Search

Hepatitis E virus (HEV) je uzročnik akutne hepatis E infekcije kod ljudi. HEV se prenosi putem zagaĎene vode i odgovoran je za nastanak mnogobrojnih epidemija velikih razmera u zemljama u razvoju Azije i Afrike. Hepatitis E je prvi put kod svinja izolovan 1997. godine, a kasnije je dokazan i kod ostalih ţivotinjskih vrsta, kao što su: divlje svinje, jelen, zečevi, pacovi, ptice i ostalo.Prva istraţivanja prisustva HEV infekcije kod domaćih i divljih svinja u Srbiji sprovedena su 2008. godine. HEV RNK je dokazana u 30% uzoraka fecesa i 45% uzoraka organa (Petrovic et al., 2008). Analizom uzoraka krvnih seruma svinja u individualnim gazdinstvima ustanovljena je seroprevalencija od 34,6% (Lupulovic et al, 2010). Cilj ovog istraţivanja je ispitivanje raširenosti HEV infekcije kod svinja na farmama na teritoriji Vojvodine, kao i ispitivanje HEV seroprevalencije kod ljudi u Vojvodini.Od metoda za istraţivanje korišćene su: nekomercijalni ELISA test (in-house ELISA), komercijalni ELISA test, Western-blot metod, real-time RT -PCR i imunohistohemijska metoda za detekciju HEV antigena.Materijal za ispitivanje su bili uzorci krvi svinja (300) sa 3 farme na teritoriji Juţne Bačke i Srema i uzorci krvi ljudi (294), kao i uzorci fecesa, ţuči, jetre i mesa sakupljeni u klanicama od 95 tovljenika i 50 prasadi.Prisustvo specifičnih antitela IgG klase protiv hepatitis E virusa dokazano je kod svinja na sve tri ispitujuće farme. Primenom in house ELISA testa ustanovljena je seroprevalencija od 37% na farmi A, 31% na farmi B i 54% na farmi C, dok je primenom komercijalnog ELISA testa utvrĎeno 40% seropozitivnih svinja na farmi A, 41% na fami B i 65% na farmi C. Uporednom analizom rezultata dobijenih sa oba ELISA testa, ustanovljena je prosečna seroprevalencija od 40,66% in house ELISA testom, odnosno 48,66% komercijalnim ELISA testom.Sprovedena su i istraţivanja prisustva specifičnih antitela IgG klase protiv HEV u krvnim serumima dobrovoljnih davalaca krvi i kod pacijenata. Primenom in house ELISA testa utvrĎena jeseroprevalencija od 15% kod dobrovoljnih davalaca krvi, dok su uzorci krvi pacijenata bili seronegativni. Testiranjem komercijalnim ELISA testom kod dobrovoljnih davalaca krvi pozitivan serološki nalaz je ustanovljen kod 17,86% dobrovoljnih davalaca krvi (pregledani su serumi koji su u in house testu dali pozitivan ili sumnjiv nalaz, kao i odreĎen broj seronegativnih uzoraka), a kod pacijenata 2,12%.Kao tzv. „zlatni standard“ za definisanje rezultata sa sumnjivim serološkim nalazom čije su ekstinkcije bile blizu cut off vrednosti u in house ELISA testu, korišćen je Western blot metod. Pozitivan rezultat je potvrĎen kod 6 od ukupno pregledanih 11 uzoraka krvi svinja, odnosno od ukupno pregledanih 11 uzoraka seruma ljudi, pozitivan nalaz je ustanovljen kod 7 uzoraka.Uzorci sa klanica pregledani su real-time RT- PCR metodom, a HEV RNK je dokazana u u fecesu (54%), ţuči (26%), jetri (16%) i mesu (10%) prasadi. Kod tovljenika prisustvo HEV RNK je potvrĎeno samo u fecesu (7,27%), dok su svi uzorci tkiva bili negativni.Patahistološkim pregledom dokazane su mikroskopske lezije II stepena kod 3 uzorka (11,53%) jetri prasadi od ukupno pregledanih 26 uzoraka sa pozitivnim RT-PCR. Imunohistohemijskim pregledom uzoraka jetre prasadi nije dokazano prisustvo antigena hepatitis E virusa.Definisani su protokoli laboratorijskog ispitivanja hepatitis E infekcije kod svinja i ljudi, kao i u uzorcima mesa i jetri svinja u klanicama, Hepatitis E virus (HEV) is the causative agent of acute hepatitis E infection in humans. HEV is transmitted through contaminated water and is responsible for the outbreaks of many large-scale epidemics in the developing countries of Asia and Africa. Swine HEV was first isolated in 1997, and was later detected in other animal species, such are: wild boar, deer, rabbits, rats, birds and more.The first investigations of HEV infection in domestic and wild pigs in Serbia were carried out in 2008. HEV RNA was detected in 30% of faecal samples and 45% of the tissue samples (Petrovic et al., 2008). Analysing the blood samples of beckyard pigs, the seroprevalence of 34,6% was determined (Lupulovic et al, 2010). The aim of this study was to investigate the prevalence of HEV infection in pigs on farms in Vojvodina, as well as testing the HEV seroprevalence in humans.The methods used for this study were: non-commercial ELISA (in house ELISA), the commercial ELISA, Western blot method, real-time RT-PCR and immunohistochemical method for the detection of HEV antigen.Material for the study were: blood samples of pigs (300) from 3 farms on the territory of South Backa