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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A chagasina, um inibidor endógeno de cisteíno proteases de Trypanosoma cruzi, regula a atividade da protease parasitária cruzaína durante o ciclo de vida do parasita. Experimentos in vitro mostram que a chagasina também inibe a catepsina L, uma enzima homóloga humana. Enquanto a chagasina inibe ambas enzimas com potências similares, mutações nesta proteína tem diferentes efeitos na ligação para essas enzimas. Os mutantes T31A e T31A/T32A se ligam bem à catepsina L, mas a afinidade deles para a cruzaína cai de aproximadamente 40 a 140 vezes. Por outro lado, o mutante W93A mantém potência frente à cruzaína, mas perde afinidade contra a catepsina L. Neste trabalho, foram realizados estudos de modelagem comparativa e simulações de dinâmica molecular para entender a seletividade de inibição da cruzaína e catepsina L pelos mutantes da chagasina W93A, T31A e T31A/T32A. Os resultados possibilitaram obtenção de um perfil de interações não ligadas nas interfaces de cada mutante em complexo com as cisteíno proteases. Além disso, observamos diferenças na conformação de ligação dos loops L2 e L6 da chagasina do mutante W93A, favorecendo as interações com a cruzaína e reduzindo as interações com a catepsina L. Estas diferenças são associadas com uma dissociação parcial do complexo W93Acatepsina L, fornecendo uma possível causa para a seletividade do mutante W93A em relação à cruzaína. Adicionalmente, foram realizados cálculos de energia livre para avaliação do impacto de mutações na afinidade dos complexos da cruzaína e catepsina L através do método MM/GBSA. Apesar deste método ter como vantagem seu baixo custo computacional, observamos baixa correlação entre os valores de variação de energia livre de ligação preditos por MM/GBSA e os dados experimentais.

As proteínas evoluem ao longo do tempo, devido ao acúmulo de mutações, inserções e deleções nos genes que as codificam. Posições fortemente conservadas geralmente referem-se a resíduos que são estritamente necessários para a estrutura da proteína ou para sua função. A metodologia DRCN (Decomposition of Residue Coevolution Networks) permite estudar coevolução de resíduos em famílias de proteínas. Para tanto, consiste em cinco etapas básicas: filtragem do alinhamento, cálculo de correlações, decomposição da rede, geração de arquivos de visualização auxiliares e anotação de posições por busca automática no UniProt. As cisteíno proteases são um grande e diverso grupo de enzimas que pertencem ao clã CA e à família C1 (família da papaína) e podem ser encontradas em todos os animais e reinos de plantas bem como em muitos vírus e organismos procariotas. O presente trabalho tem como objetivo analisar e discutir a importância dos resíduos correlacionados e conservados da família das cisteíno proteases a partir do alinhamento múltiplo de sequências. Para tanto utilizamos, o software PFSTATS, que emprega a metodologia DRCN. Foram encontrados 34 resíduos correlacionados dispostos em 5 comunidades de resíduos que coevoluem. A comunidade 1 é a maior comunidade, sendo formada por 22 resíduos que coevoluem tanto por questões estruturais, como por exemplo Cys22 e Cys63 e Cys56 e Cys101, que realizam pontes dissulfeto; quanto por questões funcionais, como Pro2, Phe28, Gly35 e Tyr89, que se localizam em sítios alostéricos preditos da cruzaína. A comunidade 2 é composta por 6 resíduos, dentre eles resíduos da díade catalítica, Cys25 e His162, e resíduos Gly23 e Gly65, que coevoluem por questões estruturais. As comunidades 3, 4 e 5 possuem apenas 2 resíduos cada. O resíduo Cys155 da comunidade 3 possui importância estrutural, bem como os resíduos Val13 e Lys181 (comunidade 4) e Gln51 (comunidade 5). Os resíduos da comunidade 5, Leu48 e Gln51 possuem importância funcional e o resíduo Ser55 (comunidade 3) ainda não apresenta sua função descrita na literatura. Também foram encontrados 10 resíduos que são altamente conservados evolutivamente nessa família. Enquanto alguns resíduos, incluindo os que compõem a díade catalítica (Cys25 e His162), são conservados por questões funcionais, outros o são por questões estruturais (Ser49, Gly168, Gly189 e Gly192). Proteins evolve over time, due to the accumulation of mutations, insertions and deletions in the genes that encode them. Highly conserved positions generally refer to residues that are strictly necessary for the structure of the protein or for its function. The DRCN (Decomposition of Residue Coevolution Networks) methodology allows the study of coevolution of residues in protein families. To do this, it consists of five basic steps: filtering the alignment, calculating correlations, decomposing the network, generating auxiliary visualization files and annotating positions by automatic search in UniProt. Cysteine proteases are a large and diverse group of enzymes