbeit an einer Simulations-Umgebung mit Modulen zur Digitalisierung, Präsentation, Analyse und mathematischer Modellierung der räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle sowie iv) ein Ansatz zur Modellierung der Kationen-Homöostase unter Verwendung der Theorie der Nichtgleichgewichts Thermodynamik beigetragen. Im Vordergrund der bioinformatorischen Arbeiten stand dabei der iterative Prozess, in dem verfügbare experimentelle Ergebnisse in aussagefähige Modelle oder Anwendungen übertragen wurden und die Resultate der Modellierung oder Vorhersage wiederum in neue entsprechende Experimente umgesetzt wurden. Die Anwendungsumgebung zur Promotoranalyse sowie die Simulationsumgebung zur räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle wie zum Beispiel markierte Signalmoleküle wurde bereits veröffentlicht und erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse der genomweiten Analyse liefern Erkenntnisse über die individuellen Mechanismen und Strategien der Hefe auf verschiedene Metallionen in toxischer Konzentration zu reagieren. Der theoretische biophysikalisch-thermodynamische Ansatz liefert ein fundamentales Modell der Kationen-Homöostase der zahlenmäßig bedeutendsten Kationen: Kalium, Natrium und Protonen. Das Modell wurde an experimentellen Daten getest und konnte diese reproduzieren. Entsprechende Perspektiven für die Weiterentwicklung des Modells werden diskutiert., Cationic toxicity is relevant for a number of qualitatively different biological and medical phenomena such as cationic surfactants, salt and heavy metal stress in plants and a number of pathological conditions which share similar critical metabolic processes (i.e. protein aggregation and oxidative stress). In line with the overall project goals the scientific work contributed to i) the analysis, graphical presentation and the respective assessment of specific genomic promoter-regions, ii) the conversion, evaluation and genome wide analysis of micro-array experiments on the effects of exposition of S. cerevisiae to heavy metals, iii) a simulation environment comprising modules for digitalization, presentation, analysis and mathematical modeling of the spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules, and iv) a cation homeostasis modeling approach based on the non-linear thermodynamics theory. The bioinformatical work focused on an iterative process in which available experimental results were transferred into meaningful models or applications and results of modeling or prediction into corresponding new experimental designs. The software for the promoter-analysis and the simulation environment for integration of spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules like labeled signal molecules have already been published and successfully implemented.The results of the genome-wide analysis - based on experiments of a project partner - provide insights in the individual mechanisms and strategies of the yeast cell upon exposition to various (heavy) metals in toxic concentrations. The theoretical biophysical-thermodynamic approach provides a fundamental model of cation homeostasis in S.cerevisiae of the major cations: potassium, sodium and protons. The model - confronted with experimental data - is capable to reproduce the observed uptake rates to a reasonable degree. Perspectives for further development of the model are discussed.

Mathematische Modellierung ist ein wichtiges Werkzeug biologischer Forschung geworden, was sich in der Entstehung von Systembiologie widerspiegelt. Eine erfolgreiche Anwendung mathematischer Methoden auf biologische Fragen erfordert die Zusammenarbeit zwischen experimentell und theoretisch arbeitenden Wissenschaftlern, auch um sicherzustellen, dass die Biologie im Modell adäquat dargestellt wird. Ich präsentiere hier zwei Untersuchungen zur Anpassung von Saccharomyces cere- visae an hyperosmotische Bedingungen: Eine biologisch detailgetreue Beschreibung der Signaltransduktion zur Aktivierung von Hog1 und ein Model, das Anpassung an osmotischen Stress in zellulärem Zusammenhang beschreibt. Die Studie zur Osmoadaptation in zellulären Kontext impliziert, dass Hog1 und Fps1, zwei wichtige Bausteine dieses Adaptationsvorgangs, miteinander in Wechselwirkung treten und dies zur Anpassung beiträgt. Dieses Ergebnis wird durch die Integration verschiedener Hefestämme mit zum Teil gegensätzlich wirkenden Mutationen ermöglicht. Diese Studie offenbart des weiteren, dass die Rolle von Glycerol in der langfristigen Anpassung bisher überschätzt wurde. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Glycerol als ’Not’-Osmolyt eingesetzt wird und andere Stoffe, z.B. Trehalose, erheblich zu dauerhafter Osmoadaptation beitragen. Durch die Betrachtung des Zustands mehrerer zellulärer Mechansimen wird deutlich, dass Osmoadaptation stark vom Kontext abhängig ist und nicht perfekt ist. Der Preis schlägt sich in langsamerem Wachstum nieder. Zeitabhängige Sensitivitätsanalyse des Modells untermauert diese Hypothese. Die gewählte Perspektive ermöglicht die Betrachtung von intrazellulären Signaltransduktionskomponenten, Metaboliten und des Wachstums. Der Vergleich mit einer Studie, die Anpassung an osmotischen Stress als perfekte Adaptation auf Grund eines vereinfachten Modells beschreibt, hebt die Rolle der gewählten Perspektive zum Verständnis biologischer Systeme hervor., Mathematical modeling has become an important tool in biology, reflected in the emergence of systems biology. Successful application of mathematical methods to biological questions requires collaboration of experimental and theoretical