32 results on '"Hubbuch, Jürgen"'
Search Results
2. Kinetic studies and CFD-based reaction modeling for insights into the scalability of ADC conjugation reactions
- Author
-
Weggen, Jan Tobias, Seidel, Janik, Bean, Ryan, Wendeler, Michaela, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,Histology ,ddc:660 ,Biomedical Engineering ,Bioengineering ,Biotechnology - Abstract
The manufacturing of antibody-drug conjugates (ADCs) involves the addition of a cytotoxic small-molecule linker-drug (= payload) to a solution of functionalized antibodies. For the development of robust conjugation processes, initially small-scale reaction tubes are used which requires a lot of manual handling. Scale-up to larger reaction vessels is often knowledge-driven and scale-comparability is solely assessed based on final product quality which does not account for the dynamics of the reaction. In addition, information about the influence of process parameters, such as stirrer speed, temperature, or payload addition rates, is limited due to high material costs. Given these limitations, there is a need for a modeling-based approach to investigate conjugation scale-up. In this work, both experimental kinetic studies and computational fluid dynamics (CFD) conjugation simulations were performed to understand the influence of scale and mixing parameters. In the experimental part, conjugation kinetics in small-scale reaction tubes with different mixing types were investigated for two ADC systems and compared to larger bench-scale reactions. It was demonstrated that more robust kinetics can be achieved through internal stirrer mixing instead of external mixing devices, such as orbital shakers. In the simulation part, 3D-reactor models were created by coupling CFD-models for three large-scale reaction vessels with a kinetic model for a site-specific conjugation reaction. This enabled to study the kinetics in different vessels, as well as the effect of process parameter variations in silico. Overall, it was found that for this conjugation type sufficient mixing can be achieved at all scales and the studied parameters cause only deviations during the payload addition period. An additional time-scale analysis demonstrated to aid the assessment of mixing effects during ADC process scale-up when mixing times and kinetic rates are known. In summary, this work highlights the benefit of kinetic models for enhanced conjugation process understanding without the need for large-scale experiments.
- Published
- 2023
3. Systematic evaluation of agarose- and agar-based bioinks for extrusion-based bioprinting of enzymatically active hydrogels
- Author
-
Wenger, Lukas, Radtke, Carsten P., Gerisch, Eva, Kollmann, Max, Niemeyer, Christof M., Rabe, Kersten S., and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,esterase ,Histology ,enzymes ,Biomedical Engineering ,Bioengineering ,3D printing ,enzyme activity ,ddc:570 ,enzyme leaching ,biocatalytic reactors ,bioprinting ,Biotechnology - Abstract
Extrusion-based 3D bioprinting enables the production of customized hydrogel structures that can be employed in flow reactors when printing with enzyme-containing inks. The present study compares inks based on either low-melt agarose or agar at different concentrations (3–6%) and loaded with the thermostable enzyme esterase 2 from the thermophilic organism Alicyclobacillus acidocaldarius (AaEst2) with regard to their suitability for the fabrication of such enzymatically active hydrogels. A customized printer setup including a heatable nozzle and a cooled substrate was established to allow for clean and reproducible prints. The inks and printed hydrogel samples were characterized using rheological measurements and compression tests. All inks were found to be sufficiently printable to create lattices without overhangs, but printing quality was strongly enhanced at 4.5% polymer or more. The produced hydrogels were characterized regarding mechanical strength and diffusibility. For both properties, a strong correlation with polymer concentration was observed with highly concentrated hydrogels being more stable and less diffusible. Agar hydrogels were found to be more stable and show higher diffusion rates than comparable agarose hydrogels. Enzyme leaching was identified as a major drawback of agar hydrogels, while hardly any leaching from agarose hydrogels was detected. The poor ability of agar hydrogels to permanently immobilize enzymes indicates their limited suitability for their employment in perfused biocatalytic reactors. Batch-based activity assays showed that the enzymatic activity of agar hydrogels was roughly twice as high as the activity of agarose hydrogels which was mostly attributed to the increased amount of enzyme leaching. Agarose bioinks with at least 4.5% polymer were identified as the most suitable of the investigated inks for the printing of biocatalytic reactors with AaEst2. Drawbacks of these inks are limited mechanical and thermal stability, not allowing the operation of a reactor at the optimum temperature of AaEst2 which is above the melting point of the employed low-melt agarose.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
4. Calibration-free PAT: Locating selective crystallization or precipitation sweet spot in screenings with multi-way PARAFAC models
- Author
-
Wegner, Christina Henriette and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,selective precipitation ,selective crystallization ,calibration-free ,ddc:660 ,high-throughput (HT) screening ,parallel factor analysis (PARAFAC) ,multi-way chemometrics ,ultravioletvisible light (UV/Vis) spectroscopy - Abstract
When developping selective crystallization or precipitation processes, biopharmaceutical modalities require empirical screenings and analytics tailored to the specific needs of the target molecule. The multi-way chemometric approach called parallel factor analysis (PARAFAC) coupled with ultraviolet visible light (UV/Vis) spectroscopy is able to predict specific concentrations and spectra from highly structured data sets without the need for calibration samples and reference analytics. These calculated models can provide exploratory information on pure species spectra and concentrations in all analyzed samples by representing one model component with one species. In this work, protein mixtures, monoclonal antibodies, and virus-like particles in chemically defined and complex solutions were investigated in three high- throughput crystallization or precipitation screenings with the aim to construct one PARAFAC model per case. Spectroscopic data sets of samples after the selective crystallization or precipitation, washing, and redissolution were recorded and arranged into a four-dimensional data set per case study. Different reference analytics and pure species spectra served as validation. Appropriate spectral preprocessing parameters were found for all case studies allowing even the application of this approach to the third case study in which quantitative concentration analytics are missing. Regardless of the modality or the number of species present in complex solutions, all models were able to estimate the specific concentration and find the optimal process condition regarding yield and product purity. It was shown that in complex solutions, species demonstrating similar phase behavior can be clustered as one component and described in the model. PARAFAC as a calibration-free approach coupled with UV/Vis spectroscopy provides a fast overview of species present in complex solution and of their concentration during selective crystallization or precipitation, washing, and redissolution.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
5. Process development exploiting competitive adsorption-based displacement effects in monoclonal antibody aggregate removal—A new high-throughput screening procedure for membrane chromatography
- Author
-
Stein, Dominik, Thom, V., and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,ddc:570 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
6. Evaluation of the Reproducibility and Robustness of Extrusion-Based Bioprinting Processes Applying a Flow Sensor
- Author
-
Strauß, Svenja, Schroth, Bianca, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,ddc:570 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
7. Investigation of Lysozyme Diffusion in Agarose Hydrogels Employing a Microfluidics-Based UV Imaging Approach
- Author
-
Wenger, Lukas and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,Histology ,ddc:570 ,Biomedical Engineering ,Bioengineering ,Biotechnology - Abstract
Hydrogels are polymer-based materials with a high water content. Due to their biocompatible and cell-friendly nature, they play a major role in a variety of biotechnological applications. For many of these applications, diffusibility is an essential property influencing the choice of material. We present an approach to estimate diffusion coefficients in hydrogels based on absorbance measurements of a UV area imaging system. A microfluidic chip with a y-junction was employed to generate a fluid-hydrogel interface and the diffusion of lysozyme from the fluid into the hydrogel phase was monitored. Employing automated image and data processing, analyte concentration profiles were generated from the absorbance measurements and fits with an analytical solution of Fick’s second law of diffusion were applied to estimate diffusion coefficients. As a case study, the diffusion of lysozyme in hydrogels made from different concentrations (0.5–1.5% (w/w)) of an unmodified and a low-melt agarose was investigated. The estimated diffusion coefficients for lysozyme were between 0.80 ± 0.04×10$^{-10}$ m$^{2}$ s$^{-1}$ for 1.5% (w/w) low-melt agarose and 1.14 ± 0.02×10$^{-10}$ m$^{2}$ s$^{-1}$ for 0.5% (w/w) unmodified agarose. The method proved sensitive enough to resolve significant differences between the diffusion coefficients in different concentrations and types of agarose. The microfluidic approach offers low consumption of analyte and hydrogel and requires only relatively simple instrumentation.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
8. Virtual Reality as Tool for Bioprinting Quality Inspection: A Proof of Principle
- Author
-
Gretzinger, Sarah, Schmieg, Barbara, Guthausen, Gisela, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,Histology ,ddc:570 ,Biomedical Engineering ,Bioengineering ,Biotechnology - Abstract
As virtual reality (VR) has drastically evolved over the past few years, the field of applications of VR flourished way beyond the gaming industry. While commercial VR solutions might be available, there is a need to develop a workflow for specific applications. Bioprinting represents such an example. Here, complex 3D data is generated and needs to be visualized in the context of quality control. We demonstrate that the transfer to a commercially available VR software is possible by introducing an optimized workflow. In the present work, we developed a workflow for the visualization of the critical quality attribute (cQA) cell distribution in bioprinted (extrusion-based) samples in VR. The cQA cell distribution is directly influenced by the pre-processing step mixing of cell material in the bioink. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used as an analytical tool to generate spatially resolved 2.5 and 3D data of the bioprinted objects. A sample with poor quality in respect of the cQA cell distribution was identified as its inhomogeneous cell distribution could be displayed spatially resolved in VR. The described workflow facilitates the usage of VR as a tool for quality inspection in the field of bioprinting and represents a powerful tool for visualization of complex 3D MRI data.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
9. Structured Data Storage for Data-Driven Process Optimisation in Bioprinting
- Author
-
Schmieg, Barbara, Brandt, Nico, Schnepp, Vera J., Radosevic, Luka, Gretzinger, Sarah, Selzer, Michael, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,ddc:570 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
10. Magnetic Resonance Imaging: Time-DependentWetting and Swelling Behavior of an Auxetic Hydrogel Based on Natural Polymers
- Author
-
Haas, Sandra, Schmieg, Barbara, Wendlich, Paul, Guthausen, Gisela, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
11. Magnetic resonance imaging as a tool for quality control in extrusion-based bioprinting
- Author
-
Schmieg, Barbara, Gretzinger, Sarah, Schuhmann, Sebastian, Guthausen, Gisela, and Hubbuch, Jürgen
- Abstract
Bioprinting is gaining importance for the manufacturing of tailor-made hydrogel scaffolds in tissue engineering, pharmaceutical research and cell therapy. However, structure fidelity and geometric deviations of printed objects heavily influence mass transport and process reproducibility. Fast, three-dimensional and nondestructive quality control methods will be decisive for the approval in larger studies or industry. Magnetic resonance imaging (MRI) meets these requirements for characterizing heterogeneous soft materials with different properties. Complementary to the idea of decentralized 3D printing, magnetic resonance tomography is common in medicine, and image data processing tools can be transferred system-independently. In this study, a MRI measurement and image analysis protocol was evaluated to jointly assess the reproducibility of three different hydrogels and a reference material. Critical parameters for object quality, namely porosity, hole areas and deviations along the height of the scaffolds are discussed. Geometric deviations could be correlated to specific process parameters, anomalies of the ink or changes of ambient conditions. This strategy allows the systematic investigation of complex 3D objects as well as an implementation as a process control tool. Combined with the monitoring of metadata this approach might pave the way for future industrial applications of 3D printing in the field of biopharmaceutics.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
12. A Novel Approach for the Manufacturing of Gelatin-Methacryloyl
- Author
-
Grijalva Garces, David, Radtke, Carsten Philipp, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,gelatin ,cell culture ,ddc:570 ,fibroblasts ,tissue engineering ,hydrogel ,biomaterials ,GelMA - Abstract
Gelatin and its derivatives contain cell adhesion moieties as well as sites that enable proteolytic degradation, thus allowing cellular proliferation and migration. The processing of gelatin to its derivatives and/or gelatin-containing products is challenged by its gelation below 30 ∘C. In this study, a novel strategy was developed for the dissolution and subsequent modification of gelatin to its derivative gelatin-methacryloyl (GelMA). This approach was based on the presence of urea in the buffer media, which enabled the processing at room temperature, i.e., lower than the sol–gel transition point of the gelatin solutions. The degree of functionalization was controlled by the ratio of reactant volume to the gelatin concentration. Hydrogels with tailored mechanical properties were produced by variations of the GelMA concentration and its degree of functionalization. Moreover, the biocompatibility of hydrogels was assessed and compared to hydrogels formulated with GelMA produced by the conventional method. NIH 3T3 fibroblasts were seeded onto hydrogels and the viability showed no difference from the control after a three-day incubation period.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