belonging to the CA clan and the C1 family (papain family) and can be found in all animals and plant kingdoms as well as in many viruses and prokaryotes. The present work aims to analyze and discuss the importance of correlated and conserved residues of the cysteine protease family from the multiple sequence alignment. For this, we use the PFSTATS software, which employs the DRCN methodology. There were 34 correlated residues found in 5 coevoluted communities. Community 1 is the largest community, consisting of 22 residues coevolved by structural issues, such as Cys22 and Cys63 and Cys56 and Cys101, which carry disulfide bridges; as well as for functional issues, such as Pro2, Phe28, Gly35 and Tyr89, which are located in predicted allosteric sites of cruzain. Community 2 is composed of 6 residues, among them residues of the catalytic dyad, Cys25 and His162, and residues Gly23 and Gly65, which coevolve for structural reasons. Communities 3, 4 and 5 have only 2 residues each. The Cys155 residue of community 3 has structural importance, as well as residues Val13 and Lys181 (community 4) and Gln51 (community 5). The residues of community 5, Leu48 and Gln51 have functional importance and the residue Ser55 (community 3) still does not present its function described in the literature. Also 10 residues were found that are highly conserved evolutionarily in this family. While some residues, including those that make up the catalytic dyad (Cys25 and His162), are conserved for functional reasons, others are for structural reasons (Ser49, Gly168, Gly189 and Gly192).

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki Co-orientadora: Dra. Adriana Feliciano Alves Duran Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-graduação em Biossistemas, São Bernardo do Campo, 2019. Cornitermes cumulans é um cupim de montículo muito comum no Brasil que se alimenta de vegetação seca e morta. Os estudos sobre cupins compreendem análises ecológicas, de microbiota e meios de controle biológico devido sua abundância e importância no ecossistema (decomposição e reciclagem de nutrientes). As proteases são importantes enzimas que degradam proteínas de modo que atuam em diversas funções fisiológicas de organismos vivos tais como coagulação sanguínea, respostas imunológicas, digestão, entre outros. Apesar da importância das proteases nos organismos vivos, não existem relatos sobre o estudo destas e de seu papel na espécie de cupim escolhida para análise. Neste trabalho, buscou-se identificar a presença de proteases e inibidores de proteases em extratos proteicos de duas castas de C. cumulans (soldado e operário) de modo a caracterizar estas proteínas e identificar os tecidos predominantes de sua atuação. Os ensaios foram realizados para grupos de amostras dividindo-se os cupins em dois segmentos (cabeça e tórax-abdômen) de forma que a análise e caracterização bioquímica fossem feitas quantitativamente e qualitativamente, por meio de ensaios de atividade enzimática - avaliando proteólise e inibição enzimática de serino proteases, e por meio de géis SDS-PAGE e Zimografias - análise de massa molecular e atividade em gel. Como resultados, obtivemos que tanto a casta de soldados como a de operários apresentam proteases do tipo tripsina e estão presentes inibidores de proteases dos tipos elastase e quimotripsina. Ao caracterizar as proteases presentes verificou-se que estas enzimas atuam em diferentes faixas de pH (pH 6.0 ao pH 10.0), apresentando atividade ótima em pH 10.0, bem como as proteases mantêm suas atividades quando submetidas a aquecimento até 60°C, perdendo as mesmas quando aquecidas acima de 80°C. Analisou-se também as classes de proteases presentes nas amostras ao avaliar a interferência com inibidores específicos de tal forma que se verificou a presença de serino proteases nas amostras torácicas abdominais de soldado e operário, enquanto que nas amostras de cabeça não foi possível distinguir as classes presentes. Por fim, dissecou-se o intestino, dividindo o mesmo em segmentos intestinais (PA, P3 e P4/P5) bem como se coletou a hemolinfa para avaliação da predominância de proteases na porção torácica-abdominal do cupim estudado. Desta análise, verificou-se abundância de proteases no intestino inteiro, especificamente no PA, e na hemolinfa. Deste modo foi possível identificar proteases em cabeça e tórax-abdômen de soldados e operários de cupins da espécie Cornitermes cumulans, além de caracterizarmos as propriedades bioquímicas destas. Cornitermes cumulans is a mound termite very common in Brazil that feeds on dry and dead vegetation. Studies concerning termites include ecological analyzes, microbiota and biological control due to their abundance and importance in the ecosystem (decomposition and nutrients recycling). Proteases are important enzymes that degrade proteins and they act on various physiological functions of living organisms such as