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Objective: Protein phosphatases, e.g., PTP1B, are crucial for regulating the activity of protein tyrosine kinases, e.g., the EGFR. Since most EGFR targeted therapies did not show a significant increase in progression-free survival and overall survival, novel ways of inhibiting tumor-promoting pathways, [for full text, please go to the a.m. URL]

Scientific reports 9(1), 19961 (2019). doi:10.1038/s41598-019-56509-5, Published by Macmillan Publishers Limited, part of Springer Nature, [London]

Background Glioblastoma (GBM) is a tumor of the central nervous system. After surgical removal and standard therapy, recurrence of tumors is observed within 6–9 months because of the high migratory behavior and the infiltrative growth of cells. Here, we investigated whether carnosine (β-alanine-l-histidine), which has an inhibitory effect on glioblastoma proliferation, may on the opposite promote invasion as proposed by the so-called “go-or-grow concept”. Methods Cell viability of nine patient derived primary (isocitrate dehydrogenase wildtype; IDH1R132H non mutant) glioblastoma cell cultures and of eleven patient derived fibroblast cultures was determined by measuring ATP in cell lysates and dehydrogenase activity after incubation with 0, 50 or 75 mM carnosine for 48 h. Using the glioblastoma cell line T98G, patient derived glioblastoma cells and fibroblasts, a co-culture model was developed using 12 well plates and cloning rings, placing glioblastoma cells inside and fibroblasts outside the ring. After cultivation in the presence of carnosine, the number of colonies and the size of the tumor cell occupied area were determined. Results In 48 h single cultures of fibroblasts and tumor cells, 50 and 75 mM carnosine reduced ATP in cell lysates and dehydrogenase activity when compared to the corresponding untreated control cells. Co-culture experiments revealed that after 4 week exposure to carnosine the number of T98G tumor cell colonies within the fibroblast layer and the area occupied by tumor cells was reduced with increasing concentrations of carnosine. Although primary cultured tumor cells did not form colonies in the absence of carnosine, they were eliminated from the co-culture by cell death and did not build colonies under the influence of carnosine, whereas fibroblasts survived and were healthy. Conclusions Our results demonstrate that the anti-proliferative effect of carnosine is not accompanied by an induction of cell migration. Instead, the dipeptide is able to prevent colony formation and selectively eliminates tumor cells in a co-culture with fibroblasts. Electronic supplementary material The online version of this article (10.1186/s12935-018-0611-2) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Objectives Carnosine (β‐alanyl‐l‐histidine) is a naturally occurring dipeptide that selectively inhibits cancer cell growth, possibly by influencing glucose metabolism. As its precise mode of action and its primary targets are unknown, we analysed carnosine's effect on metabolites and pathways in glioblastoma cells. Materials and methods Glioblastoma cells, U87, T98G and LN229, were treated with carnosine, and metabolites were analysed by gas chromatography coupled with mass spectrometry. Furthermore, mitochondrial ATP production was determined by extracellular flux analysis and reaction products of carnosine were investigated using mass spectrometry. Results Carnosine decreased the intracellular abundance of several metabolites indicating a reduced activity of the pentose phosphate pathway, the malate‐aspartate shuttle and the glycerol phosphate shuttle. Mitochondrial respiration was reduced in U87 and T98G but not in LN229 cells, independent of whether glucose or pyruvate was used as substrate. Finally, we demonstrate non‐enzymatic reaction of carnosine with dihydroxyacetone phosphate and glyceraldehyde‐3‐phosphate. However, glycolytic flux from glucose to l‐lactate appeared not to be affected by the reaction of carnosine with the metabolites. Conclusions Carnosine reacts non‐enzymatically with glycolytic intermediates reducing the activity of the pentose phosphate pathway which is required for cell proliferation. Although the activity of the malate‐aspartate and the glycerol phosphate shuttle appear to be affected, reduced mitochondrial ATP production under the influence of the dipeptide is cell‐specific and appears to be independent of the effect on the shuttles.

Objective: Despite ongoing research, glioblastoma (GBM) still has a poor prognosis even under standard therapy, combining surgery, temozolomide (TMZ) and irradiation (Rx). It was demonstrated before that the dipeptide carnosine (β-alanyl-L-histidine; Car) not only reduces growth, migration and[for full text, please go to the a.m. URL], 70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC), Joint Meeting mit der Skandinavischen Gesellschaft für Neurochirurgie

Objective: Carnosine, a dipeptide composed of beta-alanine and L-histidine has anti-neoplastic effects as demonstrated in different tumor models including glioblastoma cell culture. Although its molecular targets are unknown, it has been demonstrated that carnosine induces mRNA expression of pyruvate[for full text, please go to the a.m. URL], 69. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC), Joint Meeting mit der Mexikanischen und Kolumbianischen Gesellschaft für Neurochirurgie

Objective: Despite ongoing research efforts, glioblastoma (GBM) still has a poor prognosis even under standard therapy, combining temozolomide (Tmz) and irradiation (Rx). Here, we investigated whether the dipeptide carnosine (β-alanine-L-histidine; Car), which reduces growth, migration and metastasis[for full text, please go to the a.m. URL], 69. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC), Joint Meeting mit der Mexikanischen und Kolumbianischen Gesellschaft für Neurochirurgie

Additional file 1: Table S1. Patients and patient derived cell cultures.