13. Effects of Different Lengths of a Nucleic Acid Binding Region and Bound Nucleic Acids on the Phase Behavior and Purification Process of HBcAg Virus-Like Particles
- Author
-
Valentic, Angela, Müller, Jakob, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Abstract
Virus-like particles (VLPs) are macromolecular structures with great potential as vehicles for the targeted administration of functional molecules. Loaded with nucleic acids, VLPs are a promising approach for nanocarriers needed for gene therapy. There is broad knowledge of the manufacturing of the truncated wild-type lacking a nucleic acid binding region, which is mainly being investigated for vaccine applications. Whereas for their potential application as a nanocarrier for gene therapy, hepatitis B core antigen (HBcAg) VLPs with a nucleic acid binding region for efficient cargo-loading are being investigated. VLP structure, loading, and phase behavior are of central importance to their therapeutic efficacy and thereby considerably affecting the production process. Therefore, HBcAg VLPs with different lengths of the nucleic acid binding region were produced in E. coli. VLP attributes such as size, zeta potential, and loading with host cell-derived nucleic acids were evaluated. Capsid’s size and zeta potential of the VLP constructs did not differ remarkably, whereas the analysis of the loading with host cell-derived nucleic acids revealed strong differences in the binding of host cell-derived nucleic acids dependent on the length of the binding region of the constructs, with a non-linear correlation but a two-zone behavior. Moreover, the phase behavior and purification process of the HBcAg VLPs as a function of the liquid phase conditions and the presence of host cell-derived nucleic acids were investigated. Selective VLP precipitation using ammonium sulfate was scarcely affected by the encapsulated nucleic acids. However, the disassembly reaction, which is crucial for structure homogeneity, separation of encapsulated impurities, and effective loading of the VLPs with therapeutic nucleic acids, was affected both by the studied liquid phase conditions, varying pH and concentration of reducing agents, and the different VLP constructs and amount of bound nucleic acids, respectively. Thereby, capsid-stabilizing effects of the bound nucleic acids and capsid-destabilizing effects of the nucleic acid binding region were observed, following the two-zone behavior of the construct’s loading, and a resulting correlation between the capsid stability and disassembly yields could be derived.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
14. Purification of a Hydrophobic Elastin-Like Protein Toward Scale-Suitable Production of Biomaterials
- Author
-
Haas, Sandra, Desombre, Monika, Kirschhöfer, Frank, Huber, Matthias C., Schiller, Stefan M., and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Abstract
Elastin-like proteins (ELPs) are polypeptides with potential applications as renewable bio-based high-performance polymers, which undergo a stimulus-responsive reversible phase transition. The ELP investigated in this manuscript—ELP[V2Y-45]—promises fascinating mechanical properties in biomaterial applications. Purification process scalability and purification performance are important factors for the evaluation of potential industrial-scale production of ELPs. Salt-induced precipitation, inverse transition cycling (ITC), and immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) were assessed as purification protocols for a polyhistidine-tagged hydrophobic ELP showing low-temperature transition behavior. IMAC achieved a purity of 86% and the lowest nucleic acid contamination of all processes. Metal ion leakage did not propagate chemical modifications and could be successfully removed through size-exclusion chromatography. The simplest approach using a high-salt precipitation resulted in a 60% higher target molecule yield compared to both other approaches, with the drawback of a lower purity of 60% and higher nucleic acid contamination. An additional ITC purification led to the highest purity of 88% and high nucleic acid removal. However, expensive temperature-dependent centrifugation steps are required and aggregation effects even at low temperatures have to be considered for the investigated ELP. Therefore, ITC and IMAC are promising downstream processes for biomedical applications with scale-dependent economical costs to be considered, while salt-induced precipitation may be a fast and simple alternative for large-scale bio-based polymer production.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
15. Thiol-Functional Polymer Nanoparticles via Aerosol Photopolymerization
- Author
-
Suvarli, Narmin, Perner-Nochta, Iris, Hubbuch, Jürgen, and Wörner, Michael
- Subjects
Chemical engineering ,QD241-441 ,polymer nanoparticles ,ddc:660 ,Organic chemistry ,aerosol photopolymerization ,thiol-functional nanoparticles ,thiol-ene polymerization ,Article - Abstract
Spherical, individual polymer nanoparticles with functional –SH groups were synthesized via aerosol photopolymerization (APP) employing radically initiated thiol-ene chemistry. A series of various thiol and alkene monomer combinations were investigated based on di-, tri-, and tetrafunctional thiols with difunctional allyl and vinyl ethers, and di- and trifunctional acrylates. Only thiol and alkene monomer combinations able to build cross-linked poly(thio-ether) networks were compatible with APP, which requires fast polymerization of the generated droplet aerosol during the photoreactor passage within a residence time of half-minute. Higher monomer functionalities and equal overall stoichiometry of functional groups resulted in the best nanoparticles being spherical and individual, proven by scanning electron microscopy (SEM). The presence of reactive –SH groups in the synthesized nanoparticles as a basis for post-polymerization modifications was verified by Ellman’s test.
- Published
- 2021
16. Temperature Based Process Characterization of Pharmaceutical Freeze-Thaw Operations
- Author
-
Weber, Dennis and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Histology ,last point to freeze ,lcsh:Biotechnology ,Biomedical Engineering ,Bioengineering and Biotechnology ,Bioengineering ,formulation ,process characterization ,Chemical engineering ,freeze-thaw ,freezing time ,lcsh:TP248.13-248.65 ,ddc:660 ,Biotechnology ,Original Research - Abstract
In biopharmaceutical production processes, freeze-thaw operations are used to ensure product integrity during long hold times, but they also introduce additional stresses such as freeze concentration gradients that might lead to a loss of protein activity. Process characterization of freeze-thaw operations at different scales should be conducted with attention to freezing time and boundary effects to ensure the product stability throughout the process and process development. Currently, process characterization often relies on one or very few temperature probes that detect freezing times based on raw temperature, which is largely influenced by freezing-point depression in case of concentrated solutions. A method to detect freezing based on the second derivative of temperature measurements from Fiber-Bragg-Grating sensors is presented to overcome this issue. The applicability of the method is demonstrated by process characterization of a novel small-scale freeze-thaw device with minimized boundary effects using freezing times of purified water and concentrated formulations. Freezing times varied from 35 to 81 min for temperatures between −60 and −20°C and impacted freeze concentration profiles. Furthermore, freezing time estimations based on the Plank equation revealed model limitations due to start-up temperature gradients, that can be corrected by an empirically extended Plank model. As a hypothesis, we conclude that freezing temperature, from a freeze concentration view, is less important in containers with small characteristic freezing distances such as freeze bags. Using a 2D-resolved temperature profile, a shift of the last point to freeze position from top to bottom of a container was observed when freezing above −30°C.
- Published
- 2021
17. Process development for cross-flow diafiltration-based VLP disassembly: A novel high-throughput screening approach
- Author
-
Hillebrandt, Nils, Vormittag, Philipp, Dietrich, Annabelle, Wegner, Christina H., and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,viruses ,ddc:660 - Abstract
Virus-like particles (VLPs) are particulate structures, which are applied as vaccines or delivery vehicles. VLPs assemble from subunits, named capsomeres, composed of recombinantly expressed viral structural proteins. During downstream processing, in vivo-assembled VLPs are typically dis- and reassembled to remove encapsulated impurities and to improve particle morphology. Disassembly is achieved in a high-pH solution and by the addition of a denaturant or reducing agent. The optimal disassembly conditions depend on the VLP amino acid sequence and structure, thus requiring material-consuming disassembly experiments. To this end, we developed a low-volume and high-resolution disassembly screening that provides time-resolved insight into the VLP disassembly progress. In this study, two variants of C-terminally truncated hepatitis B core antigen were investigated showing different disassembly behaviors. For both VLPs, the best capsomere yield was achieved at moderately high urea concentration and pH. Nonetheless, their disassembly behaviors differed particularly with respect to disassembly rate and aggregation. Based on the high-throughput screening results, a diafiltration-based disassembly process step was developed. Compared with mixing-based disassembly, it resulted in higher yields of up to 0.84 and allowed for integrated purification. This process step was embedded in a filtration-based process sequence of disassembly, capsomere separation, and reassembly, considerably reducing high-molecular-weight species.
- Published
- 2021
- Full Text
- View/download PDF
18. 3D-Printable and Enzymatically Active Composite Materials Based on Hydrogel-Filled High Internal Phase Emulsions
- Author
-
Wenger, Lukas, Radtke, Carsten P., Göpper, Jacqueline, Wörner, Michael, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Histology ,enzymes ,technology, industry, and agriculture ,Biomedical Engineering ,Bioengineering and Biotechnology ,Bioengineering ,3D printing ,beta-galactosidase ,high internal phase emulsions ,Chemical engineering ,ddc:660 ,biocatalytic reactors ,cure-on-dispense ,bioprinting ,hydrogels ,Original Research ,Biotechnology - Abstract
The immobilization of enzymes in biocatalytic flow reactors is a common strategy to increase enzyme reusability and improve biocatalytic performance. Extrusion-based 3D bioprinting has recently emerged as a versatile tool for the fabrication of perfusable hydrogel grids containing entrapped enzymes for the use in such reactors. This study demonstrates the suitability of water-in-oil high internal phase emulsions (HIPEs) as 3D-printable bioinks for the fabrication of composite materials with a porous polymeric scaffold (polyHIPE) filled with enzyme-laden hydrogel. The prepared HIPEs exhibited excellent printability and are shown to be suitable for the printing of complex three-dimensional structures without the need for sacrificial support material. An automated activity assay method for the systematic screening of different material compositions in small-scale batch experiments is presented. The monomer mass fraction in the aqueous phase and the thickness of printed objects were found to be the most important parameters determining the apparent activity of the immobilized enzyme. Mass transfer limitations and enzyme inactivation were identified as probable factors reducing the apparent activity. The presented HIPE-based bioinks enable the fabrication of flow-optimized and more efficient biocatalytic reactors while the automated activity assay method allows the rapid screening of materials to optimize the biocatalytic efficiency further without time-consuming flow-through experiments involving whole printed reactors.
- Published
- 2020
- Full Text
- View/download PDF
19. Ensembles of Hydrophobicity Scales as Potent Classifiers for Chimeric Virus-Like Particle Solubility – An Amino Acid Sequence-Based Machine Learning Approach
- Author
-
Vormittag, Philipp, Klamp, Thorsten, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
lcsh:Biotechnology ,solubility ,virus diseases ,Bioengineering and Biotechnology ,virus-like particles ,Chemical engineering ,machine learning ,feature selection ,lcsh:TP248.13-248.65 ,ddc:660 ,hydrophobicity scales ,Original Research ,hydrophobicity - Abstract
Virus-like particles (VLPs) are protein-based nanoscale structures that show high potential as immunotherapeutics or cargo delivery vehicles. Chimeric VLPs are decorated with foreign peptides resulting in structures that confer immune responses against the displayed epitope. However, insertion of foreign sequences often results in insoluble proteins, calling for methods capable of assessing a VLP candidate’s solubility in silico. The prediction of VLP solubility requires a model that can identify critical hydrophobicity-related parameters, distinguishing between VLP-forming aggregation and aggregation leading to insoluble virus protein clusters. Therefore, we developed and implemented a soft ensemble vote classifier (sEVC) framework based on chimeric hepatitis B core antigen (HBcAg) amino acid sequences and 91 publicly available hydrophobicity scales. Based on each hydrophobicity scale, an individual decision tree was induced as classifier in the sEVC. An embedded feature selection algorithm and stratified sampling proved beneficial for model construction. With a learning experiment, model performance in the space of model training set size and number of included classifiers in the sEVC was explored. Additionally, seven models were created from training data of 24–384 chimeric HBcAg constructs, which were validated by 100-fold Monte Carlo cross-validation. The models predicted external test sets of 184–544 chimeric HBcAg constructs. Best models showed a Matthew’s correlation coefficient of >0.6 on the validation and the external test set. Feature selection was evaluated for classifiers with best and worst performance in the chimeric HBcAg VLP solubility scenario. Analysis of the associated hydrophobicity scales allowed for retrieval of biological information related to the mechanistic backgrounds of VLP solubility, suggesting a special role of arginine for VLP assembly and solubility. In the future, the developed sEVC could further be applied to hydrophobicity-related problems in other domains, such as monoclonal antibodies.