blood coagulation, immune responses, and digestion, among others. Despite the importance of proteases in living organisms, there are no reports on the study of these and their role in the termite species chosen for analysis. The aim of this work was to identify the presence of proteases and protease inhibitors in protein extracts of two castes of C. cumulans (soldier and worker) in order to characterize these proteins and identify the predominant tissues of their activity. The assays were performed for groups of samples by dividing the termites into two segments (head and thorax abdomen). The biochemical analysis and characterization were done quantitatively and qualitatively, through enzymatic activity assays - evaluating proteolysis and enzymatic inhibition of serine proteases, and by means of SDS-PAGE gels and Zymographies - molecular weight analysis and gel activity. As results, we found that both the soldier and worker caste presented trypsin-like proteases and protease inhibitors of elastaselike and chymotrypsin-like. In characterizing the present proteases, it was verified that these enzymes act at different pH range (pH 6.0 at pH 10.0), presenting optimal activity at pH 10.0, as well as the proteases maintain their activities when heated up to 60 ° C, losing them when heated above 80 ° C. The classes of proteases present in the samples were also analyzed when evaluating the interference with specific inhibitors in such a way that the presence of serine proteases was observed in the abdominal thoracic samples of soldier and worker. In the head samples it was not possible to distinguish the classes presence. At least, the intestine was dissected and divided into intestinal segments (PA, P3 and P4 / P5) and hemolymph was collected to evaluate the predominance of proteases in the thoracic-abdominal portion of the termite studied. From this analysis, abundance of proteases in the entire intestine, specifically PA and hemolymph, were found. In this way it was possible to identify proteases in the head and thorax abdomen of soldiers and termite workers of the species Cornitermes cumulans, besides characterizing the biochemical properties of these.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cruzaína é a principal cisteíno protease do Trypanosoma cruzi, sendo um alvo validado para o desenvolvimento de fármacos nesse parasito. O T. cruzi é o agente etiológico da doença Chagas, uma doença negligenciada da América Latina. O tratamento dessa doença hoje no Brasil é feito apenas com o Benznidazol, um medicamento com eficácia comprovada apenas na forma aguda da doença e que apresenta uma série de efeitos colaterais que diminuem a adesão ao tratamento. Sendo assim, o desenvolvimento de medicamentos alternativos é imprescindível e o presente trabalho se propõe a fazer uma contribuição nesse sentido. É proposta uma triagem virtual com docking molecular na busca de possíveis inibidores de cruzaína. O diferencial desse trabalho é a inclusão da ideia de seletividade já na etapa de triagem de moléculas. Isso foi incorporado ao se realizar o docking não apenas contra cruzaína, mas também contra duas enzimas homólogas em humanos, catepsinas L e B. Assim, foram selecionados oito compostos que a partir da triagem e de uma análise visual possuem o potencial de serem inibidores de cruzaína seletivos quando comparados a pelo menos uma dessas enzimas. As perspectivas desse trabalho incluem a realização de ensaios enzimáticos para determinar a atividade e a potência das moléculas contra as três enzimas, e havendo um ligante, propor modificações para melhorar sua atividade a seletividade. Cruzain is the major Trypanosoma cruzi cysteine proteinase, a validated target for drug development against this parasite. T. cruzi is the etiological agent of Chagas Disease, a pathological condition from Latin America, considered a neglected disease. Benznidazole is the medicine currently used in the treatment of this disease in Brazil. Its efficacy is proven only in the acute phase of the disease, presenting many side effects which contribute to the treatment abandonment by the patients. Therefore, it is very important to develop alternative drugs, and this work aims to contribute in this sense. To do so, a virtual screening strategy employing molecular docking was proposed to search for possible cruzain inhibitors. A differential aspect of this work was the inclusion of the selectivity idea already in the screening step. This has been incorporated by docking molecules against cruzain, but also against the human homologous enzymes cathepsin L and B. Thereby, after the virtual screening protocol and visual inspection of top scoring compounds, eight hits that might be selective for cruzain were selected. Perspectives include the evaluation of these molecules in enzymatic assays and, if a hit is confirmed, design analogues with improved activity and selectivity.

