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Rabbit breeding for meat production is based mainly on artificial insemination (AI) programs. In order to obtain many of potential advantages of AI, improvement of the storage of rabbit semen is necessary. Therefore, meat rabbit farming would greatly benefit if semen could be stored after collection and subsequently used for AI without affecting fertility. The rabbit sperm can be stored by refrigeration (in liquid or solid extenders) or freezing. The use of frozen semen would provide more practical advantages for the commercial rabbit industry, as cryopreserved semen could potentially maintain the functionality of the sperm cells for months or even years by facilitating the samples transport in time and space. Cryopreservation has been widely used in the cattle industry, less used in other livestock species, such as pigs, sheep, poultry and rabbit. Therefore, a large number of protocols aimed to cryopreserve the rabbit semen have been developed by many researchers. Each of these protocols has involved in the study of some aspect that can affect the success of the rabbit sperm cryopreservation, such as the composition of the freezing medium, nature of cryoprotectant (CPA) and its concentration, freezing conditions and cooling and warming temperatures. The choice of the CPA is certainly one of the most important aspect for an effective freezing protocol for rabbit semen. The CPAs are chemical compounds included in freezing extenders to reduce the physical and chemical stresses resulting from the cooling, freezing, and thawing of sperm cells. The main biophysical factor that can cause cell destruction during the cryopreservation process is the formation of intracellular ice crystals that can be avoided by increasing the cellular dehydration process, by means of a CPA in the freezing solution. Hence, the addition of the permeable CPAs is a necessary step in the freezing protocol of rabbit sperm, because they minimize cellular injury during cryopreservation. Once CPA has been added to a sperm suspension, a period of time is required for the CPA to permeate the cells. This is called the equilibration time, which varies according to the nature and concentration of the CPA. So the efficacy of the CPAs depends on their type, their concentrations and the exposure time of sperm cells before freezing (equilibration time). Nevertheless, the paradox is that the permeable CPAs themselves could have a toxic effect on sperm (membrane destabilization, protein and enzymes denaturation) related directly to the concentration used and the time of cell exposure. Therefore, it is necessary the addition of a non-permeable cryoprotectant to offset the cryodamage caused by permeable CPA. Different combination of permeable and non-permeable CPAs have been tested for the cryopreservation of rabbit semen, but none of them has given optimal results to consider one of these as the suitable CPA for freezing rabbit semen. Therefore the process of rabbit sperm cryopreservation still suffers for a lack of standardized freezing protocols. In this thesis were conducted three different researches, that have as common denominator to find an effective freezing protocol for rabbit semen, by studying of the effects of different permeable and non-permeable CPAs. The first study was designed to identify a suitable freezing protocol for rabbit semen by comparing the effects of different CPA concentrations and equilibration times of dimethylacetamide (DMA) and dimethylsulfoxide (DMSO) on the semen post-thaw quality. After establishing the best protocols for each CPA, their efficacy was compared by examining the in vivo fertilizing capacity of the semen samples. The animals used for this study, were 32 rabbit bucks and 342 does. Semen was collected using an artificial vagina and the ejaculates were pooled (4 ejaculates/pool). Pooled semen samples were diluted to a ratio 1:1 (v:v) with a freezing medium composed of Tris-citrate-glucose (TCG) containing 8, 12, or 16% DMA or DMSO (all combined with 2% sucrose as a non-permeating CPA) to give final concentrations of 1% sucrose and 4%, 6% or 8% DMA or DMSO. The diluted semen was loaded in 0.25 mL plastic straws and equilibrated for 5, 15 or 45 min before freezing in liquid nitrogen vapor (5 cm above the liquid nitrogen surface). The variables assessed after thawing were sperm motility, viability, osmotic-resistance, and acrosome and DNA integrity. Marked effects on these variables were shown by the CPA concentration and equilibration time, with best results obtained using DMA 6% or DMSO 8% and equilibration times of 45 minutes. These freezing protocols were selected to compare the two CPAs in an insemination trial. Three groups of 114 rabbit does (28 nulliparous and 86 multiparous in each group), were inseminated with fresh semen or with semen frozen using the optimized DMA or DMSO protocols. Conception rates and numbers of total born were similar respectively for the DMSO-frozen (79.8% and 7.7±0.3 young per kindling) and fresh semen (81.6% and 8.6±0.3) yet higher (P≤0.05) than the rates returned using the DMA-frozen semen (47.4% and 6.7±0.4). Moreover, the numbers of rabbits born alive when DMSO was used in the freezing protocol, despite being lower than those recorded using fresh semen, were higher than when DMA was used as the CPA (P < 0.05). The physiological status of the does (nulliparous or multiparous) had no influence on the fertility and prolificacy results. Our findings indicate that the cryosurvival of rabbit sperm frozen using DMSO or DMA as the CPA is highly influenced by the concentration of CPA used and the time the semen is exposed to the agent before freezing. According to our in vivo fertility and prolificacy data, DMSO emerged as more effective than DMA for the cryopreservation of rabbit sperm. The second study was designed to identify the most effective non-permeable CPA for the cryopreservation of rabbit semen by comparing the effects of different concentrations of low-density lipoproteins (LDL) on post-thaw sperm quality with those of whole egg yolk or sucrose. The performance of the non-permeable CPAs identified as the most effective was assessed in vivo by determining fertility and prolificacy rates. In this study 32 rabbit bucks and 90 does were used. Pooled semen samples were diluted to a ratio of 1:1 (v:v) in freezing extender (TCG and 16% DMSO as permeable CPA) containing as non-permeable CPAs 6, 8, 10 or 15% LDL from egg yolk, 0.1 M sucrose, or 15% egg yolk. The semen was loaded in 0.25 mL straws and frozen in liquid nitrogen vapor. After thawing, we determined sperm motility, viability, osmotic resistance, and acrosome and DNA integrity. Our results clearly revealed a significant effect of LDL concentration on semen quality. Also, at an optimal concentration of 10%, motility and acrosome integrity were improved over the values recorded for egg yolk (P 80%) were used in these experiments. Heterospermic pools were diluted in a freezing medium composed of commercial diluent, 16% DMSO and 2% sucrose (control) or in the same medium enriched with 4% of Ficoll 70 (Ficoll) and frozen in liquid nitrogen vapours for 10 min before being plunged into liquid nitrogen. The quality of fresh and frozen/thawed spermatozoa samples was evaluated in vitro using Computer Assisted Semen Analysis (CASA) system, fluorescent probes (peanut agglutinin (PNA)-Alexa Fluor®; annexin V-Fluos) and by electron microscopy. Better cryoprotective effect was observed when the Ficoll 70 was added, compared to the semen cryopreserved with sucrose and DMSO only. The higher values (P˂0.05) of motile and progressively moving spermatozoa immediately after thawing and at 30 min following incubation at 37°C were obtained in the Ficoll group. Moreover, the higher number (P˂0.05) of acrosome intact sperm was found in the Ficoll compared to control group. Furthermore, no significant differences in kindling rates and number of pups born between frozen/thawed and fresh semen group were found. In conclusion, this study showed that the addition of the Ficoll 70 might improve several characteristic of rabbit spermatozoa measured in vitro following freezing/thawing. These researches were important because we have been able to find effective cryopreservation protocols, that showed similar reproductive performances compared to use of fresh semen. These findings provide direction for future studies designed to address the possibility of using doses of frozen semen for the artificial insemination of rabbits in commercial farms. Moreover, the use of frozen semen will be attractive to the establishment of a gene bank from national or endangered rabbit breeds as gene resources. Attualmente, i sistemi di allevamento intensivi per la produzione di carne di coniglio si basano principalmente su programmi di inseminazione artificiale (IA). Pertanto, l’allevamento intensivo del coniglio da carne potrebbe usufruire di molti vantaggi se il seme potesse essere conservato dopo la raccolta e successivamente utilizzato per l’IA senza compromettere la fertilità. Due sono le tecnologie disponibili per la conservazione del seme di coniglio: la refrigerazione (in diluenti liquidi o solidi) e il congelamento. L'uso di seme congelato fornirebbe vantaggi più pratici per l'allevamento del coniglio da carne, in quanto, esso potrebbe potenzialmente mantenere la funzionalità delle cellule spermatiche per mesi o anni, facilitando il trasporto dei campioni nel tempo e nello spazio. La crioconservazione del seme è stata ampiamente utilizzata nel settore bovino, meno in altre specie animali, come i suini, ovini, polli e conigli. Pertanto, un gran numero di protocolli di congelamento per il seme di coniglio sono stati sviluppati da molti ricercatori. Diversi sono i fattori che possono influenzare il successo del congelamento del seme, quali la composizione del diluente di congelamento, la natura del crioprotettore (CPA) e la sua concentrazione, le condizioni di congelamento, e le temperature di raffreddamento e scongelamento. La scelta del CPA è sicuramente uno degli aspetti