- Published
- 2020
20. Integrated Process for Capture and Purification of Virus-Like Particles: Enhancing Process Performance by Cross-Flow Filtration
- Author
-
Hillebrandt, Nils, Vormittag, Philipp, Bluthardt, Nicolai, Dietrich, Annabelle, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Histology ,integrated processing ,lcsh:Biotechnology ,Biomedical Engineering ,cross-flow filtration ,Bioengineering and Biotechnology ,Bioengineering ,precipitation ,virus-like particles ,Chemical engineering ,downstream processing ,lcsh:TP248.13-248.65 ,ddc:660 ,Biotechnology ,Original Research - Abstract
Virus-like particles (VLPs) are emerging nanoscale protein assemblies applied as prophylactic vaccines and in development as therapeutic vaccines or cargo delivery systems. Downstream processing (DSP) of VLPs comes both with challenges and opportunities, depending on the complexity and size of the structures. Filtration, precipitation/re-dissolution and size-exclusion chromatography (SEC) are potent technologies exploiting the size difference between product and impurities. In this study, we therefore investigated the integration of these technologies within a single unit operation, resulting in three different processes, one of which integrates all three technologies. VLPs, contained in clarified lysate from Escherichia coli, were precipitated by ammonium sulfate, washed, and re-dissolved in a commercial cross-flow filtration (CFF) unit. Processes were analyzed for yield, purity, as well as productivity and were found to be largely superior to a reference centrifugation process. Productivity was increased 2.6-fold by transfer of the wash and re-dissolution process to the CFF unit. Installation of a multimodal SEC column in the permeate line increased purity to 96% while maintaining a high productivity and high yield of 86%. In addition to these advantages, CFF-based capture and purification allows for scalable and disposable DSP. In summary, the developed set-up resulted in high yields and purities, bearing the potential to be applied as an integrated process step for capture and purification of in vivo-assembled VLPs and other protein nanoparticles.
- Published
- 2020
- Full Text
- View/download PDF
21. On-Demand Production of Flow-Reactor Cartridges by 3D Printing of Thermostable Enzymes
- Author
-
Maier, Manfred, Radtke, Carsten P., Hubbuch, Jürgen, Niemeyer, Christof M., and Rabe, Kersten S.
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2018
22. Piezoelectric Silicon Micropump for Drug Delivery Applications
- Author
-
Bußmann, Agnes, Leistner, H., Zhou, D., Wackerle, M., Congar, Y., Richter, M., and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
3. Good health - Abstract
Subcutaneous injection is crucial for the treatment of many diseases. Especially for regular or continuous injections, automated dosing is beneficial. However, existing devices are large, uncomfortable, visible under clothing, or interfere with physical activity. Thus, the development of small, energy efficient and reliable patch pumps or implantable systems is necessary and research on microelectromechanical system (MEMS) based drug delivery devices has gained increasing interest. However, the requirements of medical applications are challenging and especially the dosing precision and reliability of MEMS pumps are not yet sufficiently evaluated. To enable further miniaturization, we propose a precise 5 × 5 mm2 silicon micropump. Detailed experimental evaluation of ten pumps proves a backpressure capability with air of 12.5 ± 0.8 kPa, which indicates the ability to transport bubbles. The maximal water flow rate is 74 ± 6 µL/min and the pumps’ average blocking pressure is 51 kPa. The evaluation of the dosing precision for bolus deliveries with water and insulin shows a high repeatability of dosed package volumes. The pumps show a mean standard deviation of only 0.02 mg for 0.5 mg packages, and therefore, stay below the generally accepted 5% deviation, even for this extremely small amount. The high precision enables the combination with higher concentrated medication and is the foundation for the development of an extremely miniaturized patch pump.
23. Membrane chromatography - high throughput screening and simulative process develoopment
- Author
-
Stein, Dominik Marcel, Hubbuch, Jürgen, and Franzreb, Matthias
- Subjects
platform development ,Chemical engineering ,monoclonal antibody aggregate removal ,membrane chromatography ,digital twin ,ddc:660 ,membrane adsorber ,living process library ,mechanistic modeling ,high throughput screening - Abstract
Die in dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen liefern einen Beitrag im Bereich der biopharmazeutischen Prozessentwicklung und Produktion, im Speziellen für die chromatographische Aufreinigung. Bedingt durch die weltweite SARS-CoV-2 Pandemie stand die biopharmazeutische Industrie im Mittelpunkt des Medieninteresses. Dies führte zu einer öffentlichen Diskussion der Entwicklung und Herstellung von biopharmazeutischen Produkten. Aufgrund des dringlich benötigten Impfstoffes sind auch die benötigten Prozessentwicklungszeiten dieses erörtert worden. Die schnelle Bereitstellung eines wirksamen Arzneimittels bzw. Impfstoffes unter Einhaltung der behördlichen Anforderungen erfordert eine modernisierte und effizientere Entwicklung. Hierbei birgt eine einseitige Fokussierung auf die reine Reduktion der Entwicklungszeit eines Prozesses jedoch Nachteile und Risiken. Die Effizienzsteigerungspotentiale ergeben sich vor allem aus Wissensmanagement bei der Übertragung von bekannten Prozessentwicklungen wodurch Neuentwicklungen durch vorhandenes Wissen beschleunigt werden können. Des Weiteren besteht das Risiko bei eine reinen Zeitfokussierung, dass neuer/alternativer Herstellungsverfahren vernachlässigt werden und die langfristige Wettbewerbsfähigkeit nicht gegeben ist. Im Allgemeinen ist der pharmazeutische Aufreinigungsprozess in den vorgelagerten Upstream- (USP) und den daran angeschlossenen Downstream Prozess (DSP) unterteilt. Der USP verfolgt den optimalen Zellklon bzw. die optimalen Zellproduktionsbedingungen, wodurch eine stabile und hohe Produktivität erreicht wird. Im Gegensatz konzentriert sich das DSP auf die Produkt- und die Verunreinigungsprofile mit dem Ziel, eine hohe Reinheit und Ausbeute des Produktes zu erhalten. Aufgrund des hohen Standardisierungsgrades und der verfügbaren Informationen eignet sich die Herstellung von monoklonalen Antikörpern als Beispiel für einen Plattformprozess. Dieser Prozess umfasst im UPS die Vorbereitung von Kulturen und Zellen sowie die Herstellung des Wirkstoffes in einem Fermenter. Anschließend erfolgt die Aufreinigung des Produktes im DSP durch die Zellabtrennung, zwei bis drei Chromatographieschritte, Virusinaktivierung und einen eventuellen Pufferaustausch. Dem angeschlossen folgt die Virus- und Sterilfiltration in Vorbereitung auf die Abfüllung. Das derzeitige Verfahren in der chromatographischen Prozessentwicklung ermöglicht den Maßstabstransfer vom Labor zur Produktion durch verschiedene Ansätze. Diese Ansätze beruhen auf experimentellen Informationen, Expertenwissen sowie mechanistischer und/oder statistischer Modellierung. Die Prozessentwicklung gliedert sich in eine erste statische Untersuchung, eine detailliertere dynamische Leistungsuntersuchung und Experimente. Das grundsätzliche Ziel ist eine erfolgreiche Ergebnisübertragung in den Produktionsmaßstab. In frühen Entwicklungsstadien stehen der Prozessentwicklung meist nur sehr geringe Mengen des potenziellen Wirkstoffes zur Verfügung. Dementsprechend werden die statischen Untersuchungen entweder manuell oder durch robotergestützte Pipettierschritte im Kleinstmaßstab durchgeführt. Dem angeschlossen werden in Performance-Untersuchungen die ersten dynamischen Effekte ermittelt, typischerweise in automatisierten Robotersäulen im Mikrolitermaßstab. Bei ausreichender Verfügbarkeit werden detaillierte Experimente im Milliliter-Maßstab mit Flüssigchromatographie-Systemen im Labormaßstab durchgeführt. Die Laborsysteme weisen bereits einen mit der Produktion vergleichbaren Automatisierungsgrad auf. Dementsprechend bieten die detaillierten Experimente in der Regel die Grundlage für den Transfer in den Pilot- oder Produktionsmaßstab. In aktuellen Studien wird der Entwicklungsprozess häufig durch mechanistische Modellierung (MM) unterstützt. Das Ziel dieser Arbeiten ist eine theoretische Repräsentation des betrachteten Schrittes unter Bildung eines digitalen Zwillings. MM bietet die Möglichkeit, zusätzliche Informationen über Eingangsstoffe, stationäre Phasen, Geräte und Prozessführungen zu generieren. Auf diese Weise könnte MM die heute bekannten Prozessentwicklungsansätze miteinander verbinden, zusammenfassen und eine lebende Prozessbibliothek schaffen. Eine solche Bibliothek könnte das Wissen aus verschiedenen Prozessen bündeln und auf neue Fragestellung übertragen. Durch eine solche Transferleistung würden sich Zeit- und Kostenaufwand reduzieren. Die Entwicklung einer lebendigen Prozessbibliothek erfordert gleiche Untersuchungsansätze für alle stationären Phasen. Aufgrund der historischen Entwicklung besteht ein Ungleichgewicht zwischen partikulären/harzbasierter basiert Chromatographie und anderen stationären Phasen. Diese zumeist relativ neuen stationären Phasen werden nur selten für neue experimentelle Aufbauten, Prozessführungen und mechanistischen Modellierungsansätzen diskutiert. In der vorliegenden Arbeit wird ein monoklonaler Antikörper-Aufreinigungsprozess zur Aggregatabtrennung untersucht. Hierbei wird zunächst die Angleichung der Prozessentwicklungsmethoden zwischen diffusiven harzbasierten- und konvektiven Membranadsorbern (MA) als stationäre Phasen angestrebt. Dafür wird zunächst ein Aufbau für ein Hochdurchsatz-Screening entwickelt und mittels mechanistischer Modellierung die Ausarbeitung eines digitalen Zwillings angestrebt. In vier maßgeblichen Fallstudien werden die unterschiedlichen Prozessentwicklungsansätze für konvektive stationäre Phasen an jene der partikulären Chromatographie angeglichen. Hierbei werden folgende Bereiche untersucht: Bestimmung des Prozessparameterbereichs, Einbeziehung neuer Prozessführungen, Vergleichbarkeit unterschiedlicher stationärer Phasen und Skalierbarkeit. Für die Untersuchung konvektiver stationärer Phasen wie MA, welche typischerweise einen hohen Stofftransport und geringen Druckverlust im Modul aufweisen, wurde ein HTS Modul im Kleinstmaßstab für eine skalierbare Prozessentwicklung entwickelt. Die Untersuchung fokussierte sich auf die Entfernung von Aggregaten aus einer fermentierten monoklonalen Antikörperlösung. Die erste Fallstudie untersucht die experimentelle Anwendung des entwickelten HTS-Aufbaus und -Moduls. Hierbei werden der klassische Bindungs- und Elutionsmodus unter Variation des pH-Wertes und der Salzkonzentration angewendet. Dadurch lassen sich die Prozessfenster für die untersuchten Ionenaustausch-MA Sartobind® S und Q ermitteln. Des Weiteren wird mit Hilfe mechanistischer Modellbildung ein digitaler Zwilling erarbeitet. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen den erfolgreichen HTS-Aufbau und den entwickelten digitalen Zwilling. Im Ergebnisvergleich mit einer flüssigchromatographiebasierten Systemauftrennung zeigte der digitale Zwilling eine Signalübereinstimmung von über 80%. Des Weiteren wird für eine Maßstabsübertragung eines 0.42 mL Moduls auf ein 800 mL Modul eine Vorhersagegenauigkeit der dynamischen Durchbruchskonzentration von 90 % erzielt. Im Rahmen der Angleichung von konvektiven zu harzbasierten stationären Phasen ist in der zweiten Fallstudie die Abbildbarkeit von neuen Prozessführungen untersucht worden. Unterstützt durch mechanistische Modellierung wurden zwei verschiedene Trennungen auf kompetitive Adsorption untersucht. Darauf aufbauend wurde ein neuartiges HTS-Screeningmethode entwickelt. Dieses Verfahren ermöglicht die Bestimmung von Verdrängungseffekten durch kompetitive Adsorption und liefert Schlüsselgrößen zur Identifizierung dieser. Die Untersuchungsmethode wird Überladungs- und Elutionsverfahren (overload and elute mode, OBE) genannt und ebenfalls in der Aggregatabtrennung mit Sartobind® S untersucht. Basierend auf der im HTS angewandten OBE-Methode lassen sich sowohl klassische als auch dynamische Effekte bestimmen. Die Einführung des Verdrängungsidentifikators (displacement identifier, DI) ermöglicht eine Visualisierung von Verdrängungseffekten in einer Prozessparameterkarte. Auf Grundlage dieser Ergebnisse werden die Verdrängungseffekte in einem Recyclingexperiment angewendet. Dieses Recyclingexperiment weist durch die Ausnutzung der Verdrängungseffekte eine 45 % Reduktion der IgG- und 88 % höher Aggregatbindungskapazität im Vergleich mit einem einfachen FT-Prozess auf. Die zuvor angeführten Arbeiten haben die Unterschiede zwischen harzbasierten und konvektiven stationären Phasen reduziert. Dementsprechend erfolgten in der dritten Fallstudie die Untersuchung und der Vergleich von unterschiedlichen stationären Phasen. Hierbei wird eine Strategie zur Bewertung verschiedener Kombinationen von stationären Phasen, deren Grundgerüsten und Liganden, vorgestellt. Diese Strategie gewährleistet für die Erstellung einer Lebenden Prozessentwicklungsbibliothek die Untersuchung und Auswahl von passenden stationären Phasen. In dieser Fallstudie werden entwickelte Strategien an neuartigen MA behandelt, welche verschiedene chromatographische Effekte kombinieren (Mixed Mode, MiMo). Die Strategie beinhaltet theoretische Überlegungen sowie Untersuchungen der optimalen stationären Phasen hinsichtlich ihrer Selektivität und Bindungskapazität. Anhand der theoretischen Überlegungen lässt sich der experimentelle Raum, die möglichen Kombinationen aus stationären Phasen, deren Grundgerüst und Liganden reduzieren. Dafür wird jeder potenzielle MiMo MA Kandidat auf sein Potential zur Reduktion von Aggregaten in einer mAb Lösung untersucht und mit der Leistung der harzbasierten stationären Phase Capto™ Adhere verglichen. Die vorgestellte Strategie reduziert in einem frühem Untersuchungszeitpunkt die Reduktion von drei auf zwei mögliche stationäre Phasen reduzieren. Unter Berücksichtigung des untersuchten Einflusses der Ionenkapazität lässt sich ein finaler Kandidat ermitteln. Hierbei zeigt der Kandidat eine um 2 bis 3 Membranvolumen höhere Bindungskapazität als die Referenz Capto™ Adhere. Unter Verwendung der vorgestellten Strategie und Einbindung in eine Lebende Prozessbibliothek lassen sich zeiteffizient optimale stationäre Phasen identifizieren. Komplettiert wird die Arbeit in der letzten Fallstudie durch eine anwenderorientierte Maßstabsübertragung mittels mechanistischer Modellierung. Diese Arbeit beschreibt die typischen Modellierungsschritte mit Fokus auf der Maßstabsübertragung. Hierbei wird in der fluiddynamischen Beschreibung im Speziellen auf die Untersuchung und Optimierung von verschiedenen Modulen und deren Maßstabsübertragung eingegangen. Abweichend von der klassischen Isothermen-Parameterbestimmung werden historische HTS Daten verwendet, um die Isothermen-Parameter abzuschätzen. Dieses Vorgehen ermöglich in einem Lebenden Bibliotheksansatz die Inklusion von historischen Daten. Abgeschlossen wird die Fallstudie durch die Maßstabsübertrag eines axial durchströmten 0,46 mL HTS-Moduls zu einem 150 mL radial durchströmten Modul im Pilotmaßstab. Abschließend liefert diese Arbeit ein Verfahren zur Optimierung der Prozessentwicklung. Die verschiedenen Ansätze der Prozessentwicklung können in einem Lebenden Bibliothekansatz zusammengeführt werden. Dieser Bibliothekansatz umfasst Expertenwissen, Experimente sowie statistische und mechanistische Modellierung. In diesem Bestreben wurden zwischen harzbasierten und konvektiven stationären Phasen gleiche Wettbewerbsbedingungen geschaffen. Diese Vergleichbarkeit ermöglicht eine direkte Auswahl der stationären Phasen für eine bestimmte Trennaufgabe. Die anwenderorientierte Maßstabsübertragung bietet einen Leitfaden, wie durch mechanistische Modellierung die unterschiedlichen Prozessentwicklungsansätze zusammengeführt werden können. In dieser Arbeit zeigt die mechanistische Modellierung, wie der Prozessentwicklungsprozess abgebildet, transferiert, konserviert und standardisiert werden kann. Dadurch entsteht ein kohärentes und übertragbares Verfahren zur Verfügung, wodurch die anstehenden Herausforderungen in der Prozessentwicklung überwunden werden können.
- Published
- 2023
- Full Text
- View/download PDF
24. Additive Manufacturing in Biotechnology : Methods, Inks and Analytics for Biocatalytic Applications of Extrusion-Based 3D Bioprinting
- Author
-
Wenger, Lukas Fabian, Hubbuch, Jürgen, and Rapp, Bastian E.
- Subjects
3D Printing ,Chemical engineering ,Additive Manufacturing ,ddc:660 ,Bioprinting ,Biocatalysis - Abstract
In den letzten zehn Jahren hat sich die Additive Fertigung (AM) von einer spezialisierten Nischenanwendung zu einem weit verbreiteten Standardwerkzeug entwickelt, das in vielen Bereichen der Forschung und Industrie unverzichtbar geworden ist. Dank neuer Technologien und Materialien, die die Herstellung hochwertiger Produkte ermöglichen, ist AM nicht nur für das schnelle Anfertigen von Prototypen relevant, sondern auch für die Herstellung von Produkten für Endverbraucher. Vor allem bei Produkten mit hohem Bedarf für kundenspezifische Anpassungen oder bei Produkten mit hoher geometrischer Komplexität können AM-Methoden als sinnvolle Alternative zu anderen Fertigungsverfahren in Betracht gezogen werden. In der Medizin und Bioverfahrenstechnik wird AM typischerweise für Anwendungen wie die Herstellung von Zahnimplantaten und Zahnschienen oder für maßgeschneiderte Laborgeräte, mikrofluidische Systeme und sogar Chromatographiesäulen eingesetzt. Die Kombination von biologischen Materialien und lebenden Zellen mit AM-Methoden hat dazu geführt, dass sich das Bioprinting als eigenständiger Bereich mit neuen Möglichkeiten und Herausforderungen etabliert hat. Bioprinting-Methoden ermöglichen die Herstellung von Objekten aus weichen, wasserbasierten Materialien, die sich für den physikalischen Einschluss von Enzymen eignen. Dadurch können biokatalytische Reaktoren direkt mit enzymhaltigen Tinten gedruckt werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, neue Werkzeuge für die Herstellung biokatalytisch aktiver Materialien zu schaffen, wobei der Schwerpunkt auf extrusionsbasiertem Bioprinting liegt. Neuartige Tinten werden in Kombination mit speziell angepassten Druckmethoden etabliert, um eine verbesserte Druckbarkeit zu erreichen. Um die Eignung der verschiedenen Materialien hinsichtlich der resultierenden biokatalytischen Aktivität zu bewerten, werden mikroplattenbasierte Aktivitätsassays mit zwei verschiedenen Enzymen und einer Reihe von 3D-gedruckten Materialien durchgeführt. Die Tinten und Hydrogele werden mit einer Reihe weiterer Analysemethoden wie Rheologie, mechanischen Tests oder Rasterelektronenmikroskopie charakterisiert. Um die Durchlässigkeit von Hydrogelen für Substratmoleküle zu bestimmen, wird eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Abschätzung von Diffusionskoeffizienten in Hydrogelen entwickelt. Als allgemeiner Beitrag zur Verbesserung der Prozessüberwachung und -steuerung beim extrusionsbasierten Bioprinting wird eine PID-basierte Drucksteuerung etabliert, um einen konstanten und reproduzierbaren Tintenfluss zu erzeugen. In einer ersten Studie wurde ein neuartiges Materialsystem für das Drucken enzymatisch aktiver Strukturen etabliert, indem hochkonzentrierte Emulsionen (high internal phase emulsions -- HIPEs) als Tinten verwendet wurden. HIPEs sind Emulsionen, die mindestens 74 % (v/v) an innerer Phase enthalten, was der dichtesten möglichen Packung von Tröpfchen entspricht, bevor eine Verformung eintritt. Als äußere Phase der HIPEs wurden polymerisierbare ölige Monomere verwendet und der wässrigen inneren Phase wurden Poly(ethylenglycol)diacrylat und Acrylsäure zugesetzt. Auch öl- bzw. wasserlösliche Photoinitiatoren wurden den jeweiligen Phasen zugesetzt. Die Polymerisation der Tinten führte zur Bildung eines offenporigen Polymergerüsts, das mit untereinander vernetzten Hydrogeltröpfchen gefüllt ist. Dieser Ansatz ermöglicht die Herstellung von Kompositmaterialien mit hydrogelähnlichen Eigenschaften wie der Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle bei gleichzeitig höherer mechanischer Stabilität aufgrund der stützenden Wirkung des Polymergerüsts. Tinten für den extrusionsbasierten 3D-Druck als Emulsionen zu formulieren bringt deutliche Vorteile hinsichtlich der rheologischen Eigenschaften der Tinten, da Emulsionen aufgrund ihrer Fließgrenze ideal für Extrusionsdruck geeignet sind. Um die Herstellung kleiner Volumina von HIPEs zu ermöglichen, wurde ein maßgeschneiderter Aufbau auf der Grundlage eines 3D-gedruckten spiralförmigen Rührblatts entwickelt, der die Herstellung von HIPEs in 50-mL-Falcon-Röhrchen ermöglichte. Durch die Minimierung von Materialverlust erlaubte die Produktion in kleinem Maßstab die Zugabe des Enzyms β-Galactosidase. Rheologische Messungen mit einer Reihe verschiedener HIPE-Zusammensetzungen zeigten, dass HIPEs mit einem hohen Anteil an Tensid in der äußeren Phase und mit einem hohen Volumenanteil an innerer Phase eine höhere Fließgrenze aufwiesen, was als Indikator für Druckbarkeit gilt. Im Allgemeinen wiesen die hergestellten HIPEs hervorragende rheologische Eigenschaften auf. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass sowohl die äußere, als auch die innere Phase der HIPEs polymerisiert werden konnte. Ein Versuchsaufbau mit vier um die Extrusionskanüle des Biodruckers herum angeordneten UV-LEDs wurde entwickelt, um die Polymerisation der Tinten während der Extrusion zu ermöglichen, was das Zerlaufen des Materials reduziert und so die Druckqualität weiter verbessert. Es wurden Hohlzylinder mit enzymhaltiger Tinte gedruckt, um Aktivitätsmessungen in 48-Well-Mikroplatten durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten, dass die HIPEs biokatalytisch aktiver waren, wenn sie große Mengen an Monomer in der wässrigen Phase und einen hohen Volumenanteil an wässriger Phase enthielten. Die Anwesenheit von mindestens 7 % (v/v) Monomer in der wässrigen Phase führte zu einer mehr als fünffachen Steigerung der gemessenen Aktivität im Vergleich zu HIPEs ohne Monomer in der wässrigen Phase. Der Durchmesser der Extrusionskanüle konnte als weiterer wichtiger Parameter identifiziert werden, der die resultierende Aktivität beeinflusst. Diese Beobachtung könnte auf die durch das Trägermaterial bedingte Verringerung des Stofftransports zurückzuführen sein, die ein hohes Verhältnis von Oberfläche zu Volumen allgemein vorteilhaft macht. Um ein breiteres Spektrum an Tintentypen abzudecken, wurden in der zweiten und dritten Studie dieser Arbeit Tinten auf der Basis von Agarose und Agar untersucht. Diese Tinten wiesen im Vergleich zu HIPEs deutlich andere Materialeigenschaften auf, sowohl im flüssigen Zustand als Tinte, als auch im verfestigten Zustand als Hydrogel. Um den Anforderungen dieser Tinten gerecht zu werden, wurden der Versuchsaufbau für den Druck und die eingesetzten Analyseverfahren speziell an die untersuchten Tinten angepasst. Die Durchlässigkeit für Substrat- und Produktmoleküle wurde als eine der wichtigsten Eigenschaften der Materialien hinsichtlich ihrer Eignung für die Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Daher wurde eine auf Mikrofluidik basierende Methode zur Schätzung des Diffusionskoeffizienten eines Analyten in transparenten Hydrogelen entwickelt. Ein mikrofluidischer Chip mit drei Einlässen und einer Y-Verzweigung wurde verwendet, um eine Grenzfläche zwischen dem zu untersuchenden Hydrogel und einer Analytlösung zu schaffen. Zu diesem Zweck wurde flüssige Tinte bei erhöhter Temperatur von einer Seite in den Chip injiziert, bis sie die Y-Verzweigung erreichte. Nach dem Ausgelieren der Tinte wurde die Analytlösung durch einen der anderen Einlässe injiziert und die Diffusion des Analyten durch das Hydrogel wurde mit einem UV-Flächendetektor überwacht. Die Diffusionskoeffizienten konnten durch das Fitten der gemessenen Konzentrationsprofile des Analyten entlang des mikrofluidischen Kanals mit einer analytischen Lösung des zweiten Fick'schen Diffusionsgesetzes geschätzt werden. In einer Fallstudie wurde der Diffusionskoeffizient von Lysozym in einer Reihe von Hydrogelen bestimmt und verglichen. Die untersuchten Hydrogele bestanden aus unterschiedlichen Konzentrationen von unmodifizierter Agarose bzw. modifizierter Hydroxyethylagarose mit niedrigem Schmelzpunkt. Es wurde festgestellt, dass der Diffusionskoeffizient von 5(6)-Carboxyfluorescein in unmodifizierten Agarosehydrogelen etwas höher war als in Agarosehydrogelen mit niedrigem Schmelzpunkt. Dies stimmt gut mit der theoretischen Vorhersage überein, dass das Polymernetzwerk von Hydrogelen aus Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt kleinere Porengrößen aufweist. Der gleiche Trend wurde für die Polymerkonzentration festgestellt, wobei höhere Konzentrationen mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten und kleineren Poren einhergingen. In einer dritten Studie wurden Tinten auf Basis von Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt und Agar als weniger komplexe Alternative zu Tinten auf HIPE-Basis untersucht. Das Gelierungsverhalten von Agarose- und Agarbasierten Tinten erforderte einen anderen Versuchsaufbau für den Druck als die photopolymerisierbaren HIPEs. Eine beheizbare Düse, bestehend aus einem 3D-gedruckten Metallkörper, einem Temperatursensor und einem Heizdraht, wurde in den Aufbau implementiert, um sicherzustellen, dass die Tinten in flüssigem Zustand bei einer definierten Temperatur extrudiert werden konnten. Die Tinten wurden auf ein gekühltes Substrat extrudiert, um den Gelierungsprozess zu beschleunigen und das Zerlaufen der Tinte zu reduzieren. Obwohl das individuell an die Tinten angepasste Equipment die Druckbarkeit im Vergleich zu früheren Studien mit agarosebasierten Tinten deutlich verbesserte, war sie der Druckbarkeit von HIPEs immer noch drastisch unterlegen, sowohl hinsichtlich der erzeugten Strangdicke, als auch bzgl. der erreichbaren geometrischen Komplexität. Es konnten nur einfache Gitterstrukturen ohne Überhänge gedruckt werden. Eine Polymerkonzentration von mindestens 4,5 % (w/w) erwies sich als vorteilhaft für den Druck, wobei Gitterstrukturen mit einer Höhe von 2 cm druckbar waren. Mit rheologischen Methoden wurden die Tinten auf ihre Fließeigenschaften sowie ihr Schmelz- und Gelierverhalten untersucht. Die Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt zeigte im Vergleich zu den Agartinten wie erwartet deutlich reduzierte Gelier- und Schmelztemperaturen. Die verfestigten Hydrogele wurden einer mechanischen Prüfung unterzogen. Eine Reihe der in den vorherigen Studien etablierten Analysemethoden wurden erneut angewandt, um die Hydrogele auf Agarose- und Agarbasis im Hinblick auf ihre Anwendung für die Immobilisierung von Enzymen zu bewerten. Zu diesem Zweck wurde den Tinten vor dem Druck das thermostabile Enzym Esterase 2 aus Alicyclobacillus acidocaldarius zugegeben. Zur Messung der enzymatischen Aktivität und des Auswaschens von Enzym aus den gedruckten Hydrogelproben wurden mikrotiterplattenbasierte Aktivitätsassays verwendet. Die mikrofluidikbasierte Methode zur Bestimmung von Diffusionskoeffizienten wurde eingesetzt, um die Durchlässigkeit der Hydrogele für 5(6)-Carboxyfluorescein zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die agarbasierten Hydrogele eine höhere Diffusionsfähigkeit und Aktivität aufwiesen, aber auch eine erhöhte Auswaschung von Enzym. Die Tendenz zum Auswaschen des Enzyms zeigte nicht nur die mangelnde Eignung von agarbasierten Hydrogelen für den Einsatz in durchströmten Reaktoren, sondern erklärt auch die scheinbar positiven Ergebnisse bei den durchgeführten Aktivitätsassays, da das ausgewaschene Enzym nicht mehr denselben Stofftransportbeschränkungen ausgesetzt ist wie immobilisiertes Enzym und dadurch eine höhere Aktivität aufweist. Aufgrund der geringen Auswaschung von Enzym und der akzeptablen Druckbarkeit wurden Agarosetinten mit einer Konzentration von mindestens 4,5 % (w/w) als geeignete Tinten für die Anwendung in biokatalytischen Reaktoren empfohlen. Unabhängig vom Tintentyp zeigten die bisherigen Studien einen allgemeinen Mangel an Reproduzierbarkeit bei pneumatischen Bioprinting-Verfahren, der auf schwankende und schlecht reproduzierbare Flussraten bei der Extrusion der Tinten zurückzuführen ist. Es wurde vermutet, dass neben der Viskosität der Tinte und dem Extrusionsdruck noch zusätzliche Faktoren wie der Füllstand der Kartusche, die teilweise Verstopfung der Düsen und Inhomogenitäten der Tinte die Extrusionsflussrate beeinflussen und Unregelmäßigkeiten in den Druckergebnissen verursachen. Unterschiede zwischen verschiedenen Tintenchargen und Temperaturschwankungen, die die Viskosität der Tinte beeinflussen, stellten eine zusätzliche Herausforderung dar. In der Studie zu agarose- und agarbasierten Tinten wurde jede gedruckte Probe gewogen, bevor sie für Aktivitätsmessungen verwendet wurde, und verworfen, wenn sie das vorgegebene Zielgewicht nicht innerhalb einer bestimmten Fehlertoleranz erreichte. Falls erforderlich, wurde der Extrusionsdruck manuell angepasst, um die Vergleichbarkeit der gedruckten Proben zu gewährleisten. Infolgedessen wurde eine Studie initiiert, um eine Inline-Prozessüberwachung für die Durchflussrate als wesentlichen Prozessparameter zu etablieren und eine automatisierte und reproduzierbare Methode zu entwickeln, um eine konstante Zielflussrate zu erzeugen, indem der Extrusionsdruck auf der Grundlage von Echtzeitflussdaten kontinuierlich angepasst wird. Um die benötigten Daten in einer Inline-Messung zu erhalten, wurde ein Durchflusssensor in den Aufbau eines pneumatischen Biodruckers mittels einer 3D-gedruckten Halterung integriert. Für die Kommunikation mit dem Flusssensor und die Verarbeitung der gemessenen Daten wurde ein auf Python basierendes Softwaretool entwickelt. Eine PID-Regelung wurde implementiert und mit den Echtzeit-Durchflussdaten gespeist. Auf Grundlage der eingespeisten Daten passte die Software den Extrusionsdruck des Druckers kontinuierlich an. Es wurden drei verschiedene Fallstudien durchgeführt, um die Leistung der PID-Regelung zu bewerten: a) Kontinuierliche Extrusion: Mehrere Durchläufe mit kontinuierlicher Extrusion zeigten, dass die automatische Druckanpassung erfolgreich eine vorgegebene Zielflussrate unabhängig vom Benutzer einstellen konnte. Im Vergleich zur konstanten Druckeinstellung erwies sich die adaptive Druckregelung als effektiv bei der Kompensation von umwelt- oder systembedingten Einflüssen wie Verstopfungen der Extrusionskanüle. b) Anpassung an Tinteninhomogenitäten: Ein realistischerer Anwendungsfall wurde untersucht, indem Hohlzylinder mittels einer Kartusche gedruckt wurden, die mit Schichten aus zwei unterschiedlich konzentrierten Poloxamer-407-Tinten gefüllt war, um Tinteninhomogenitäten zu simulieren. Die adaptive Druckregelung erwies sich als wirksam, eine konstante Durchflussrate zu erzeugen, indem der Druck während des Druckvorgangs entsprechend angepasst wurde. Dadurch konnten relativ gleichmäßige Zylinder gedruckt werden, während die konstante Druckeinstellung zu Zylindern mit stark voneinander