Orientador: Prof. Dr. Rodrigo L. O. R. Cunha. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, 2017. Nos últimos anos o rol de propriedades biológicas de compostos de selênio e de telúrio tem aumentado e outras atividades, além das bem descritas propriedades antioxidantes, também vêm sendo demonstradas. Neste contexto, a inibição enzimática promovida por espécies hipervalentes de selênio e telúrio (organocalcogenanas) foi relatada para cisteína proteases, tirosina fosfatases e o proteasoma, por exemplo. Esta inibição é resultado da particular reatividade que compostos hipervalentes de telúrio e selênio apresentam com tióis. Como a quantidade de biotióis reativos em sistemas celulares é vasta e nem todos estão disponíveis para ensaios in vitro com as organocalcogenanas, é possível vislumbrar a aplicação desses compostos como ligantes em cromatografia de afinidade para a identificação de proteínas reativas a esses compostos. Para atingir este objetivo foram utilizados organocalcogenetos derivados de benzaldeído. A estrutura dos ligantes é constituída por um grupo fenilcalcogenila ligado a um derivado de poliéter funcionalizado com um grupo amina que é ancorado à uma matriz de agarose. Foram preparadas duas classes de ligantes para a modificação de agarose que diferem na estrutura do espaçador, a primeira contém uma unidade de ácido succínico entre o organocalcogeneto e o derivado de poliéter (ligantes de Classe I) e a outra, isenta dessa unidade de ácido succínico, possui um grupo amino ionizável (ligantes catiônicos de Classe II). A rota de preparação dos ligantes de classe I envolveu uma sequencia sintética de seis etapas com rendimentos globais de 26% e 19% e os ligantes de Classe II foram preparados em uma sequencia de duas etapas com rendimentos globais de 43% e 22%, para os selenetos e teluretos, respectivamente. A oxido-redução do ligante de telúrio da classe II se mostrou rápido e satisfatório nos estudos preliminares, dando bons indícios para aplicação como ligante na cromatografia de afinidade. Por fim, os ligantes foram imobilizados na agarose funcionalizada com brometo de cianogênio e avaliados com papaína, utilizada como modelo de biotiol nesse trabalho. Notadamente os ligantes de telúrio apresentaram um comportamento distinto do que os de selênio quanto à eluição da papaína da matriz sólida, requerendo maior volume de solução com agente redutor para a eluição da proteína. Coletivamente os resultados apresentados nesse trabalho demonstram que matrizes sólidas funcionalizadas com organocalcogenetos são funcionais para a retenção e liberação de biomoléculas tioladas (funcionalidade "catch & release"), abrindo perspectivas para o estudo mais aprofundado da interação entre calcogenetos com tióis e, ainda para produção, caracterização e estudo de aplicações de diversas matrizes funcionalizadas com organocalcogenetos. In recent years the role of biological properties of selenium compounds and tellurium compounds has increased, and other activities besides the well-described antioxidant properties have also been demonstrated. In this context, enzymatic inhibition promoted by hypervalent species of selenium and tellurium have been reported for cysteine proteases and tyrosine phosphatases. This activity is due to the particular reactivity of thiols with the chalcogenides atom in their hypervalent state. Apart from these enzymes, one can envisage a plenty of other potential reactive thiols in cellular systems that are prone to react with organocalcogenuranes which are still unknown. As the identification of these unknown targets would be helpful to understand therapeutical and toxicological aspects of these compounds, efforts in this direction are required. One strategy for this purpose consists in using the affinity purification technique using organochalcogenides as ligands, this is proposed in the present work. To achieve this goal, the use of organochalcogenides derived from benzylamines as ligands in affinity chromatography. The structure of this ligands contains a phenylchalcogenide moiety, a polyether spacer group functionalized with an amino group to attach it to an agarose substrate. Two different spacer classes were prepared, the first has a succinic acid spacer between the organochalcogenide and the polyether (Class I ligand); the second class has the polyether moiety directly linked to the phenylchalcogenide