più importanti per ottenere un efficace protocollo di congelamento per il seme di coniglio. I CPA sono molecole, che vengono aggiunte nel diluente di congelamento, per ridurre gli stress fisici e chimici derivanti dal raffreddamento, congelamento e scongelamento degli spermatozoi. Infatti, il principale fattore biofisico che può causare la distruzione cellulare, durante il processo di crioconservazione, è la formazione dei cristalli di ghiaccio intracellulari. La loro formazione può essere evitata aumentando il processo di disidratazione cellulare, mediante l’aggiunta di un CPA nella soluzione di congelamento. Il CPA richiede un periodo di tempo necessario affinché esso penetri nello spermatozoo. Questo tempo è definito tempo di equilibratura, che varia in funzione della natura e della concentrazione del CPA. Quindi l'efficacia di un CPA dipende dalla natura chimica, dalla concentrazione e dal tempo ottimale con cui le cellule spermatiche si espongono ad esso prima del congelamento. Tuttavia, il paradosso è che i CPA permeabili potrebbero avere un effetto tossico sugli spermatozoi (causando la destabilizzazione della membrana e/o la denaturazione delle proteine e degli enzimi). Quest’effetto tossico dipende dalla concentrazione del CPA utilizzata e il tempo di esposizione delle cellule spermatiche con esso. Pertanto, per mitigare questi effetti tossici, è necessaria l'aggiunta di un CPA non-permeabile. Per la crioconservazione del seme di coniglio sebbene, siano stati studiati diversi CPA permeabili e non-permeabili, nessuno di essi ha riportato risultati soddisfacenti. Pertanto il congelamento del seme di coniglio è ancora carente di uno specifico ed efficace protocollo. In questa tesi sono state condotte tre ricerche, che hanno avuto come comune denominatore quello di trovare un protocollo di congelamento efficace per il seme di coniglio, studiando gli effetti di diversi CPA permeabili e non-permeabili. Il primo studio ha avuto come scopo quello di identificare un protocollo di congelamento adatto per il seme di coniglio confrontando gli effetti di diverse concentrazioni di due CPA permeabili (dimetilacetammide (DMA) e dimetilsolfossido (DMSO)) e diversi tempi di equilibratura sulla qualità post-scongelamento del seme. Dopo aver stabilito i migliori protocolli per ogni CPA, la loro efficacia è stata confrontata in vivo, esaminando la capacità fertilizzante del seme congelato con quello fresco. In questa ricerca sono stati utilizzati 32 maschi e 342 femmine. Il seme è stato raccolto mediante una vagina artificiale e costituiti pool di seme (4 eiaculati/pool). I pool sono stati diluiti nel rapporto 1:1 (v:v), con un diluente di congelamento composto da TCG (Tris-acido citrico-glucosio) contenente l’8, il 12 o il 16% di DMA o DMSO, rispettivamente (tutti contenenti il 2% di saccarosio come CPA non-permeabile), ottenendo una concentrazione finale del 4, 6 o 8% di DMA o DMSO, e l’1% di saccarosio. Il seme diluito è stato aspirato in straws da 0.25 mL. Le straws sono state equilibrate a 5°C per 5, 15 o 45 minuti prima di essere congelate sui vapori di azoto (a 5 cm dal livello di azoto). Le variabili valutate dopo lo scongelamento sono state: motilità, vitalità, resistenza osmotica, integrità acrosomiale e integrità del DNA. La concentrazione del CPA e il tempo di equilibratura hanno influenzato le variabili considerate. I migliori risultati sulla qualità post-scongelamento sono stati ottenuti utilizzando il 6% di DMA o l’8% di DMSO e un tempo di equilibratura di 45 minuti. Questi protocolli di congelamento sono stati selezionati per comparare i due CPA in una prova di inseminazione artificiale. Tre gruppi da 114 coniglie (28 nullipare e 86 pluripare in ciascun gruppo) sono state inseminate con seme fresco e seme congelato utilizzando i due migliori protocolli. Il tasso di concepimento e il numero di coniglietti nati sono stati simili tra il seme congelato con il DMSO (79.8% e 7.7±0.3) e il seme fresco (81.6% e 8.6±0.3) e sono stati significativamente più alti rispetto al seme congelato utilizzando la DMA (47.4% e 6.7±0.4). Inoltre, il numero di coniglietti nati vivi ottenuti da seme congelato con DMSO, pur essendo inferiore rispetto a quello registrato con il seme fresco, è stato più alto rispetto a quello ottenuto utilizzando la DMA (P80%). I pool di seme sono stati diluiti con i seguenti medium di congelamento: 1) diluente commerciale (DMRS; Minitube, Germany) contenente il 16% di DMSO e il 2% di saccarosio (controllo), 2) Minitube contenente il 16% di DMSO, il 2% di saccarosio e il 4% di Ficoll 70 (Ficoll). Il seme diluito è stato aspirato in straws da 0.25 mL e congelato sui vapori di azoto liquido. La qualità del seme fresco e scongelato è stata valutata in vitro usando il Computer Assisted Semen Analysis system (CASA), sonde fluorescenti (peanut agglutinin (PNA)-Alexa Fluor®; annexin V-FLOUS) e mediante microscopia elettronica. Un migliore effetto crioprotettivo è stato osservato dopo l’aggiunta del Ficoll 70 rispetto al seme congelato con il solo saccarosio e DMSO. I maggiori valori (P