abweichenden Wandstärken führte. c) Prozessübertragung auf andere Düsentypen: Um die Übertragbarkeit von Prozessen zwischen verschiedenen Versuchsaufbauten zu demonstrieren, wurden Testdrucke mit drei verschiedenen Typen von Extrusionskanülen mit gleichem Öffnungsdurchmesser durchgeführt. Die adaptive Druckregelung war in der Lage, mit allen drei Extrusionskanülen innerhalb von 30 bis 60 s die gewünschte Zielflussrate zu erzeugen. Die resultierenden Zylinder waren von gleichbleibender Qualität, unabhängig von der Kanüle. Beim Drucken mit konstanter Druckeinstellung wurde entweder zu wenig oder zu viel Tinte extrudiert, wenn der Druck nicht speziell für den entsprechenden Typ von Kanüle festgelegt wurde. Es wurde gezeigt, dass die PID-gesteuerte adaptive Druckregelung dazu beitragen kann, das extrusionsbasierte Bioprinting zuverlässiger zu machen und die Notwendigkeit umfangreicher Parameter-Screenings bei der Prozessentwicklung zu verringern. Die vorliegende Arbeit demonstriert neue Methoden für das Drucken von biokatalytisch aktiven Materialien. Es werden neuartige Tinten mit individuell angepassten Druckverfahren und analytischen Techniken vorgestellt. Die Anwendung von emulsionsbasierten Tinten zeigt die große Bandbreite an Materialien, die in Kombination mit Enzymen eingesetzt werden können. Materialscreenings können durch den Einsatz von Aktivitätsassays im Mikrotiterplattenformat beschleunigt werden. Die speziell für jede Tintenart angepassten Druckmethoden zeigen die Notwendigkeit einer Feinabstimmung zwischen Tinte und Druckverfahren. Der universelle Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit im pneumatischen Bioprinting unter Verwendung einer PID-basierten Druckregelung könnte auch für Anwendungen außerhalb der Biokatalyse von Nutzen sein.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
25. Biomedical Application of Piezoelectric Micro Diaphragm Pumps
- Author
-
Bußmann, Agnes Beate and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
26. Incorporation of Carbon-based Nanoparticles in Ultrafiltration Membranes to Remove Steroid Hormone Micropollutants
- Author
-
Nguyen, Minh Nhat, Schäfer, Andrea Iris, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Life sciences ,biology ,liquid chromatography - organic carbon detection ,single-walled carbon nanotube ,interplay of forces ,ddc:570 ,nanofiltration ,ultrafiltration ,vertically-aligned carbon nanotube ,mass transfer ,membrane ,adsorption surface - Abstract
Mikroverunreinigungen (insbesondere Steroidhormone) sind besorgniserregende Verbindungen in Oberflächengewässern und Abwässern, die zu einem erhöhten Risiko für Probleme mit dem Fortpflanzungssystem, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Krebs beim Menschen führen. Die Membrantechnologie ist eine gute Lösung, um diese Verbindungen zu entfernen, aber die effektiven Behandlungen (Nanofiltration und Umkehrosmose) sind kostspielig, da viel Energie erforderlich ist, um den Druck auf 5 bis 60 bar zu erhöhen. Ultrafiltration (UF) ist eine kostengünstigere Lösung und kann in Verbindung mit adsorptiven Materialien eine gute Entfernung von Steroidhormonen ermöglichen. Die Möglichkeit, diese Mikroverunreinigungen mit adsorptiven Komposit-Membranen zu entfernen, ist das Hauptziel dieser Doktorarbeit. In solchen adsorptiven Komposit-Membranen ist die hydraulische Verweilzeit von Wasser und gelösten Stoffen kurz (unter einer Minute), im Gegensatz zu den Verweilzeiten (oder Kontaktzeiten) in Adsorbern oder Kontaktoren mit Aktivkohle. Außerdem gibt es bei solchen kompakten Membranen eine Kapazitätsgrenze (das ist die maximale Menge an Adsorptionsmittel pro Membranmenge). Daher müssen die Adsorptionsmittel im Vergleich zu Aktivkohle eine ausreichend große äußere Oberfläche haben, um die Stoffaustauschlimitierung zu minimieren. Kohlenstoffbasierte Nanopartikel (CNPs), wie mehr-/einwandige Kohlenstoff-Nanoröhren (MW-/SWCNTs), Graphen, Graphenoxid und Fulleren, sind vielversprechende Materialien für den Einbau in die UF-Membran. Eine hohe Oberfläche und ein guter Stoffaustausch garantieren jedoch keine gute Adsorption. Bei vertikal ausgerichteten Kohlenstoff-Nanoröhren (VaCNT)-Membranen erreicht das Hormon sofort die Wand der Poren mit nahezu idealer zylindrischer Form und weniger Tortuosität. Diese Membran adsorbiert sehr wenig Hormon, was durch die Kräfte erklärt werden kann, die auf das Hormonmolekül an der Oberfläche einwirken. Die Ziele sind es, die drei Hauptaspekte mit Komposit-Membranen zu untersuchen, die die Hormonadsorption bestimmen, nämlich i) Oberflächeneigenschaft des Adsorptionsmittels (Kapitel 4), ii) Stoffaustauschlimitierung bei kurzen Verweilzeiten (Kapitel 5) und iii) Zusammenspiel der Kräfte (Kapitel 7). Kapitel 6 untersucht weiter die Behinderung des Stoffaustausches, die durch organische Stoffe verursacht werden.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
27. Ein effizienteres Herstellungsverfahren für Liposomen aus Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen
- Author
-
Ullmann, Kirsten, Nirschl, Herrmann, and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Phospholipide ,DLS ,Du Noüy-Ring ,SAXS ,Tensiometrie ,Nanoemulsionen ,Chemical engineering ,Fluorocarbone ,ddc:660 ,Zentrifugation ,Einkapselungseffizienz ,Liposomen ,Spinning Drop Tensiometer - Abstract
Die Verabreichung von Wirkstoffen ohne einen vorzeitigen Abbau im Körper stellt in manchen pharmazeutischen Anwendungen eine Herausforderung dar. Untersuchungen von verschiedenen Transportsystemen wie Liposomen nehmen sich dieser Problematik an. Liposomen sind kugelförmige Vesikel, die aus einer Phospholipiddoppelschicht bestehen und Bestandteil von natürlichen Membranen sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und der Analyse eines neuen Herstellungsprozesses von Liposomen aus Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen für die pharmazeutische Anwendung. Der neue Prozess kommt ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln aus, sodass eine aufwendige Entfernung entfällt. Im Fokus der Arbeit liegen drei Schwerpunkte, die den wesentlichen Bestandteil des Prozesses ausmachen: Die Auswahl des passenden Stoffsystems, deren Charakterisierung mit geeigneten Analysemethoden und die Herstellung sowie Einkapselungseffizienz von Liposomen. Der erste Schwerpunkt liegt in der tensiometrischen Wechselwirkung zwischen der wässrigen und hydrophoben Phase. Als hydrophobe Phase kommt das Perfluorocarbon Perfluoroperhyd-rophenanthren zum Einsatz, welches aufgrund seiner inerten Eigenschaften für die pharmazeutische Anwendung zunehmend an Bedeutung gewinnt. An der Grenzfläche zwischen dem Perfluorocarbon und der wässrigen Phase lagern sich diffusionskontrolliert verschiedene Phospholipide an, die im Transferprozess als Baustein für die Doppelschicht der Liposomen dienen. Herausfordernd ist die Bestimmung der Grenzflächenspannung zwischen beiden Phasen, da hohe Dichteunterschiede und fast identische Brechungsindizes den Einsatz von visuellen Methoden wie der Tropfenprofilanalyse unmöglich machen. Gegensätzlich der zeitintensiven, nicht-invasiven Spinning Drop Tensiometrie liefert die invasive Du Noüy-Ring Methode effizienter reproduzierbare Ergebnisse. Die Analyse der Grenzflächen zwischen verschiedenen Phospholipid-Suspensionen und der hydrophoben Phase zeigt, dass die Dauer zum Erreichen der Gleichgewichts-Grenzflächenspannung mit zunehmender Länge der Fettsäurekette zunimmt. Dies zeigt sich insbesondere bei der minimal erreichbaren Grenzflächenspannung. Auch der Temperaturbe-reich beeinflusst den Adsorptionsprozess, da sich oberhalb der Übergangstemperatur der jeweiligen Phospholipide der Anlagerungsprozess an die Grenzfläche beschleunigt und Unterschiede zwischen den Fettsäureketten nicht mehr auszumachen sind. Im zweiten Abschnitt erfolgt die Herstellung der Nanoemulsionen über die Ultraschallemulgierung mit anschließender Tropfengrößenanalyse. Ähnliche Brechungsindizes zwischen hydrophober und hydrophiler Phase erschweren die Messung der Nanoemulsionströpfchen mittels dynamischer Lichtstreuung. Aufgrund des Eintrags von Gasblasen in das System ist der anzahlgewichtete Durchmesser als Vergleichswert direkt nach der Herstellung zu bevorzugen. Langzeitanalysen zeigen, dass unabhängig vom verwendeten Phospholipid eine Langzeitstabi-lität von mehreren Wochen bei einer Größe von < 200 nm zu erreichen ist. Die Ergebnisse mit Perfluoroperhydrophenanthren und der Vergleich mit anderen Fluorocarbonen zeigen, dass die Eigenschaften des Stabilisators weniger ins Gewicht fallen als die Eigenschaften des Fluorocarbons selbst. Eine geringere Dichte der hydrophoben Phase führt zu größeren Tropfen und einer höheren Polydispersität der Nanoemulsionen. Da die Tropfengröße der Nanoemulsionen im Zielbereich liegt, ist der Transfer zur Liposo-men-Herstellung als zweiter Verfahrensschritt möglich. Durch den Transfer entstehen Liposomen mit einer mittleren Größe von etwa 60 nm, welche sowohl mit der dynamischen Lichtstreuung als auch der Röntgenkleinwinkelstreuung gemessen sind. Fluoreszein-Natrium, Rinderserumalbumin und Fluoreszenz-markiertes Dextran kamen als Modellwirkstoffe zum Einsatz. Als Nachweismethode für deren Einkapselungseffizienzen dient die UV-Vis Spektroskopie. Unter Verwendung von Reinstwasser als hydrophile Phase und Fluoreszein-Natrium als niedrigmolekularem Wirkstoff ist eine Einkapselungseffizienz von bis zu 99% zu erreichen. Die hochmolekularen Modellwirkstoffe Rinderserumalbumin und Dextran erreichen eine Effizienz von bis zu 89% bzw. 98%. Der Zusatz von Salzen in der wässrigen Phase verschlechtert die Einkapselungseffizienz. Ebenso führen unterschiedliche osmotische Bedingungen innerhalb und außerhalb des Liposoms zu einem höheren Verlust der Markersubstanzen. Analog zur Herstellung von Nanoemulsionen zeigt sich, dass auch bei der Einkapselung Fluorocarbone mit einer geringeren Dichte weniger effizient Wirkstoffe einschließen. Die höchsten Einkapselungseffizienzen lassen sich mit einer Phospholipidkon-zentration zwischen 150 mM und 300 mM erzielen, während die Zugabe von Cholesterin als natürlicher Membranbestandteil eine Verschlechterung hinsichtlich der Einkapselungseffizienz bewirkt. Mit Perfluoroperhydrophenanthren als hydrophobem Phasenanteil gelingt die Herstellung stabiler Wasser-in-Fluorocarbon Nanoemulsionen. Der verfahrenstechnische Zentrifugationsprozess erlaubt die Produktion von Liposomen mit hohem Einkapselungsvermögen für verschiedene Wirkstoffe.