scientists to identify and study the problem at hand and to ensure that biology and model match. In this thesis, I present two studies on adaptation to hyperosmotic conditions in the yeast Saccharomyces cerevisae: A biologically faithful description of the signaling pathways activating Hog1 and a model integrating the effects of Hog1-activity and cellular metabolism, describing osmoadaptation in cellular context. The study of osmoadaptation in cellular context suggests that Hog1 and Fps1, two crucial components of adaptation, interact upon hyperosmotic stress. This finding is facilitated by incorporating multiple strains with mutations leading to partly oppositional phenotypes. This study further reveals that the role of glycerol in long term adaptation has been overestimated so far. According to the results presented here, glycerol is utilized as an ’emergency’ osmoprotectant and other compounds, e.g. trehalose, contribute significantly to osmoadaptation. Accounting for the state of multiple cellular mechanisms (Hog1-activity, glycolysis, growth) shows that adaptation to hyperosmotic stress and the impact of the individual mechanisms of adaptation is context dependent and that adaptation to sustained osmostress is not perfect, the expense reflected in a reduced growth rate in hyperosmotic medium. Time-dependent sensitivity analysis supports the notion of context. The perspective chosen allows observations on intracellular signaling components, metabolites and growth speed. Comparison with a study that describes osmoadaptation as perfect adaptation highlights the role of this perspective for the conclusions drawn, thus emphasizing the importance of an integrative perspective for understanding biological systems.

Die toxische Wirkung von Kationen ist verantwortlich für eine Reihe biologischer und pathologischer Erscheinungen. Zu den übergreifenden Zielen des Gesamtvorhabens wurden als wissenschaftliche Arbeiten i) die Analyse, graphische Darstellung und darauf basierende Gewichtung spezifischer genomischer Promotor-Regionen, ii) die Verarbeitung, Auswertung und genomweite Analyse von Mikro-Array Experimenten über die Auswirkung verschiedener Schwermetalle auf S. cerevisiae, iii) Mitarbeit an einer Simulations-Umgebung mit Modulen zur Digitalisierung, Präsentation, Analyse und mathematischer Modellierung der räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle sowie iv) ein Ansatz zur Modellierung der Kationen-Homöostase unter Verwendung der Theorie der Nichtgleichgewichts Thermodynamik beigetragen. Im Vordergrund der bioinformatorischen Arbeiten stand dabei der iterative Prozess, in dem verfügbare experimentelle Ergebnisse in aussagefähige Modelle oder Anwendungen übertragen wurden und die Resultate der Modellierung oder Vorhersage wiederum in neue entsprechende Experimente umgesetzt wurden. Die Anwendungsumgebung zur Promotoranalyse sowie die Simulationsumgebung zur räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle wie zum Beispiel markierte Signalmoleküle wurde bereits veröffentlicht und erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse der genomweiten Analyse liefern Erkenntnisse über die individuellen Mechanismen und Strategien der Hefe auf verschiedene Metallionen in toxischer Konzentration zu reagieren. Der theoretische biophysikalisch-thermodynamische Ansatz liefert ein fundamentales Modell der Kationen-Homöostase der zahlenmäßig bedeutendsten Kationen: Kalium, Natrium und Protonen. Das Modell wurde an experimentellen Daten getest und konnte diese reproduzieren. Entsprechende Perspektiven für die Weiterentwicklung des Modells werden diskutiert., Cationic toxicity is relevant for a number of qualitatively different biological and medical phenomena such as cationic surfactants, salt and heavy metal stress in plants and a number of pathological conditions which share similar critical metabolic processes (i.e. protein aggregation and oxidative stress). In line with the overall project goals the scientific work contributed to i) the analysis, graphical presentation and the respective assessment of specific genomic promoter-regions, ii) the conversion, evaluation and genome wide analysis of micro-array experiments on the effects of exposition of S. cerevisiae to heavy metals, iii) a simulation environment comprising modules for digitalization, presentation, analysis and mathematical modeling of the spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules, and iv) a cation homeostasis modeling approach based on the non-linear thermodynamics theory. The bioinformatical work focused on an iterative process in which available experimental results were transferred into meaningful models or applications and results of modeling or prediction into corresponding new experimental designs. The software for the promoter-analysis and the simulation environment for integration of spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules like labeled signal molecules have already been published and successfully implemented.The results of the genome-wide analysis - based on experiments of a project partner - provide insights in the individual mechanisms and strategies of the yeast cell upon exposition to various (heavy) metals in toxic concentrations. The theoretical biophysical-thermodynamic approach provides a fundamental model of cation homeostasis in S.cerevisiae of the major cations: potassium, sodium and protons. The model - confronted with experimental data - is capable to reproduce the observed uptake rates to a reasonable degree. Perspectives for further development of the model are discussed.