Expression of SATB2 in various glioblastoma cell lines, as determined on the mRNA level by qRT-PCR. (PDF 4 kb)

Stem cells display a fundamentally different mechanism of proliferation control when compared to somatic cells. Uncovering these mechanisms would maximize the impact in drug discovery with a higher translational applicability. The unbiased approach used in phenotype-based drug discovery (PDD) programs can offer a unique opportunity to identify such novel biological phenomenon. Here, we describe an integrated phenotypic screening approach, employing a combination of in vitro and in vivo PDD models to identify a small molecule increasing stem cell proliferation. We demonstrate that a combination of both in vitro and in vivo screening models improves hit identification and reproducibility of effects across various PDD models. Using cell viability and colony size phenotype measurement we characterize the structure activity relationship of the lead molecule, and identify that the small molecule inhibits phosphorylation of ERK2 and promotes stem cell proliferation. This study demonstrates a PDD approach that employs combinatorial models to identify compounds promoting stem cell proliferation.

Expression of SATB2 in various glioblastoma cell lines, as determined on the mRNA level by qRT-PCR. (PDF 4 kb)

Primary and secondary antibodies used for Western blotting in this study, and the specifications of the buffers used for dilution. (PDF 11 kb)

siRNA-mediated SATB1 knockdown and tumor cell inhibition. (A) SATB1 knockdown upon transfection of SATB1-specific siRNAs si467 or si989 in U343 and MZ-18 glioblastoma cells, as determined on mRNA level (n = 2–3 experiments performed in duplicates and analyzed 72 after transfection). Actin was used as loading control. (B) Marked inhibition of anchorage-dependent proliferation, particularly when using the more potent si467. (PDF 14 kb)

siRNA-mediated SATB1 knockdown and tumor cell inhibition. (A) SATB1 knockdown upon transfection of SATB1-specific siRNAs si467 or si989 in U343 and MZ-18 glioblastoma cells, as determined on mRNA level (n = 2–3 experiments performed in duplicates and analyzed 72 after transfection). Actin was used as loading control. (B) Marked inhibition of anchorage-dependent proliferation, particularly when using the more potent si467. (PDF 14 kb)

Background The Special AT-rich Sequence Binding Protein 1 (SATB1) regulates the expression of many genes by acting as a global chromatin organizer. While in many tumor entities SATB1 overexpression has been observed and connected to pro-tumorigenic processes, somewhat contradictory evidence exists in brain tumors with regard to SATB1 overexpression in glioblastoma and its association with poorer prognosis and tumor progression. On the functional side, initial data indicate that SATB1 may be involved in several tumor cell-relevant processes. Methods For the detailed analysis of the functional relevance and possible therapeutic potential of SATB1 inhibition, we employ transient siRNA-mediated knockdown and comprehensively analyze the cellular and molecular role of SATB1 in glioblastoma. Results In various cell lines with different SATB1 expression levels, a SATB1 gene dose-dependent inhibition of anchorage-dependent and –independent proliferation is observed. This is due to cell cycle-inhibitory and pro-apoptotic effects of SATB1 knockdown. Molecular analyses reveal SATB1 knockdown effects on multiple important (proto-) oncogenes, including Myc, Bcl-2, Pim-1, EGFR, β-catenin and Survivin. Molecules involved in cell cycle, EMT and cell adhesion are affected as well. The putative therapeutic relevance of SATB1 inhibition is further supported in an in vivo tumor xenograft mouse model, where the treatment with polymeric nanoparticles containing SATB1-specific siRNAs exerts antitumor effects. Conclusion Our results demonstrate that SATB1 may represent a promising target molecule in glioblastoma therapy whose inhibition or knockdown affects multiple crucial pathways. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1186/s12885-016-3006-6) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Sequences of siRNAs used in this study. (PDF 4 kb)

SATB1 mRNA levels in normal brain tissue versus primary glioblastoma tissue and primary cell lines derived thereof, and established cell lines. Expression levels were determined by qRT-PCR. Denominations of the primary material on the x-axis refer to patientsâ IDs. (PDF 12 kb)

Primary and secondary antibodies used for Western blotting in this study, and the specifications of the buffers used for dilution. (PDF 11 kb)

SATB1 mRNA levels in normal brain tissue versus primary glioblastoma tissue and primary cell lines derived thereof, and established cell lines. Expression levels were determined by qRT-PCR. Denominations of the primary material on the x-axis refer to patientsâ IDs. (PDF 12 kb)

Primers used in this study. (PDF 12 kb)

Primers used in this study. (PDF 12 kb)

Objective: Tumor cell metabolism is dependent on the conversion of glucose to lactate even under aerobic conditions. This phenomenon, first described by Otto Warburg, is known as aerobic glycolysis and has been discussed as a possible Achilles heel for decades. After the discovery that the naturally[for full text, please go to the a.m. URL], 67. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC), 1. Joint Meeting mit der Koreanischen Gesellschaft für Neurochirurgie (KNS)

Methods. (DOCX 16Â kb)

Objective: Carnosine (beta-alanyl-L-histidine) is a naturally occurring dipeptide that exhibits anti-neoplastic effects in cell cultures derived from glioblastoma (GBM) as well as in animal models. Previous studies indicated that the anti-proliferative effect of carnosine is accompanied by a reduction[for full text, please go to the a.m. URL], 65. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC)