- Published
- 2022
28. Smart PAT concepts for the downstream process of biologics — Application of multimodal soft sensors, machine learning, and data fusion
- Author
-
Rolinger, Laura Maria, Hubbuch, Jürgen, and Guthausen, Gisela
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2022
29. Aerosol Thiol-ene Photopolymerization for the Synthesis of Nanostructures and their Biofunctionalization
- Author
-
Suvarli, Narmin and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
30. Science and Risk-Based Development of Ion Exchange Chromatography: Mechanistic Modeling and Advanced Statistics
- Author
-
Briskot, Till and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Published
- 2022
31. Digitalization of industrial downstream processing : Mechanistic and structure-based modeling
- Author
-
Saleh, David and Hubbuch, Jürgen
- Subjects
Chemical engineering ,ddc:660 - Abstract
Monoklonale Antik��rper (mAbs) und andere biologische Therapien kommen Millionen von Patienten zugute, die unter schwerwiegenden Krankheiten leiden. Das Spektrum der therapeutischen Bereiche, in denen Biologika eingesetzt werden, umfasst die Onkologie, die H��matologie, Entz��ndungskrankheiten und neuerdings auch Infektionskrankheiten wie die Coronavirus-Disease 2019 (COVID-19). Die Herstellung und Materialbereitstellung f��r pr��klinische und klinische Studien ist ein wichtiger Baustein in der Entwicklung eines therapeutischen Antik��rpers. MAbs und komplexe Antik��rperformate werden in Zellkulturprozessen, dem sogenannten Upstream Processing (USP), hergestellt. Das anschlie��ende Downstream Processing (DSP) zielt darauf ab, das Zielprotein aus der heterogenen Zellkulturfl��ssigkeit abzutrennen und zu reinigen. Das DSP von mAbs basiert auf dem Plattformkonzept. Aufgrund der strukturellen ��hnlichkeiten der verschiedenen mAb-Produkte erfolgt deren Aufreinigung in einer standardisierten Abfolge von Prozessschritten mit antik��rperspezifischer Anpassung von Prozessparametern. Hier wird h��ufig die Kationenaustauschchromatographie (CEX) als Polishing-Schritt eingesetzt, da sie in der Lage ist, produktbezogene Verunreinigungen, wie Gr����en- und Ladungsvarianten des mAb-Produkts, zu entfernen. Die Adsorption von Proteinen an chromatographischen Medien h��ngt von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der Ligandenstruktur und der Struktur des Zielproteins ab. W��hrend die pr��parative Chromatographie eine einzigartige Selektivit��t bei der Abreicherung von produkt- und prozessbedingten Verunreinigungen bietet, widerspricht die komplexe und zeitaufw��ndige Prozessentwicklung der urspr��nglichen Idee des Plattformkonzepts. Das Streben nach einer standardisierten Aufreinigung verschiedener Antik��rperprodukte wird zus��tzlich durch bispezifische und multispezifische Antik��rperformate erschwert, die die strukturelle Heterogenit��t der biopharmazeutischen Entwicklungspipelines erh��hen. Aufgrund der unbekannten Beziehungen zwischen Proteinstruktur und Adsorptionsverhalten st��tzen sich aktuelle Entwicklungsstrategien f��r die pr��parative Chromatographie auf Hochdurchsatz-Experimente (HTE) und statistische Versuchsplanung (DoE). Miniaturisierte HTE-Methoden erm��glichen die Untersuchung eines gro��en Parameterraums innerhalb eines kurzen Zeitrahmens, aber ihre Vergleichbarkeit mit dem Produktionsma��stab ist begrenzt. In den fr��hen Phasen der DSP-Entwicklung schr��nkt der st��ndige Mangel an Zeit und Proteinmaterial den Einsatz experimenteller Methoden weiter ein. In vielen F��llen sind DoE-Studien in Verbindung mit empirischer Response-Surface-Modellierung nicht in der Lage, die hochgradig nichtlinearen Beziehungen in der pr��parativen Chromatographie zu erfassen. Aufgrund der Vielzahl von Parametern, die sich potenziell auf die Produktqualit��t auswirken k��nnen, werden die in DoE-Studien untersuchten Prozessparameter h��ufig auf der Grundlage von Expertenwissen und einer unzureichenden Datenmenge ausgew��hlt. Eine falsche Auswahl von Prozessparametern kann zu unn��tigen Experimenten f��hren, die die Prozessentwicklung verz��gern, oder schlimmer, zu einem schlecht kontrollierten Herstellungsprozess, der nicht in der Lage ist, eine konstante Produktqualit��t zu gew��hrleisten. Mit der Quality by Design (QbD) Initiative fordern die Zulassungsbeh��rden ein klares Verst��ndnis der Zusammenh��nge zwischen Prozessparametern und Produktqualit��t. Die U.S. Food and Drug Administration (FDA) und andere Aufsichtsbeh��rden unterst��tzen ausdr��cklich die Verwendung mathematischer Modelle zur Entwicklung gut verstandener Herstellungsprozesse, die eine robuste Produktqualit��t und eine effiziente Marktversorgung erm��glichen. In den letzten Jahren wurden computergest��tzte Methoden auf der Grundlage von Homologiemodellierung, quantitativen Struktur-Eigenschafts-Beziehungen (QSPR), maschinellem Lernen und mechanistischer Chromatographiemodellierung entwickelt, um vielseitige Aufgaben in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung zu unterst��tzen. Mechanistische Chromatographiemodelle sind in der Lage, nichtlineare Beziehungen zwischen Prozessparametern und kritischen Qualit��tsattributen (CQAs) vorherzu-sagen. Die Proteinstruktur ist jedoch die eigentliche Ursache f��r die Funktionalit��t eines biologischen Arzneimittels. Diese Arbeit zielt darauf ab die Zusammenh��nge zwischen der Proteinstruktur und dem makroskopischen Prozessverhalten zu verstehen, um die strukturbasierte Vorhersage von CQAs f��r eine verbesserte Herstellung von biologischen Arzneimitteln zu erm��glichen. Die vorliegende Arbeit besteht aus f��nf Manuskripten, die sich mit der Erstellung von strukturbasierten und mechanistischen Modellen f��r die rationalisierte DSP Entwicklung von therapeutischen Antik��rpern befassen. Dies erfordert ein verbessertes Verst��ndnis der Beziehungen zwischen der Proteinstruktur und den makroskopischen Parametern der Adsorptionsisotherme. Lernalgorithmen sollen mit einem umfassenden Datensatz trainiert und validiert werden, der strukturelle Deskriptoren und Isothermenparameter von therapeutischen Antik��rpern enth��lt, die f��r biopharmazeutische Entwicklungspipelines re-pr��sentativ sind. Es sollen effiziente Methoden zur Modellkalibrierung, -validierung und \textit{in silico} Prozesscharakterisierung entwickelt werden, die den QbD-Richtlinien gerecht werden. Die Kombination von Homologiemodellierung, QSPR-Modellierung und mechanistischer Chromatographiemodellierung in einem holistischen \textit{in silico}-Werkzeug soll den Weg von der Aminos��uresequenz des Antik��rperkandidaten zu einem robusten Produktionsprozess weisen. Das erste Manuskript dieser Arbeit untersuchte den Einfluss von Aminos��uresubstitutionen in der Complementary Determining Region (CDR) eines IgG1 mAb auf sein Elutionsverhalten in der pr��parativen CEX Chromatographie. Die Aminos��uresubstitutionen wurden eingef��hrt, um die biophysikalischen Eigenschaften des mAb zu beeinflussen, indem oberfl��chenexponierte hydrophobe und geladene Bereiche ver��ndert wurden. Zus��tzliche positiv geladene Gruppen in den CDR der leichten Kette (L) und der schweren Kette (H) der mAb-Varianten f��hrten zu einem erh��hten Retentionsvolumen bei der linearen Salzgradientenelution im Vergleich zum urspr��nglichen Antik��rper. Die Substitution von Tryptophan durch Lysin in der H-CDR3 erh��hte die Ladungsheterogenit��t des Produkts und f��hrte zu einer signifikanten Erh��hung des Elutionspoolvolumens. Eine multiskalige \textit{in silico}-Analyse, bestehend aus Homologiemodellierung, Proteinoberfl��chenanalyse und mechanistischer Chromatographiemodellierung, entschl��sselte die qualitativen Zusammenh��nge zwischen Struktureigenschaften und Parametern der Steric Mass Action Isotherme (SMA). Die gewonnenen Erkenntnisse ��ber die Bindungsorientierung und die Proteinadsorption an starke CEX-Medien bilden das theoretische Fundament f��r QSPR-Modelle, die Isothermenparameter auf der Grundlage von Antik��rperstrukturinformationen vorhersagen. Im zweiten Manuskript wurde eine QSPR Modellierungsmethode zur Vorhersage von Stoichiometric Displacement Model (SDM) Parametern von therapeutischen mAbs vorgestellt. Das Modell nutzt Proteindeskriptoren, die aus Homologiemodellen abgeleitet wurden und experimentelle Daten mehrerer Antik��rperformate, einschlie��lich IgG1 mAbs, IgG4 mAbs, Fabs sowie bispezifische Antik��rper, um Chromatogramme von zwei mAbs vorherzusagen, die aus dem Trainingsdatensatz entfernt wurden. Die Ber��cksichtigung von zwei diskreten Konformationen bei der Homologiemodellierung von IgG4 mAbs lieferte eine m��gliche Erkl��rung f��r Split-Peak-Chromatogramme. Mit Hilfe der Gau��prozess-Regression wurde eine quantitative Beziehung zwischen den Proteindeskriptoren und den makroskopischen Parametern der SDM-Isotherme hergestellt. Durch rekursive Feature-Eliminierung wurden Proteindeskriptoren innerhalb der variablen Region von mAbs identifiziert, die f��r die Vorhersage der thermodynamischen Gleichgewichtskonstante relevant sind. Im Gegensatz dazu, war der charakteristische Ladungsparameter der SDM-Isotherme haupts��chlich von der Gesamtnettoladung der untersuchten Antik��rper abh��ngig. Die ersten beiden Manuskripte zeigten, wie Homologiemodellierung, QSPRs und mechanistische Modellierung die Fr��hphasen-Entwicklung f��r ein neues Biopharmazeutikum unterst��tzen k��nnen, auch ohne anf��ngliches Prozesswissen und Proteinmaterial f��r Laborversuche. Die Manuskripte drei, vier und f��nf bilden eine Publikationsreihe, die darauf abzielt, die Verwendung der mechanistischen Chromatographiemodellierung als QbD-Werkzeug in der Sp��tphasen-Entwicklung zu f��rdern. Daher werden in den folgenden Manuskripten optimierte Methoden zur Modellkalibrierung, -validierung und -anwendung vorgestellt. Im dritten Manuskript wurde eine Methode f��r die Kalibrierung von multikomponenten SMA Chromatographiemodellen entwickelt. Die mechanistische Modellierung ist eine vielversprechende Technologie f��r die digitale Bioprozessentwicklung, aber die komplexe und zeitaufw��ndige Modellkalibrierung hemmt noch immer ihre Anwendung in der biopharmazeutischen Industrie. F��r die \textit{in silico}-Prozesscharakterisierung und andere komplexe DSP-Anwendungen m��ssen Kalibrierungs- und Validierungstechniken zu einer Modellsicherheit f��hren, die den Anforderungen des QbD-Konzepts gerecht wird. In dieser Studie wurde eine pH-abh��ngige, multikomponenten SMA-Isotherme verwendet, um einen CEX-Chromatographieprozess zu modellieren, der drei mAb-Ladungsvarianten sowie eine Aggregatspezies beinhaltet. Die Modellkalibrierungsmethode basierte auf der systematischen Reduktion unbekannter Modellparameter durch Anwendung grundlegender Kenntnisse ��ber pr��parative Chromatographie in Kombination mit der inversen Sch��tzung von Modellparametern unter Verwendung repr��sentativer Experimente. Die Parameter, die den linearen Bereich der SMA-Isotherme definieren, wurden anhand einer Reihe von linearen Gradientenelutionsversuchen ohne Fraktionssammlung bestimmt, was den analytischen Aufwand f��r die Quantifizierung der Ladungs- und Gr����envarianten drastisch reduzierte. Au��erdem konnten mit dieser Methode lokale Minima bei der heuristischen Sch��tzung der ��brigen Modellparameter vermieden werden. Die Anreicherung der Aggregatspezies im Ausgangsmaterial reduzierte die Modellunsicherheit f��r diese niedrig konzentrierte Verunreinigung. Die Modellvalidierung wurde unter Prozessbedingungen durchgef��hrt, die au��erhalb der vorgesehenen Parameterbereiche des CEX-Prozesses lagen. Mit dieser Arbeit wurde eine standardisierte Methode zur Kalibrierung von mechanistischen Chromatographiemodellen eingef��hrt, die in einem industriellen Umfeld eingesetzt werden kann. Als Alternative zu experimentellen Scale-Down Modellen (ScDM) wurde im vierten Manu-skript das zuvor vorgestellte mechanistische Chromatographiemodell als digitale Repr��sentation des Prozesses im Produktionsma��stab validiert. Experimentelle ScDMs von Chromatographieprozessen erm��glichen eine wirtschaftliche Prozesscharakterisierung und Ursachenforschung im Laborma��stab. Die Vergleichbarkeit zwischen ScDM S��ulen und gr����eren Ma��st��ben h��ngt jedoch von systemspezifischen Dispersionseffekten, der Variabilit��t der Ligandendichte sowie der Variabilit��t in der Zusammensetzung des Feed-Materials und der Beladungsdichte ab. Dar��ber hinaus verlangen die Aufsichtsbeh��rden, dass mathematische Modelle die Auswirkungen der Prozessvariabilit��t erfassen, die bei der Herstellung im Gro��ma��stab zu erwarten sind, wenn das Modell zur Festlegung einer Kontrollstrategie f��r den kommerziellen Herstellungsprozess verwendet wird. Der Vergleich zwischen simulierten und gemessenen Chromatogrammen und Elutionspooldaten vom Labor- bis zum Produktionsma��stab erm��glichte die fr��hzeitige Identifizierung von Unterschieden zwischen den Ma��st��ben, z.