group and has an ionizable secondary amine (Class II cationic ligand). The preparation route of the class I ligands involved a six-step synthetic sequence in overall yields of 26% and 19%, and the Class II ligands were prepared in a two-step sequence in global yields of 43% and 22% of the selenides and tellurides, respectively. The studied oxidation and reduction reactions of Class II tellurium ligands revealed fast processes, suitable for a practical application of these novel organochalcogenides in affinity chromatography. Finally, ligands were immobilized in cyanogen bromide activated agarose and the modified matrices evaluated with papain as a model biothiol. Noteworthy, the selenide ligands released papain promptly by washing the matrix with dithiothreitol solution whereas telluride ligands showed the opposite behavior. Collectively, the results presented in this work demonstrate that organochalcogenide-modified agarose is a new class of functional materials for the retention and release of biothiols presenting a "catch & release" functionality. This work brings new perspectives for a more detailed study of the interaction between chalcogenides with thiols and also to the production, characterization and the study of novel applications of organochalcogenide-modified solid matrices.

ROCHA, A. J. Análise da expressão gênica de proteinases cisteínicas relacionadas à morte celular programada e à maturação de proteínas de reservas em sementes de pinhão manso (Jatropha curcas L.). 2012. 82 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. Jatropha (Jatropha curcas L) is an oilseed plant with great potential for biofuel production because of the wealth of existing lipids in their seeds. Therefore, it is a potential source of renewable oil that has received considerable attention from the scientific community. The objective of this study was to analyze the gene expression of cysteine ​​proteinases related to programmed cell death (PCD) in developing seeds and during germination of Jatropha in order to better understand the transcriptome of the major genes involved in the MCP and during the deposition of protein reserves during maturation of seeds of Jatropha. To accurately quantify the levels of gene expression by RT-qPCR was necessary to make a selection of reference genes (genes constituting). The constituent genes chosen for this study were: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), polyubiquitin (PUB), alpha-tubulin (TA2), protein phosphatase 2 A (PP2A2), elongation factor-alpha (EF1-α) and actin, all cited in the literature and were chosen for study standardization of genes into plants. Through the program of geNorm was possible to show the more stable reference genes among the six genes of reference. Our results indicate that the most stable reference genes for samples of the developing endosperm and integument were: GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2. The genes were less stable: the actina11; polyubiquitin (PUB). In germination, the most stable genes were GAPDH, PUB and TA2. However, genes with lower stability values ​​were actin, EF1-α and PP2A2. In our studies, the geNorm program also showed the number of reference genes needed for normalization of data obtained by RT-qPCR. In the analysis of this study, we show that for the developing seeds, the use of four most stable genes were GAPDH, PP2A2 and EF1-α and TA2 needed for normalization of RT-qPCR data. In the data of germinating seeds, was the adoption of more stable three genes (GAPDH, PUB and TA2). However, To validate our findings with reference genes, we used the standard profile of gene expression which expresses oleosina, which showed that the expression pattern of oleosina is provided according to the literature, genes reveals that the reference are efficient to normalize the data obtained by RT-qPCR. With these results, we carried out a study of expression of genes supposedly involved in programmed cell death and maturation of seeds of Jatropha. Our results showed that genes with sequence C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 and γ-VPE gene JCCB0060111 showed high levels of expression in later stages in tissues of the integument and endosperm of seeds of Jatropha in developing and Based on our analysis, these genes express cysteine ​​proteinases that are possibly involved in the MCP. Nevertheless, genes