Cells : open access journal 9(2), (2020). doi:10.3390/cells9020452

Background: Tumor cells are highly dependent on glucose even in the presence of oxygen. This concept called the Warburg effect is a hallmark of cancer and strategies are considered to therapeutically exploit the phenomenon such as ketogenic diets. The success of such strategies is dependent on a profound understanding of tumor cell metabolism. With new techniques it is now possible to thoroughly analyze the metabolic responses to the withdrawal of substrates and their substitution by others. In the present study we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to analyze how glioblastoma brain tumor cells respond metabolically when glucose is withdrawn and substituted by pyruvate. Methods: Glioblastoma brain tumor cells were cultivated in medium with high (25 mM), medium (11 mM) or low (5.5 mM) glucose concentration or with pyruvate (5 mM). After 24 h GC-MS metabolite profiling was performed. Results: The abundances of most metabolites were dependent on the supply of glucose in tendency but not in a linear manner indicating saturation at high glucose. Noteworthy, a high level of sorbitol production and release was observed at high concentrations of glucose and high release of alanine, aspartate and citrate were observed when glucose was substituted by pyruvate. Intermediates of the TCA cycle were present under all nutritional conditions and evidence was found that cells may perform gluconeogenesis from pyruvate. Conclusions: Our experiments reveal a high plasticity of glioblastoma cells to changes in nutritional supply which has to be taken into account in clinical trials in which specific diets are considered for therapy.

Calcium (Ca2+) is a universal second messenger involved in synaptogenesis and cell survival; consequently, its regulation is important for neurons. ATPase plasma membrane Ca2+ transporting 1 (ATP2B1) belongs to the family of ATP-driven calmodulin-dependent Ca2+ pumps that participate in the regulation of intracellular free Ca2+. Here, we clinically describe a cohort of 12 unrelated individuals with variants in ATP2B1 and an overlapping phenotype of mild to moderate global development delay. Additional common symptoms include autism, seizures, and distal limb abnormalities. Nine probands harbor missense variants, seven of which were in specific functional domains, and three individuals have nonsense variants. 3D structural protein modeling suggested that the variants have a destabilizing effect on the protein. We performed Ca2+ imaging after introducing all nine missense variants in transfected HEK293 cells and showed that all variants lead to a significant decrease in Ca2+ export capacity compared with the wild-type construct, thus proving their pathogenicity. Furthermore, we observed for the same variant set an incorrect intracellular localization of ATP2B1. The genetic findings and the overlapping phenotype of the probands as well as the functional analyses imply that de novo variants in ATP2B1 lead to a monogenic form of neurodevelopmental disorder.

Die Dysregulation von Neurotransmittersystemen spielt eine wesentliche Rolle für die Pathophysiologie des Bladder Pain Syndrom/Interstitielle Zystitis (BPS/IC). Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit der veränderten Expression muskarinerger (M2, M3) und purinerger (P2X1, P2X2, P2X3) Rezeptoren auf Urothelzellen und suburothelialen Myofibroblasten der Harnblasenwand im Rahmen BPS/IC. Dazu wurde eine Gruppe von Patientinnen mit Verdacht auf BPS/IC (n=17) einer Kontrollgruppe (n=7) gegenübergestellt. Die Gewebeproben der Patientengruppe sind im Zuge der Basisdiagnostik (transurethrales Harnblasenmapping) bei klinischem Verdacht auf das Vorliegen eines BPS/IC entnommen worden. Das Gewebe der Kontrollgruppe entstammt makroskopisch unauffälligen Bereichen von Harnblasen, welche im Rahmen einer radikalen Zystektomie oder einer lateral erweiterten endopelvinen Resektion (LEER-OP) entnommen worden sind. Die semi-quantitative Analyse der Rezeptorexpression erfolgte mittels indirekter Immunfluoreszenz, die Auswertung erfolgte mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie. Die Ergebnisse der Patientengruppe wurden mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Im Rahmen dessen wurde auch ein individuelles Rezeptorprofil für jeden Patienten erstellt. Es zeigte sich eine Hochregulation von M2R, M3R und P2X1R auf Urothelzellen sowie eine Hochregulation von M2R, M3R, P2X1R und P2X2R auf suburothelialen Myofibroblasten in der BPS/IC-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Des Weiteren zeigten sich individuelle Unterschiede in den Rezeptorprofilen der Patienten. Die Ergebnisse werden vor dem Hintergrund einer möglichen Beteiligung der Regulation von muskarinergen und purinergen Rezeptoren an der Pathophysiologie des BPS/IC diskutiert. Ferner werden diagnostische und therapeutische Möglichkeiten einer erweiterten Mollekulardiagnostik diskutiert.:Bibliografische Angaben 4 Abkürzungsverzeichnis 6 1. Einleitung 8 1.1. Das Bladder Pain Syndrom 8 1.1.1. Definition 8 1.1.2. Epidemiologie 10 1.1.3. Ätiologie und Pathophysiologie 10 1.1.4. Diagnostik 13 1.1.5. Therapie 16 1.2. Anatomische und physiologische Grundlagen 20 1.2.1. Das Urothel 21 1.2.2. Lamina propria 22 1.2.3. Muskarinerge Acetylcholinrezeptoren 23 1.2.4. Purinerge Rezeptoren 27 1.3. Fragestellung und Zielsetzung 31 2. Material und Methoden 32 2.1. Material 32 2.2. Methoden 33 2.2.1. Immunhistologie 33 2.2.2. Konfokale Laserscanning Mikroskopie und Auswertung 33 3. Ergebnisse 37 3.1. Lichtmikroskopie 37 3.2. Laserscanningmikroskopie 40 3.2.1. Rezeptorexpression im Urothel 40 3.2.2. Statistischer Vergleich von Kontroll-und BPS/IC-Gruppe im Urothel 42 3.2.4. Statistischer Vergleich von Kontroll-und BPS/IC-Gruppe auf sMF 46 3.2.5. Rezeptorprofile von Urothelzellen und sMF 47 3.3. Zusammenfassung 52 4. Diskussion 53 4.1. Diagnostisches Dilemma 53 4.2. Rezeptorverteilung im Urothel 61 4.3. Rezeptorverteilung auf sMF 64 4.4. Diagnostische und therapeutische Möglichkeiten des Rezeptorprofiling 65 4.5. Methodik der vorliegenden Arbeit 69 4.7. Zusammenfassung 71 Anhang 73 Referenzen 75 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 84 Lebenslauf: 85 Danksagung: 86