~B. Systemdispersionseffekte oder Variabilit��t der Ionenkapazit��t. Es wurde eine mehrstufige Modellvalidierungsmethode eingef��hrt, um die Modellqualit��t zu messen und die Grenzen des Modells in verschiedenen Ma��st��ben zu verstehen. Das experimentelle ScDM und das \textit{in silico}-Modell wurden mit Hilfe des identischen statistischen ��quivalenztestverfahrens als repr��sentative Darstellung des Produktionsma��stabs validiert. Das mechanistische Chromatographiemodell umging die Limitierungen des experimentellen ScDM, indem es die Auswirkungen von Betth��he, Beladungsdichte, Feed-Zusammensetzung und Eigenschaften der mobilen Phase erfasste. Die Ergebnisse zeigen die Anwendbarkeit mechanistischer Chromatographiemodelle als m��gliche Alternative zu konventionellen ScDM-Ans��tzen und erm��glichen ihre Verwendung f��r komplexe Aufgaben in der Sp��tphasen-Entwicklung. Das f��nfte und letzte Manuskript demonstriert die Anwendung des zuvor ver��ffentlichten mechanistischen Chromatographiemodells auf die Prozesscharakterisierung (PCS) eines Aufreinigungsschritts. Studien zur Prozesscharakterisierung stellen die umfangreichsten und zeitaufw��ndigsten Arbeitspakete w��hrend der DSP-Entwicklung eines mAbs dar. Im Allgemeinen besteht das Ziel der PCS in der Identifizierung von Korrelationen zwischen Prozessparametern und CQAs, was die Etablierung einer robusten Prozesskontrollstrategie erm��glichen soll. Aufgrund der Komplexit��t der pr��parativen Chromatographie und einer Vielzahl von potenziell kritischen Prozessparametern erfordert eine traditionelle PCS auf der Grundlage statistischer DoEs Dutzende von Laborexperimenten sowie zeitintensive Offline-Messungen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Modellierungsmethode deckt die Hauptaufgaben traditioneller PCS-Studien nach den QbD-Prinzipien ab, einschlie��lich der Bewertung der Kritikalit��t von 11 Prozessparametern und der Festlegung ihrer Kontrollbereiche. Die Analyse der Auswirkungen eines multivariaten Samplings von Prozessparametern auf das Aufreinigungsergebnis erm��glichte die Identifizierung der Edge-of-Failure. Die experimentelle Validierung der \textit{in silico}-Ergebnisse erforderte etwa 75\% weniger Experimente im Vergleich zu einer rein auf Laborexperimenten basierenden PCS. Monte-Carlo-Simulationen wurden unter Ber��cksichtigung der gemessenen Varianzen der Prozessparameter und der Zusammensetzung des Feed-Materials im Produktionsma��stab eingesetzt, um die F��higkeit des Prozesses abzusch��tzen, die Akzeptanzkriterien f��r CQAs und Prozessausbeute zu erf��llen. Der hier vorgestellte Arbeitsablauf erm��glicht die Implementierung digitaler Zwillinge als QbD-Werkzeug f��r eine verbesserte Entwicklung biopharmazeutischer Herstellungsprozesse. In der vorliegenden Arbeit wurden mehrere Hindernisse auf dem Weg von der Prim��rstruktur zur Etablierung eines robusten Downstream-Prozesses beseitigt. Die multiskalige Modellierung mehrerer Biologika in der CEX-Chromatographie f��hrte zu einem tiefen Verst��ndnis der zugrundeliegenden Adsorptionsmechanismen. Die vorgestellten QSPR-Modelle zur Vorhersage von SDM-Isothermen Parametern erm��glichten einen fr��hen Start der Prozessentwicklung, bevor Proteinmaterial f��r Laborexperimente zur Verf��gung steht. Um die L��cke zwischen der Fr��hphasen- und Sp��tphasen-Entwicklung zu schlie��en, k��nnen erste Chromatographiemodelle, die auf Proteinstrukturinformationen aufbauen, mit Hilfe experimenteller Daten weiter verfeinert werden. Im Kontext der QbD-Richtlinien tragen standardisierte und wissenschaftlich fundierte Methoden zur Modellkalibrierung, Validierung und \textit{in silico}-Prozesscharakterisierung zu einer effizienteren und wirtschaftlicheren DSP-Entwicklung bei und erh��hen gleichzeitig die Prozessrobustheit und Produktqualit��t. Die in dieser Arbeit vorgestellten Werkzeuge haben das Potenzial, die Akzeptanz gegen��ber der mechanistischen Modellierung in der Industrie und bei den Aufsichtsbeh��rden zu erh��hen.
- Published
- 2022
- Full Text
- View/download PDF
32. Plattformtechnologien für die automatisierte Bioprozessentwicklung
- Author
-
Glauche, Florian, Neubauer, Peter, Technische Universität Berlin, Hubbuch, Jürgen, and Goelling, Detlef
- Subjects
ddc:579 - Abstract
The development of production processes in biotechnology is a time and resource intensive task due to the vast design space to be screened. Therefore, processes are commonly performed at a local optimum. Within the past two decades, miniaturization, parallelization and automation of laboratory work have improved significantly and researchers are now able to carry out thousands of experiments per week in automated facilities. In many cases there is a disagreement between the results of small-scale experiments and data from the production scale due to the different conditions, in which the cells are cultivated. Laboratory scale experiments are often performed as batch cultures in complex media without any instrumentation, while the production processes run under fed-batch conditions in instrumented bioreactors. This discrepancy may result in multiple rounds of experiments, until a feasible strain for scale-up is identified. Therefore, cultivation conditions should be kept consistent throughout the developmental line. In this work, platform technologies for consistent bioprocess development are presented in the form of three publications. First, a novel dissolved oxygen sensor for screening facilities was developed, which can determine the aeration level of cultures grown in 96-well plates that are transported from the incubator to the plate reader. The long response time (t90) of 9.7 min allows an estimation of the oxygenation status during incubation. The sensor detected oxygen limitation in fed-batch cultures of E. coli and S. cerevisiae. In the second part, a workflow for rapid cell lysis buffer optimization using design of experiments (DoE) is presented. Experiments were planned with a DoE software and written as worklists for the liquid handling robot into a laboratory information management system (infoteam iLab-Bio). In three experimental runs, a lysis buffer composition for efficient release of beta-galactosidase from E. coli was determined. The product formation profile of yeast strains was evaluated using parallel fed-batch cultures at the millilitre-scale in the third part. For comparison, A-stat cultivations in a 1.5 L bioreactor were performed, which showed comparable product formation rates. Using these platform technologies, a framework for streamlined experimental planning, execution and data management can be established. Die Entwicklung von Produktionsprozessen in der Biotechnologie ist zeit- und kostenintensiv, insbesondere bei der Produktion von therapeutischen Proteinen und gentechnisch verbesserten Enzymen. Neben allgemeinen Prozessgrößen wie Temperatur, pH und Medienzusammensetzung beeinflussen Produktionsstamm, Expressionssystem und Fusionspartner sowie Prozessführung und die Aufarbeitung des Produktes den Ertrag und damit die Wirtschaftlichkeit eines biotechnologischen Herstellungsprozesses. Die Anzahl an nötigen Laborexperimenten zur Optimierung ist meist zu groß, um manuell durchgeführt zu werden, sodass häufig nur bei einem Quasi-Optimum gearbeitet werden kann. In den letzten zwei Jahrzehnten ist die Miniaturisierung, Parallelisierung und Automatisierung von Experimenten stark vorangeschritten, sodass heute tausende von Versuchen pro Woche durchgeführt werden können. Ob die Daten aus den kleinen Systemen prädiktiv für den Produktionsmaßstab eingesetzt werden können, ist jedoch nicht ohne Zweifel. Daher müssen für die Maßstabsvergrößerung in der Regel zusätzliche Versuchsreihen in Labor- und Pilotbioreaktoren durchgeführt werden. Die Unterschiede zwischen Labor- und Produktionsbedingungen betreffen häufig die Kulturführung und die eingesetzten Medien. Meist wird ein Batch-Prozess mit Komplexmedium im Kleinmaßstab und ein Fed-Batch Prozess mit Mineralsalzmedium in der Produktion eingesetzt. Außerdem erlauben die Screening-Systeme nur Endpunktmessungen und es wird häufig erfahrungsbasiert oder nach Versuch und Irrtum gearbeitet. Die Datenaufzeichnung und -Auswertung geschieht meist manuell. Um die Aussagekraft von Laborexperimenten im Kleinmaßstab zu verbessern, sollten Versuchsbedingungen gewählt werden, die dem Produktionsmaßstab entsprechen. Diese Prozessentwicklungsstrategie wird auch konsistente Bioprozessentwicklung genannt. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Plattformtechnologien für konsistente Bioprozessentwicklung erarbeitet und in Form von drei Fallstudien auf unterschiedliche Fragestellungen angewendet. Ein neuartiger Sensor zur Messung von Gelöstsauerstoff in Mikrowellplatten wurde in der ersten Publikation entwickelt. Der Sensor besitzt eine Ansprechzeit von 9,7 Minuten, was die verlässliche Bestimmung von Gelöstsauerstoffwerten in Anlagen ermöglicht, in denen Verzögerungen durch Transportzeiten vom Inkubator zum Photometer vorhanden sind. Mithilfe von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae Kulturen konnte demonstriert werden, dass der Sensor Sauerstofflimitationen im Inkubator detektieren kann. In Kombination mit einem schnell ansprechenden Sensor ist eine umfassende Charakterisierung des automatisierten Kultivierungssystems möglich. In der zweiten Publikation wurde ein Arbeitsablauf zur schnellen Optimierung des chemisch-enzymatischen Zellaufschlusses entwickelt. Mit Hilfe einer Software für experimentelles Design wurden Versuchspläne erstellt, die in einem Datenbanksystem für den Pipettierroboter abrufbar gespeichert wurden. In drei Experimenten wurde die optimale Mischung von EDTA, Lysozym, Triton X-100 und Polymyxin B bestimmt. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichen Produkten wies der Puffer eine vergleichbare Performance auf. Im Rahmen der dritten Publikation wurde das Produktbildungsprofil von Hefekulturen in parallelen miniaturisierten Fed-Batch Kulturen untersucht und eine Abhängigkeit der spezifischen Produktbildungsrate von der spezifischen Wachstumsrate festgestellt. Das Produktbildungsprofil wurde mit einer kontinuierlichen Kultivierung verglichen. Es konnte festgestellt werden, dass die aus den miniaturisierten Kulturen gewonnenen Daten mit dem 1,5 L Bioreaktor vergleichbar sind. Eine Charakterisierung von Hefestämmen in Mikrowellplatten bietet sich demnach an, um zeit- und kostenintensive Experimente in Bioreaktoren zu minimieren. Die entwickelten Plattformtechnologien bieten eine Grundstruktur zur schnelleren Versuchsplanung, -durchführung und -auswertung. Durch die Beibehaltung der Rahmenbedingungen des Produktionsmaßstabes während der Produkt- und Prozessentwicklung können Entwicklungszeit und -kosten von biotechnologischen Produktionsprozessen verringert werden, was schlussendlich zu einer weiteren Verbreitung von nachhaltigen Produktionsmethoden führen wird.
- Published
- 2018
Catalog
Discovery Service for Jio Institute Digital Library
For full access to our library's resources, please sign in.