Bevor sich eine Zelle teilt muss sie ihr gesamtes genetisches Material verdoppeln. Eukaryotische Genome werden von einer Vielzahl von Replikationsstartpunkten, den sogenannten Origins, aus repliziert, die über das gesamte Genome verteilt sind. In dieser Arbeit wird der zugrundeliegende molekulare Mechanismus quantitativ analysiert, der für die nahezu simultane Initiierung der Origins exakt ein Mal pro Zellzyklus verantwortlich ist. Basierend auf umfangreichen experimentellen Studien, wird zunächst ein molekulares regulatorisches Netzwerk rekonstruiert, welches das Binden von Molekülen an die Origins beschreibt, an denen sich schließlich komplette Replikationskomplexe (RKs) bilden. Die molekularen Reaktionen werden dann in ein Differentialgleichungssystem übersetzt. Um dieses mathematische Modell zu parametrisieren, werden gemessene Proteinkonzentrationen als Anfangswerte verwendet, während kinetische Parametersätze in einen Optimierungsverfahren erzeugt werden, in welchem die Dauer, in der sich eine Mindestanzahl von RKs gebildet hat, minimiert wird. Das Modell identifiziert einen Konflikt zwischen einer schnellen Initiierung der Origins und einer effizienten Verhinderung der DNA Rereplikation. Modellanalysen deuten darauf hin, dass eine zeitlich verzögerte Origininitiierung verursacht durch die multiple Phosphorylierung der Proteine Sic1 und Sld2 durch Cyclin-abhängige Kinasen, G1-Cdk bzw. S-Cdk, essentiell für die Lösung dieses Konfliktes ist. Insbesondere verschafft die Mehrfach-Phosphorylierung von Sld2 durch S-Cdk eine zeitliche Verzögerung, die robust gegenüber Veränderungen in der S-Cdk Aktivierungskinetik ist und außerdem eine nahezu simultane Aktivierung der Origins ermöglicht. Die berechnete Verteilung der Fertigstellungszeiten der RKs, oder die Verteilung der Originaktivierungszeiten, wird auch genutzt, um die Konsequenzen bestimmter Mutationen im Assemblierungsprozess auf das Kopieren des genetischen Materials in der S Phase des Zellzyklus zu simulieren., Before a cell divides it has to duplicate its entire genetic material. Eukaryotic genomes are replicated from multiple replication origins across the genome. This work is focused on the quantitative analysis of the underlying molecular mechanism that allows these origins to initiate DNA replication almost simultaneously and exactly once per cell cycle. Based on a vast amount of experimental findings, a molecular regulatory network is constructed that describes the assembly of the molecules at the replication origins that finally form complete replication complexes. Using mass–action kinetics, the molecular reactions are translated into a system of differential equations. To parameterize the mathematical model, the initial protein concentrations are taken from experimental data, while kinetic parameter sets are determined using an optimization approach, in particular a minimization of the duration, in which a minimum number of replication complexes has formed. The model identifies a conflict between the rapid initiation of replication origins and the efficient inhibition of DNA rereplication. Analyses of the model suggest that a time delay before the initiation of DNA replication provided by the multiple phosphorylations of the proteins Sic1 and Sld2 by cyclin-dependent kinases in G1 and S phase, G1-Cdk and S-Cdk, respectively, may be essential to solve this conflict. In particular, multisite phosphorylation of Sld2 by S-Cdk creates a time delay that is robust to changes in the S-Cdk activation kinetics and additionally allows the near-simultaneous activation of multiple replication origins. The calculated distribution of the assembly times of replication complexes, that is also the distribution of origin activation times, is then used to simulate the consequences of certain mutations in the assembly process on the copying of the genetic material in S phase of the cell cycle.