Die Arbeit behandelt die Ergebnisse von Experimenten über die Wirkung des Dipeptides Carnosin (β Alanyl L Histidin) und der Aminosäuren L Histidin und β-Alanin auf Kulturen der humanen Zellreihen U87, T98G und LN405, welche von Zellen des malignen Hirntumors Glioblastoma multiforme abgeleitet sind. Die Vitalität der Zellen nach Inkubation mit Carnosin oder L Histidin wurde anhand der Adenosintriphosphatproduktion und der Dehydrohenaseaktivität für Inkubationszeiträume von 24, 48 und 72 Stunden bestimmt. Dabei zeigte sich eine signifikant niedrigere Vitalität der mit Carnosin oder L Histidin inkubierten Zellen gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Dieser Effekt war bei L Histidin stärker ausgeprägt. Bei Messungen der Lakatdehydrogenaseaktivität im Medium der Zellen, welche als Indikator für Zellnekrosen diente, zeigten nur die mit L Histidin inkubierte Zellen Zeichen von Nekrose. Die gleichen Messungen wurden auch an humanen embryonalen Nierenzellen durchgeführt (HEK 293), wobei sich ein ähnliches Ergebnis feststellen ließ. In den drei Zellreihen wurde zudem mittels qRT-PCR die mRNA-Expression für die beiden Enzyme Carnosinase 1 und Carnosinase 2 bestimmt, welche L Histidin von Carnosin abspalten. Im Vergleich mit Proben aus normalem Hirngewebe war die Expression beider Enzyme in den Glioblastomzellen deutlich geringer, wenngleich nachweisbar. Nachdem vorhergehende Studien [8] einen Anstieg der Expression von mRNA der Pyruvatdehydrogenasekinase 4 (PDK4) in mit Carnosin inkubierten Glioblastomzellen gezeigt hatten, wurde dieser Effekt hier auch mittels qRT-PCR in mit L Histidin inkubierten Zellen nachgewiesen. Eine Wirkung von Carnosin oder L Histidin auf ein Reportergen des PDK4-Promoters wurde ebenfalls untersucht, wobei sich kein signifikanter Effekt nachweisen ließ.:Table of contents Bibliographische Beschreibung I List of Abbreviations II List of Figures IV List of Tables V 1 Introduction 1 1.1 Overview 1 1.2 Glioblastoma 1 1.3 Carnosine 4 1.4 Histidine 8 1.5 Human pyruvate dehydrogenase kinase 4 gene and enzyme 9 2 Objectives of the study 12 3 Materials and Methods 13 3.1 Materials 13 3.1.1 Cell lines 13 3.1.2 Primers 13 3.1.3 Plasmids 14 3.1.4 cDNA of normal brain tissue 14 3.1.5 Solutions and buffers 14 3.1.6 Enzymes and kits 15 3.1.7 Media 16 3.1.8 Ready-made chemicals 17 3.1.9 Instruments 18 3.1.10 Software 19 3.1.11 Consumables 20 3.2 General microbiological and cytological methods 21 3.2.1 Production of competent E. coli 21 3.2.2 Transformation of RbCl-competent E. coli 21 3.2.3 Preparation of plasmid DNA from cultures of transformed E. coli 22 3.2.4 Cell culture conditions for human cell lines 22 3.3 Assay methods and protocols 24 3.3.1 Transfections and reporter gene assays 24 3.3.2 mRNA-isolation and qRT-PCR 25 3.3.3 Cell viability assays 26 3.4 Construction of the reporter gene (-3968/+319)_PDK4_GauIII 27 3.5 Statistical analysis 28 4 Results 29 4.1 Cell viability of glioblastoma cells under the influence of carnosine, L histidine and β-alanine 29 4.1.1 ATP production under the influence of carnosine, L histidine and β alanine 29 4.1.2 Dehydrogenase activity under the influence of carnosine, L histidine and β alanine 34 4.1.3 Lactate dehydrogenase activity and necrotic cell death under the influence of carnosine, L histidine and β alanine 38 4.1.4 Concentration dependence of viability decrease under the influence of carnosine and L histidine 42 4.1.5 Effect of carnosine and β-alanine on viability of HEK 293 cells 44 4.2 Carnosinase mRNA expression 46 4.3 PDK4-mRNA expression under the influence of L-histidine 48 4.3.1 Enhancement of PDK4-mRNA-expression under the influence of L histidine 48 4.3.2 Development of L-histidine-mediated PDK4-mRNA increase over time 51 4.4 Reporter gene assays 54 5 Discussion 60 5.1 Conclusions 60 5.2 Outlook and suggestions for further research 63 6 Summary 65 7 Literature 68 8 Appendix - Optimization of transfection conditions for U87 cells 74