that express the following VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081, and JcCA0012422 according to our studies, are probably involved in the maturation of protein reserves in developing seeds of Jatropha. These data provided important information about the expression pattern of genes that are involved in the transcriptome of developing seed, more specifically involved in the process of MCP. However, the study of standardization and validation of reference genes in tissues of the integument and endosperm Jatropha provided a better understanding as regards the stability of these genes in the studied conditions. O pinhão manso (Jatropha curcas L) é uma planta oleaginosa com grande potencial para a produção de biocombustível devido à riqueza de lipídios existente em suas sementes. Portanto, é uma fonte potencial de óleo renovável que tem recebido considerável atenção da comunidade científica. O objetivo deste estudo foi fazer uma análise da expressão gênica de proteinases cisteínicas relacionadas à morte celular programada (MCP) em sementes em desenvolvimento e durante a germinação de pinhão manso, no intuito de conhecer melhor o transcriptoma dos principais genes envolvidos no processo de MCP e durante a deposição de proteínas de reservas durante a maturação das sementes de pinhão manso. Para quantificar com acurácia os níveis de expressão gênica por RT-qPCR foi necessário realizar uma seleção de genes de referência (genes constitutivos). Os genes constitutivos escolhidos para esse estudo foram: Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUB), alfa-tubulina (TA2), proteína fosfatase 2-A (PP2A2), fator de alongação-alfa (EF1-α) e actina, todos eles citados e escolhidos na literatura para estudo de normalização de genes em plantas. Através do programa geNorm de foi possível mostrar os genes de referência mais estáveis dentre os seis genes de referência. Nossos resultados apontaram que os genes de referência mais estáveis ​​para as amostras de endosperma e integumento em desenvolvimento foram: GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2. Os genes de menor estabilidade foram: a actina11; poliubiquitina (PUB). Na germinação, os genes mais estáveis foram GAPDH, PUB e TA2. Entretanto, os genes com menores valores de estabilidade foram a actina, EF1-α e PP2A2. Em nossos estudos, o programa geNorm também mostrou o número de genes de referência necessários para a normalização dos dados obtidos por RT-qPCR. Na análise desse estudo, nos mostramos que para as sementes em desenvolvimento, a adoção de quatro genes mais estáveis foram GAPDH, PP2A2 e EF1-α e TA2 necessários para normalização dos dados de RT-qPCR. Nos dados de sementes em germinação, mostrou-se a adoção de três genes mais estáveis ​​(GAPDH, PUB e TA2). Contudo, Para validar nossos resultados com genes de referência, foi usado o perfil padrão da expressão do gene que expressa a oleosina, na qual mostrou que o padrão de expressão da oleosina está de acordo com os fornecidos pela literatura, revelando que os genes de referência são eficientes para normalizar os dados obtidos pela RT-qPCR. De posse desses resultados, realizou-se um estudo de expressão de genes supostamente envolvidos na morte celular programada e na maturação de sementes de pinhão manso. Nossos resultados mostraram que os genes com seqüência C-terminal KDEL: JcCB0580861; JcCA0152821; JcCA0047111 e o gene γ-VPE JCCB0060111 mostraram um altos níveis de expressão nos estágios mais avançados em tecidos do integumento e endosperma em sementes de pinhão manso em desenvolvimento, e com base em nossas análises, esses genes expressam proteinases cisteínicas que estão possivelmente envolvidos no processo de MCP. Não obstante, os genes que expressam as seguintes VPEs: JcCB0196871; JcCB0244081; e JcCA0012422 de acordo com nossos estudos, provavelmente estão envolvidas na maturação das proteínas de reservas de sementes em desenvolvimento de pinhão manso. Esses dados forneceram importantes informações a cerca do padrão de expressão de genes que estão envolvidos no transcriptoma de sementes em desenvolvimento, mais precisamente envolvidos no processo de MCP. Não obstante, o estudo de normalização e validação de genes de referência nos tecidos de integumento e endosperma do pinhão manso propiciaram um melhor entendimento no que diz respeito à estabilidade desses genes nas condições estudadas.