Bevor sich eine Zelle teilt muss sie ihr gesamtes genetisches Material verdoppeln. Eukaryotische Genome werden von einer Vielzahl von Replikationsstartpunkten, den sogenannten Origins, aus repliziert, die über das gesamte Genome verteilt sind. In dieser Arbeit wird der zugrundeliegende molekulare Mechanismus quantitativ analysiert, der für die nahezu simultane Initiierung der Origins exakt ein Mal pro Zellzyklus verantwortlich ist. Basierend auf umfangreichen experimentellen Studien, wird zunächst ein molekulares regulatorisches Netzwerk rekonstruiert, welches das Binden von Molekülen an die Origins beschreibt, an denen sich schließlich komplette Replikationskomplexe (RKs) bilden. Die molekularen Reaktionen werden dann in ein Differentialgleichungssystem übersetzt. Um dieses mathematische Modell zu parametrisieren, werden gemessene Proteinkonzentrationen als Anfangswerte verwendet, während kinetische Parametersätze in einen Optimierungsverfahren erzeugt werden, in welchem die Dauer, in der sich eine Mindestanzahl von RKs gebildet hat, minimiert wird. Das Modell identifiziert einen Konflikt zwischen einer schnellen Initiierung der Origins und einer effizienten Verhinderung der DNA Rereplikation. Modellanalysen deuten darauf hin, dass eine zeitlich verzögerte Origininitiierung verursacht durch die multiple Phosphorylierung der Proteine Sic1 und Sld2 durch Cyclin-abhängige Kinasen, G1-Cdk bzw. S-Cdk, essentiell für die Lösung dieses Konfliktes ist. Insbesondere verschafft die Mehrfach-Phosphorylierung von Sld2 durch S-Cdk eine zeitliche Verzögerung, die robust gegenüber Veränderungen in der S-Cdk Aktivierungskinetik ist und außerdem eine nahezu simultane Aktivierung der Origins ermöglicht. Die berechnete Verteilung der Fertigstellungszeiten der RKs, oder die Verteilung der Originaktivierungszeiten, wird auch genutzt, um die Konsequenzen bestimmter Mutationen im Assemblierungsprozess auf das Kopieren des genetischen Materials in der S Phase des Zellzyklus zu simulieren., Before a cell divides it has to duplicate its entire genetic material. Eukaryotic genomes are replicated from multiple replication origins across the genome. This work is focused on the quantitative analysis of the underlying molecular mechanism that allows these origins to initiate DNA replication almost simultaneously and exactly once per cell cycle. Based on a vast amount of experimental findings, a molecular regulatory network is constructed that describes the assembly of the molecules at the replication origins that finally form complete replication complexes. Using mass–action kinetics, the molecular reactions are translated into a system of differential equations. To parameterize the mathematical model, the initial protein concentrations are taken from experimental data, while kinetic parameter sets are determined using an optimization approach, in particular a minimization of the duration, in which a minimum number of replication complexes has formed. The model identifies a conflict between the rapid initiation of replication origins and the efficient inhibition of DNA rereplication. Analyses of the model suggest that a time delay before the initiation of DNA replication provided by the multiple phosphorylations of the proteins Sic1 and Sld2 by cyclin-dependent kinases in G1 and S phase, G1-Cdk and S-Cdk, respectively, may be essential to solve this conflict. In particular, multisite phosphorylation of Sld2 by S-Cdk creates a time delay that is robust to changes in the S-Cdk activation kinetics and additionally allows the near-simultaneous activation of multiple replication origins. The calculated distribution of the assembly times of replication complexes, that is also the distribution of origin activation times, is then used to simulate the consequences of certain mutations in the assembly process on the copying of the genetic material in S phase of the cell cycle.