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist der am häufigsten vorkommende maligne Hirntumor mit äußerst ungünstiger Prognose für die betroffenen Patienten. Typisch für die Tumore ist eine hohe Aktivität der Glykolyse zur Generierung von ATP und zur Bereitstellung von Makromolekülen für die Zellproliferation, während die oxidative Phosphorylierung auch in Gegenwart von Sauerstoff praktisch keine Bedeutung für die Generation von ATP hat, was auch als Warburg Effekt bekannt ist. Das natürlich vorkommende Carnosin (β-Alanyl-LHistidin) wirkt sich antiproliferativ auf Tumorzellen aus, was mit einer Inhibition der glykolytischen ATP Produktion einhergeht. Der Mechanismus der Inhibition ist weitgehend unverstanden und ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Im Rahmen der durchgeführten Arbeit wurde der Einfluss von Carnosin auf die mRNA Expressionen von für die Glykolyse relevanten Genen untersucht, wobei eine starke Induktion der Pyruvatdehydrogenase Kinase (PDK) 4 in drei GBM Zelllinien beobachtet wurde. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass L-Histidin den gleichen Effekt wie Carnosin zeigt, nicht jedoch β-Alanin, L-Alanin oder L-Alanyl-L-Histidin. Da Tumorzellen die intrazelluläre Gewebscarnosinase aber kaum die extrazelluläre Serumcarnosinase exprimieren, liegt die Vermutung nahe, dass die antineoplastische Wirkung des Carnosins auf die enzymatische Spaltung von Carnosin und die daraus resultierende Freisetzung von L-Histidin zurückzuführen ist. In weiteren Untersuchungen wurden Hinweise erbracht, dass Carnosin durch eine Beeinflussung von Histon-Deacetylasen, die endogene PDK4 mRNA Expression steigern könnte. Zusätzlich wurden die Proteinexpressionen der PDK1 und 4 unter dem Einfluss von Carnosin untersucht.

Das Nierenzellkarzinom ist in Europa die 10. häufigste Tumorerkrankung [1]. Da das Prädi- lektionsalter bei 62 Jahren liegt [2] und die Inzidenz mit steigendem Alter zunimmt, geht die Erkrankung häufig mit einer Vielzahl an Komorbiditäten einher. Dies fordert eine Auseinan- dersetzung mit der Anwendung minimal invasiver Methoden, die das operative Risiko mini- mieren. Immernoch wird die Therapie durch radikale Nephrektomie favorisiert. Ziel der Stu- die war es deshalb Entscheidungshilfen für die Anwendung der Radiofrequenzablation (RFA) zu liefern. Daher untersuchten wir an Hausschweinen technische Einflussgrößen auf Behandlungszeit, Ablationsvolumen und Läsionsform bei bipolarer und multipolarer RFA im Vergleich. Dabei ergaben sich nach 3-D-Rekonstruktion größere Ablationsvolumina im mul- tipolaren Modus, wobei sich signifikante Formunterschiede in beiden Anwendungen heraus- kristallisierten. Bei multipolarer RFA ergaben sich größere Inhomogenitäten. Die Ablation kleinerer Tumorgrößen unter 2 cm erscheint mit bipolarer RFA sicher. Patienten mit Tumo- ren bis zu 3 cm profitieren von mutipolarer Radiofrequenzablation. Die Anwendung multi- polarer RFA bei Tumoren größer 3 cm gestaltet sich durch die inhomogene Ablation schwie- rig und bietet ein schwer kalkulierbares Risiko für die Patienten. Es konnte kein Vorteil durch Steigerung des Energietransfers innerhalb eines Modus nachgewiesen werden, da dies mit einer längeren Behandlungszeit einherging, jedoch nicht mit einer Zunahme der Läsiongröße korrelierte. Bei Patienten mit Niereninsuffizienz, Einzelnieren oder bilateralen Tumoren liegt ein Hauptaugenmerk der Therapie auf dem Erhalt der Nierenfunktion. Um eine mögliche Schädigung von gesundem Nierengewebe durch die RFA zu detektieren, färbten wir die Mar- kerproteine aktivierte Caspase3 und HSP70 immunohistochemisch an. Bei Ablation nahe des Nierenbeckenkelchsystems konnten beide Proteine sowohl im System des distalen Sammel- rohrs, als auch im Nierenmark gefunden werden. Hauptsächlich war das Auftreten jedoch auf die Randgebiete der zentralen Koagulationszone begrenzt. Die Radiofrequenzablation scheint daher ein sicheres Verfahren für die Therapie von Tumoren ≤ 3 cm zu sein.:1 Einführung und Fragestellungen 1 1.1 Einführung 1 1.2 Das Nierenzellkarzinom 2 1.2.1 Epidemiologie 2 1.2.2 Risikofaktoren 3 1.2.3 Klinik des Nierenzellkarzinoms 4 1.2.4 Diagnostik und Therapieverfahren bei Nierenzellkarzinomen 4 1.3 Radiofrequenzablation 7 1.3.1 Pathophysiologie und Technische Details der Radiofrequenzablation 7 1.3.2 Monopolare, bipolare und multipolare Radiofrequenzablation 8 1.3.3 Histologische Betrachtungen der Radiofrequenzablation 9 1.4 Theoretische Einführung in die Untersuchungsparameter 10 1.4.1 Apoptose und Enzyme der Apoptosekaskade 10 1.4.2 Heat Shock Proteine 12 1.5 Fragestellungen und Ziele der Studie 13 2 Publikationsmanuskript 14 3 Zusammenfassung und Schlussfolgerungen 23 4 Literaturverzeichnis 28

