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Die Besonderheit der DNA-Nanotechnologie liegt in der Verwendung von DNA als Konstruktionsmaterial für die Herstellung von artifiziellen Strukturen im Nanometermaßstab (Seeman, 1982; Winfree et al., 1998). Diese DNA-Nanoobjekte, wie beispielsweise DNA-Nanoröhren, offerieren innovative und vielversprechende Anwendungsmöglichkeiten in verschiedenen Bereichen wie der Elektronik oder Medizin. Eine Herausforderung für die dauerhafte Verwendung von DNA-Nanoröhren stellt deren Stabilität dar. Einflussfaktoren wie die DNA-Nukleaseaktivitäten, die Ionenstärke und hohe Temperaturen können dabei eine langfristige Anwendung limitieren. Als ein Lösungsansatz für die Erhöhung der Beständigkeit wird eine gezielte Mineralisierung der DNA-Nanoröhren durch spezifische Fusionsproteine angestrebt. Ziel dieser Arbeit ist die dafür notwendige Herstellung und Charakterisierung der DNA-bindenden Fusionsproteine mit Mineralisierungsdomänen vorzustellen. Das umfasst das Auswählen geeigneter DNA-Bindungsproteine als Bestandteil der Fusionsproteine. In dieser Arbeit wurden die DNA-Bindungsproteine MutH und SBB aus Escherichia coli (E. coli) sowie Yku70p aus Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften dafür identifiziert. Damit können die Fusionsproteine sequenzspezifische oder -unspezifische Bindungen mit doppelsträngiger (engl. double stranded DNA, dsDNA) oder einzelsträngiger DNA (engl. single stranded DNA, ssDNA) eingehen. Es ist mittels Klonierung gelungen, verschiedene Fusionskonstrukte mit den genannten DNA-Bindungsproteinen zu generieren. Diese beinhalten ebenfalls das enhanced green fluorescent protein sowie den His6-Tag für den Expressionsnachweis und die Proteinreinigung. Weitere Varianten der Fusionskonstrukte bestehen zusätzlich aus der tobacco etch virus-Protease-Erkennungssequenz zur Entfernung des His6-Tags und der Domänen R5-Peptid (R5P) oder Poly-L-Arginin (PLR) für die Mineralisierung. Bestandteil dieser Arbeit sind Western-Blot-Analysen und mikroskopische Aufnahmen, welche die erfolgreiche heterologe Expression aller Fusionskonstrukte nachweisen. Aus den Ergebnissen der Expressions- und Löslichkeitsanalysen lässt sich schlussfolgern, dass insbesondere das Expressionslevel und die Synthese löslicher Proteine mit den Mineralisierungsdomänen eine Herausforderung darstellen. Ebenfalls in dieser Arbeit sind Versuche zur Optimierung mit verschiedenen Expressionsstämmen (E. coli und S. cerevisiae) und Expressionsparametern (Temperatur und Induktor-Konzentration) enthalten. Den Ergebnissen nach eignen sich besonders die Fusionsproteine MutH-EGFP-His6 und SSB-EGFP-His6 für die weiteren Experimente. Die Untersuchungen der DNA-Bindungseigenschaften erfolgten mittels Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) und Rasterkraftmikroskopie (engl. atomic force microscopy, AFM). Diese Methoden mussten für jedes Fusionsprotein zuvor etabliert und optimiert werden. Zu Beginn stand das MutH-Fusionsprotein im Focus, wobei die durchgeführten EMSA-Untersuchungen die Spezifität zur GATC-Erkennungssequenz sowie zur dsDNA betrachteten. Die Charakterisierung mittels AFM diente als weitere Möglichkeit zur Analyse der DNA-Bindungseigenschaften. Zusätzlich kam in dieser Arbeit eine Variante des CRISPR/Cas9-Systems als Fusionsprotein für eine sequenzspezifische Adressierung von dsDNA zum Einsatz. Die EMSA- und AFM-Analysen deuteten dabei auf eine Interaktion von dem dCas9-Fusionsproteins und dsDNA hin. Weiterhin war das SSB-Fusionsprotein Bestandteil der Untersuchungen. Die Bindungsanalysen mittels EMSA zeigten, dass es bevorzugt mit ssDNA interagiert und nur eine geringe Affinität zu dsDNA vorliegt. Die Bindung zu ssDNA konnte ebenfalls erfolgreich anhand von AFM-Untersuchungen gezeigt werden. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse die Funktionalität des MutH- und SSB-Fusionsproteins. Es konnten zudem erste Hinweise erbracht werden, die eine spezifische Bindung der Fusionsproteine an dsDNA oder ssDNA belegen. Mit dieser Arbeit ist es gelungen, Proteinderivate zu generieren und charakterisieren, wodurch eine entscheidende Grundlage für die gezielte Mineralisierung von DNA-Konstrukten geschaffen wurde.

Members of the evolutionary conserved Sco protein family have been intensively studied regarding their role in the assembly of the mitochondrial cytochrome c oxidase. However, experimental and structural data, specifically the presence of a thioredoxin-like fold, suggest that Sco proteins may also play a role in redox homeostasis. In our study, we addressed this putative function of Sco proteins using Saccharomyces cerevisiae as a model system. Like many eukaryotes, this yeast possesses two SCO homologs (SCO1 and SCO2). Mutants bearing a deletion of either of the two genes are not affected in their growth under oxidative stress. However, the concomitant deletion of the SOD1 gene encoding the superoxide dismutase 1 resulted in a distinct phenotype: double deletion strains lacking SCO1 or SCO2 and SOD1 are highly sensitive to oxidative stress and show dramatically increased ROS levels. The respiratory competent double deletion strain Δsco2Δsod1 paved the way to investigate the putative antioxidant function of SCO homologs apart from their role in respiration by complementation analysis. Sco homologs from Drosophila, Arabidopsis, human and two other yeast species were integrated into the genome of the double deletion mutant and the transformants were analyzed for their growth under oxidative stress. Interestingly, all homologs except for Kluyveromyces lactis K07152 and Arabidopsis thaliana HCC1 were able to complement the phenotype, indicating their role in oxidative stress defense. We further applied this complementation-based system to investigate whether pathogenic point mutations affect the putative antioxidant role of hSco2. Surprisingly, all of the mutant alleles failed to restore the ROS-sensitivity of the Δsco2Δsod1 strain. In conclusion, our data not only provide clear evidence for the function of Sco proteins in oxidative stress defense but also offer a valuable tool to investigate this role for other homologous proteins., Graphical abstract fx1, Highlights • Concomitant deletion of SCO and SOD1 leads to a high ROS sensitivity. • SCO homologs from higher organisms can rescue the oxidative stress sensitive phenotype of the double deletion mutant. • Pathogenic human Sco2 mutations affect the antioxidant function of the protein. • The role of the Sco proteins in oxidative stress defense is discussed.