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Die Wein-, Bier- und Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist der Hauptproduzent in der weltweiten Alkoholproduktion. Im Rahmen der Untersuchungen zur Bioethanolproduktion sollten in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen der Überproduktion aller am Glucoseumsatz der Hefe Saccharomyces cerevisiae beteiligten Enzyme in vivo untersucht werden, um die Möglichkeit einer beschleunigten Ethanolproduktion zu eröffnen. Hierzu war von Vorteil, dass S. cerevisiae sowohl klassisch-genetisch als auch molekulargenetisch zu den bestuntersuchten eukaryontischen Organismen zählt. So standen zwei verschiedene Hochkopienzahl-Vektoren zur Verfügung, in die im ersten Teil der Arbeit jeweils die Hälfte der zu exprimierenden Gene eingesetzt werden konnten. Dies erfolgte in den ersten Schritten durch Restriktion und Ligation und im weiteren Verlauf durch eine Kombination der PCR-Technik zur Amplifikation der in Frage kommenden Genomfragmente mit der effizienten homologen Rekombination in vivo. So wurden sowohl das Gen für einen Hexosetransporter (HXT1), als auch alle für die Glykolyseenzyme kodierenden Gene (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1) und die für die abschließenden Schritte der Umwandlung von Pyruvat in Ethanol kodierenden Gene (PDC1, ADH1) kloniert. Nach Isolierung aus der Hefe wurden die entsprechenden Plasmide anschließend in E. coli amplifiziert und Restriktionsanalysen unterzogen. Die Bestimmung der spezifischen Enzymaktivitäten in Extrakten aus entsprechenden Hefetransformanten ergab eine leichte Überproduktion (Faktor 1,5 bis 3,0) für alle Enzyme mit Ausnahme der Glycerinaldehyd-3-phosphat Dehydrogenase. Für HXT1 wurde eine deutlich erhöhte Transkriptionsrate (Faktor 14 im Vergleich zum Ausgangsstamm) als Indiz für die tatsächliche Überproduktion gewertet. In den enzymatischen Messungen zeigte sich eine deutliche Tendenz zur Senkung der Überproduktion mit zunehmender Zahl der plasmidkodierten Gene. Hieraus läßt sich eine negative Rü, The wine-, beer- and baker's yeast Saccharomyces cerevisiae is the major source in world wide alcohol production. Regarding the research in bioethanol production, the work presented here was aimed to examine the effect of the in vivo overproduction of all enzymes contributing to the conversion of glucose to ethanol in the yeast Saccharomyces cerevisiae with the prospect of increasing ethanol formation. S. cerevisiae is probably the best studied eucaryotic organism with respect to both classical and molecular genetics. It turned out to be of great advantage that two different multi-copy-vectors could be employed in these studies. Each of them was used in the first part of the work to insert half of the set of genes intended for overexpression. The first genes were inserted by restriction and ligation and later on a combination of the PCR-technique, with which the genomic fragments of interest were amplified, and the efficient homologous recombination in vivo was used. With these methods, the gene encoding a hexose transporter (HXT1), all the genes encoding glycolytic enzymes (HXK2, PGI1, PFK1, PFK2, FBA1, TPI1, TDH1 bzw. TDH2, PGK1, GPM1, ENO2, PYK1), as well as the genes encoding enzymes needed for the conversion of pyruvate to ethanol (PDC1, ADH1), were cloned. Following the isolation from yeast, the plasmids were amplified in E. coli and characterized by restriction analysis. The measurement of specific enzyme activity in crude extract of yeast transformants with such plasmids showed a slight overproduction (factor 1,5 to 3,0) for all enzymes, except for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. For HXT1, an increased mRNA level (factor 14 in contrast to the control) was taken as evidence for overproduction. In the enzymatic determinations a clear tendency showing a lower overproduction with an increasing number of genes on the plasmids was observed. These findings suggest a negative feedback on glycolytic flux regulation. The the growth rates obtained in the seco

Die quantitative Messung der Farbstoffspeicherung von Modellsubstanzen und Hefezellen in Abhängigkeit von der CH zeigen bei den drei untersuchten Farbstoffen Rhodamin B, Eosin und Neutralrot, daß die elektrische Ladung von Adsorbens und Adsorptiv eine ausschlaggebende Rolle beim Zustandekommen einer Speicherung spielt. Die Speicherungskurven der Farbstoffe Rhodamin B und Neutralrot für Hefezellen weisen eine eigenartige Feinstruktur auf, die als Ausdruck einer plasmatischen Zustandsänderung aufzufassen ist. Die früher gefundene Verschiebung des IEP der Hefezellen nach dem Abtöten konnte neuerdings bestätigt werden. Unter Zugrundelegung der untersuchten Dissoziationsverhältnisse des Neutralrots wird eine Erklärung für Speicherungsmechanismus dieses Farbstoffes im Plasma und in der Vakuole gegeben wobei gleichzeitig die Ursachen der Vakuolenkontraktion gedeutet werden. Auf den methodischen Wert dieser Erkenntnisse für zellphysiologische Untersuchungen wird hingewiesen. Neutralrot zeigt in seinen optischen Eigenschaften eine enge Verwandt-schaft mit Acridinorange. Die kataphoretischen Untersuchungen an gefärbten und un-gefärbten Hefezellen bestätigen die bereits früher gegebene Auffassung der weitgehen-den Beeinflussung des elektrischen Zustandes des Adsorbens durch die Anfärbung.