Ein LOH (loss of heterozygosity, Heterozygotieverlust) im Bereich des kurzen Arms des Chromosoms 10 tritt sehr häufig in hochgradigen Gliomen auf. Vornehmlich konzentriert sich der allele Verlust auf die Region 10p14-p15. Die chromosomale Instabilität dieser Region deutet auf die Existenz eines oder mehrerer Tumorsuppressorgene hin. Bis jetzt konnte der Krüppel-like Transkriptionsfaktor 6 (KLF6) als mögliche Zielstruktur eines LOH in 10p15 identifiziert werden. Das Gen des regulatorischen Glykolyseenzyms PFKFB3 ist im Bereich 10p15.1 lokalisiert. Die Spleißvariante 4 (UBI2K4) des PFKFB3-Gens hat eine hemmende Wirkung auf das dreidimensionale Wachstum von U87 Glioblastomzellen. Folglich könnte der PFKFB3 Genlocus Zielstruktur eines LOH in Glioblastomen sein. In dieser Arbeit wurden 40 Glioblastome mit der Mikrosatellitenanalyse basierend auf PCR-Technik untersucht. Bei 55 % (22/40) der Glioblastome zeigte sich ein LOH des PFKFB3 Gens. Der LOH des KLF6 Locus, 2,5 cM telomerisch zur PFKFB3 lokalisiert, wurde in 60 % (21/35) der Glioblastome festgestellt und korrelierte nicht mit dem PFKFB3-LOH. Die Deletion eines Allels des PFKFB3-Gens führt zu einer signifikanten Abnahme der PFKFB3 mRNA- und Proteinkonzentration. Die Expression der das Glioblastomzellwachstum hemmenden Spleißvariante UBI2K4 war in der Gruppe der LOH PFKFB (+) Glioblastome deutlich erniedrigt im Vergleich zur PFKFB3-LOH (-) Gruppe und korrelierte mit der totalen PFKFB3 Expression. Die Prognose der Glioblastom-Patienten verschlechtert sich durch den PFKFB3-LOH und die daraus resultierende niedrigere UBI2K4 Expression. Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass der für Glioblastome typische LOH der Region 10p14-p15 auf die PFKFB3 und speziell auf die Spleißvariante UBI2K4 als Tumorsuppressorprotein abzielt.

Das Glioblastoma multiforme gehört zu den ZNS-Tumoren neuroepithelialen Ursprungs. Es zeichnet sich durch ein multiformes Zellbild, einen geringen Differenzierungsgrad und eine schnelle Krankheitsprogression aus. Trotz mikrochirurgischer Entfernung und anschließender Radiochemotherapie entwickeln die Patienten im Durchschnitt nach 7 Monaten einen Rezidivtumor und haben eine mittlere Überlebenszeit von 14,6 Monaten. Die Rezidivneigung stellt somit ein großes Problem in der Behandlung von Glioblastompatienten dar. In früheren Arbeiten konnte nachgewiesen werden, dass die Rezidivtumore eine andere Zellzusammensetzung und auch ein aggressiveres Wachstumsverhalten als deren Primärformen aufweisen. Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen ob mittels 2D-Gelelektrophorese und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen Gewebeproben vom Primärtumor eines Glioblastoms WHO Grad IV und dem korrespondierendem Rezidivtumor eines Patienten detektierbar sind. Hierbei wurden 43 Proteine als differentiell exprimiert erkannt, von denen mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie sechs genauer charakterisiert wurden. Vier der sechs Proteine waren im Rezidivtumor erhöht: EnoylCoA-Hydratase, ATP-Synthase Untereinheit d, Tropomyosin alpha-3-Kette Isoform 2 und Cathepsin D. Die anderen zwei waren im Rezidivtumor niedriger ausgeprägt: Nukleosid-Diphosphatkinase A und L-3-Phosphoserin-Phosphatase. Eine weitere Untersuchung mittels Western-Blot-Analyse bestätigte, dass Cathepsin D (als eines der sechs charakterisierten Proteine) tatsächlich auch in den Rezidivtumoren dreier weiterer Patienten stärker exprimiert war als in den korrespondierenden primären Glioblastomen.

Clinical findings have linked multiple risk factors and associated pathologies to Alzheimer\''s disease (AD). Amongst them are vascular risk factors such as hypertension and pathologies such as stroke. Coexistence of AD and these associated pathologies worsenes dementia, the clinical hallmark of the disease, as compared to pure AD. One general common denominator of these associated pathologies is the presence of hypoxic tissue conditions. It was asked the question, whether there exists a mutual, causal interaction between hypoxia and AD pathology, that could explain the clinical observations. Alternatively, the worsened clinical state of multiple brain pathologies could \"simply\" be the consequence of multimorbidity, i.e. accumulated disease load, without any causal interaction between the constituents. To approach this question whether hypoxia influences AD progression, use was made of a murine animal model of AD (transgenic mice: APPswe, PSEN1dE). Animals of two ages (8 and 14 months, \"young\" and \"old\" respectively) and two genotypes (transgenic and wild- type) were either treated under hypoxia or normoxia, corresponding to 8% and 21% oxygen, for 20 consecutive days. The resulting changes in the brain were assessed with a variety of techniques, namely by histology, ELISA, dot and Western blotting. Additional experiments in primary cell cultures were performed. Animals exposed to hypoxia showed an increased hematocrit (HCT), weight loss, reactive angiogenesis, but no infarctions. This illustrates that our hypoxic treatment put significant stress on the animals, without causing major pathologies. A large number of variables exists that could potentially be measured to assess the effect of hypoxia on AD. The focus was put on three of them: First, there is the Abeta1-42- protein, known to be the Abeta- isoform associated with the most detrimental disease progression. In AD, the self-combinatory Amyloid- beta peptide (Abeta) accumulates in the brain in so- called plaques, which is a main histologic finding of the disease. Its quantity was determined through histology and ELISA. Secondly, it was attempted to estimate the structural quality of the Abeta- protein by assessing the amount of A!- oligomers present. Abeta- protein does self- accumulate in various grades of complexity, i.e. as monomer, oligomer or fibril. Since oligomers are known to be the most neurotoxic \"species\" of the Abeta- protein, it was hypothesized that under hypoxic treatment their quantity could increase. And third, the organism\''s response to the Abeta- protein stimulus was investigated. Microglial cells have been described as the first cells to encounter the Abeta- protein \"threat\" in the shape of plaques, i.e. Abeta- protein aggregates. They then try to encapsulate and subsequently degrade them. Therefore, the attention was put on this cellular population. It was asked whether hypoxia could change the Abeta- protein quantity in the brain. This was assessed in two ways: First histologically, by staining for Abeta- protein depositions and quantifying them. Second, an ELISA was performed. Our findings state that hypoxic treatment does not alter the Abeta1-42 protein load in the brain, neither in young nor old animals, as assessed by histology and by total ELISA quantification of Abeta1-42 protein. Since hypoxia did not alter the quantity of the Abeta- protein, it was asked whether it influenced it qualitatively? If hypoxia increased oligomer formation, this change in the spectrum of the Abeta- species could, without any change in total Abeta- protein load, lead to increased neurotoxicity in animals under hypoxia. Initial experiments showed that oligomer formation in the brain seems to increase. However, this was not statistically significant and future experiments are necessary to evaluate this hypothesis further. It was then asked, whether hypoxia alters the cellular response to the protein. The total number of microglia in the hippocampal dentate gyrus, our structure of interest for practical purposes, and, it can be argued, by extension the brain, changes dynamically with various factors. First, transgenic animals present an increase in microglia. Second, microglia increase with age. Third, microglia decrease under hypoxia, but only do so significantly in old animals. Next, a parameter called \"plaque occupancy\" was coined to assess the microglia function to confront Abeta- plaques. Plaque occupancy is defined as the number of microglia in spatial proximity to one square millimeter of Abeta- plaque. This means, that microglia restricting one plaque are counted, and then normalized to this plaque\''s area. It was hypothesized that hypoxia would decrease plaque occupancy. Indeed, plaque occupancy roughly halved under hypoxia. Summarizing, our results demonstrate that long- term exposure to hypoxia significantly reduces the number of microglia. The reduced number results in significantly reduced plaque occupancy and compromizes the function of microglia to confront Abeta- plaques. The Abeta1-42 load, however, is not affected. On the other hand, Abeta shows an increased trend towards oligomer formation. A variety of possible explanations to these phenomena have been presented, that in our opinion deserve further investigation.

Hedgehog-signalling in malignant gliomas The Hedgehog signalling pathway is important for the development of the central nervous system. On the other hand, aberrant induction is observed in different tumors. Immunofluorescence and real-time qRT-PCR confirmed that in some gliomas, specifically in Glioblastoma multiforme (GBM), Gli1, a transcription factor activated by signalling, is present. In general, the hedgehog pathway is initiated by binding of extracellular ligands to the transmembrane receptor Patched and leads finally to the activation of the transcription factors Gli1, Gli2, Gli3 and Gli4. Whereas Gli1 acts as an activator, Gli2 appears to be an activator but retains some repressor activities and Gli3 and Gli4 are believed to act only as inhibitors. Therefore, the determination of hedgehog activity at the level of transcription requires additional experiments measuring gene activation. For that reason, cells isolated from 13 tumors of patients with glioblastoma (WHO Grade IV) and cells from two different glioma cell lines were transfected with reporter genes. These reporter genes carried the luciferase gene from Gaussia princeps under the control of two promoters (pT109 and pT81) conjugated to Gli binding sites. The activity of the reporter genes was compared to a control plasmid with mutant Gli-binding sites. In addition reporter gene activity was analysed in the absence and presence of the hedgehog signalling inhibitor cyclopamine and the effect of cyclopamine on cellular metabolism was studied. The analysis revealed that the two cell lines and cells from 6 glioblastomas exhibited enhanced reporter gene activity compared to the activity mutant control. This points towards an enhanced expression of Gli1. In three cultures a repression was detected suggesting that Gli3 may be active in these cells. Four cultures did neither show activation nor repression. This could provide evidence that Gli1 and Gli3 effects cancel each other out or that there is no effect at all. Enhanced luciferase activity in cells from the line T98G and in cells from four primary cultures was not influenced by the hedgehog inhibitor cyclopamine, whereas one cell line significantly responded to its presence with a decreased activity. Interestingly, ATP level was suppressed by cyclopamine in cells from the line T98G and also in cells from one primary culture that responded to the inhibitor. This may point towards an effect of cyclopamine independent of smo. Since cyclopamine is a potential new substance for the treatment of tumors, the observed effect of this inhibitor even in cells without an indication of hedgehog signalling activity should be investigated in further experiments in more detail. Der Hedgehog (Hh) -Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle, so auch bei der Entstehung des zentralen Nervensystems (Varjosalo & Taipale 2008). Andererseits führt seine unregulierte Aktivität zur Ausbildung verschiedenster Tumore (Bailey et al. 2009; Fiaschi et al. 2009; Shaw et al. 2009; Velcheti & Govindan 2007). Vorausgegangene Studien wiesen durch Immunfluoreszenz und real-time qRT-PCR nach, dass auch in Gliomen, speziell in Glioblastoma multiforme, dem agressivsten Hirntumor des Menschen, Effektoren des Signalweges (Gli1) überexprimiert werden (Wang et al. 2010). Die Aktivierung des Signalweges geschieht über Bindung des Hh-Liganden an den Rezeptor Ptch und endet mit der Aktiverung der Transkriptionsfaktoren der Gli Familie (Kinzler & Vogelstein 1990; Stone et al. 1996). Die aktuell bekannten Vertreter dieser Familie sind der Aktivator der Transkription Gli1, Gli2, der als Aktivator und Repressor agieren kann sowie Gli3 und Gli4, die die Transkription inhibieren (Marine et al. 1997; Ruppert et al. 1988). Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, inwieweit die Transkriptionsfaktoren der Gli-Familie in Zellen von Glioblastoma multiforme aktiv sind. Dafür wurden Zellen aus Tumormaterial isoliert und daraus Primärkulturen hergestellt. In diese 13 Primärkulturen, wie auch in zwei Gliom-Zelllinien, wurden mittels transienter Transfektion Reporterplasmide eingebracht. Diese enthielten ein Gen der Gaussia-Luciferase, das unter der Kontrolle zweier verschiedener Promotoren (pT109 und pT81) mit Bindungsmotiven für die Transkriptionsfaktoren der Gli-Familie stand. Weiterhin wurde der Einfluss des Inhibitors des Hh-Signalweges Cyclopamin auf die Gli-Aktivität und die Metabolische Aktivität der Zellen untersucht. Die Beobachtungen ergaben, dass die zwei Zelllinien und sechs der primären Kulturen eine erhöhte Luciferaseaktivität und damit gesteigerte Aktivität von Gli1 zeigten. Weiterhin wiesen vier Kulturen eine verminderte Luciferaseaktivität auf. Dies ließ darauf schließen, dass in diesen Zellen Gli3 aktiv war. In den restlichen vier Kulturen zeigte sich keine Veränderung der Luciferaseaktiviät, was für einen Aufhebungseffekt von Gli1 und Gli3 oder gar keinen Effekt spricht. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Luciferaseaktivität und damit die Aktivität von Gli1 in Zellen der Zelllinie T98G und von vier Primärkulturen nicht durch Cyclopamin beeinflusst wird. Lediglich eine Probe der Primärkulturen reagierte mit einer Abnahme der Luciferaseaktivität. Außerdem konnte Cyclopamin die ATP-Produktion sowohl in Zellen von T98G als auch in Zellen der Zelllinie, deren Gli-Aktivität durch Cyclopamin vermindert wurde, senken. Dies sprach für eine Smo unabhängige Wirkung des Cyclopamins. Da Cyclopamin ein potenzielles Pharmakon für die Antitumortherapie ist, bedarf dieser Umstand näherer Untersuchungen.

Das Enzym Glutaminsynthetase (GS) wird in Organen mit niedriger enzymatischer Aktivität in zumeist allen Zellen exprimiert. Auf der anderen Seite ist die Expression in Geweben mit hoher Aktivität auf spezialisierte Zellen beschränkt. So findet man in der Säugerleber Expression der GS nur in Hepatozyten, die in ein bis drei Zellreihen um die Zentralvenen lokalisiert sind. In der vorliegenden Arbeit wurde die Frage gestellt, ob der zwischen verschiedenen Spezies hoch konservierte 3’-Bereich der nicht-translatierten Region des GS-Gens an der Regulation der Expression und der Zonierung beteiligt ist. Hierzu wurden Reportergenstudien, transiente Transfektionen sowie Northern-Blot-Experimente unter Verwendung von primären Hepatozyten aus dem periportalen und perizentralen Bereich der Rattenleber durchgeführt. Die Ergebnisse der Arbeit lassen eine über das 3’-Ende vermittelte selektive Destabilisierung der GS-mRNA in periportalen (GS-negativen) Hepatozyten vermuten. Zudem zeigte sich, dass die Wechselwirkung des 3’-UTRs mit Bereichen des 5’-UTRs, bzw. dem GS-Promotor für die eigentliche Regulation verantwortlich ist. Es lässt sich vermuten, dass eine posttranskriptionale Regulation neben den in den letzten Jahren aufgeklärten Mechanismen der Regulation der Transkription mit zur Feinsteuerung der Expression der GS beiträgt.