and Srem and blood samples of people (294), as well as faeces, bile, liver and meat collected in slaughterhouses from 95 fatteners and 50 piglets.The presence of specific IgG antibodies against the hepatitis E virus in pigs has been detected on all three examinated farms. Upon the application of in house ELISA, the seroprevalence of 37% was establised on farm A, 31% in farm B and 54% on farm C, while using a commercial ELISA , 40% of seropositive pigs were detected on farm A, 41% of fami B and 65% Farm C. The comparative analysis of the results obtained with both ELISA, determined the average seroprevalence of 40,66% by in house ELISA and 48,66% by commercial ELISA.The research of the presence of specific IgG antibodies against HEV in the serum of blood donors and patients were also conducted. Upon the application of in house ELISA, the seroprevalence of 15% were recorded in blood donors, while blood samples of patients were seronegative. Testing by commercial ELISA, positiv serological findings were diagnosed in 17,86% of blood donors (serums with positive or suspicious results in in house ELISA and a number of seronegative samples were tested), and in patients 2, 12%.As so-called "gold standard" for defining the serological results with suspiciousserological findings, which extinctions were close to cut off values in in house ELISA, we used the Western

Bolest kvrgave kože (lumpy skin disease – LSD) je virusno oboljenje goveda, veoma važno sa ekonomskog aspekta, zbog velikih gubitaka u govedarskoj proizvodnji. Brzi i pouzdani laboratorijski testovi su neophodni, kako za rano otkrivanje bolesti i utvrđivanje statusa zapata, tako i za praćenje imunološkog statusa jedinki nakon vakcinacije, koja je i dalje najsigurnija mera u borbi protiv ove bolesti. Radi sprovođenja efikasnih mera kontrole protiv LSD, kao što su pravovremena vakcinacija, naročito teladi i serološki nadzor zapata, neophodno je vršiti istraživanja vezana za postvakcinalni imunološki odgovor, kako kod odraslih jedinki, tako i kod teladi. Cilj ove doktorske distertacije je praćenje antitela protiv virusa bolesti kvrgave kože (lumpy skin disease virus – LSDV) kod vakcinisanih krava, praćenje perzistencije maternalnih antitela kod teladi poreklom od vakcinisanih krava, kao i sprovođenje postupka validacije i potvrde primene modifikovanog virus neutralizacionog testa razvijenog na Odeljenju za virusologiju Naučnog instituta za veterinarstvo „Novi Sad“. Materijal za ispitivanje korišćen u ovom istraživanju potiče od goveda sa područja u kojima nije registrovana bolest tokom epizootije u Srbiji 2016. godine (Južnobački, Sremski i Južnobanatski okrug), a vakcinacija goveda protiv bolesti kvrgave kože je počela da se sprovodi tokom jula meseca 2016. godine. Uporedno ispitivanje je izvršeno na ukupno 355 uzoraka krvnih seruma krava, 15 uzoraka kolostruma i 270 uzoraka krvnih seruma teladi. Za uporedno ispitivanje prisustva antitela protiv LSDV u uzorcima korišćene su metode ELISA i virus neutralizacioni test (VNT). ELISA test je izvođen korišćenjem komercijalnog kita ID Screen® Capripox Double Antigen Multispecies proizvođača IDvet (France), dok je VNT izvođen upotrebom kulture ćelija Madin-Darby bovine kidney (MDBK) i virusa bolesti kvrgave kože poreklom od klinički obolelog govečeta u trajanju od 3 dana. Prvo prisustvo specifičnih antitela protiv LSDV u krvnim serumima vakcinisanih krava utvrđeno je 20 dana nakon vakcinacije, najviši nivo serokonverzije utvrđen je 30 dana nakon vakcinacije, a prisustvo antitela je bilo moguće detektovati tokom četiri meseca nakon vakcinacije, modifikovanim VNT kod 34% krava, a ELISA testom kod 30% vakcinisanih krava. Prisustvo specifičnih antitela protiv LSDV ELISA metodom je bilo moguće utvrditi 90 dana nakon teljenja kod 16,67% teladi, 105 dana nakon teljenja kod 10% teladi, a uposlednjem terminu uzorkovanja, 120 dana nakon teljenja, kod svega 6,67% teladi. VNT je u istim terminima prisustvo specifičnih antitela bilo moguće utvrditi kod 10%, 6,67%, i 3,33% teladi. Ni u jednom terminu uzorkovanja nije bilo moguće utvrditi prisustvo antitela protiv LSDV kod svih ispitanih teladi. Na dan teljenja je prisustvo specifičnih antitela protiv LSDV utvrđeno u 63,33% uzoraka krvnih seruma krava ELISA metodom, u 73,33% uzoraka krvnih seruma krava metodom VNT, dok je obema metodama prisustvo antitela utvrđeno u 86,67% uzoraka kolostruma. Statističkom analizom je utvrđen značajno veći nivo antitela u kolostralnom u odnosu na krvni serum krava. Rezultati uporednog ispitivanja modifikovanog VNT i komercijalnog ELISA testa za detekciju antitela protiv LSDV u uzorcima krvnih seruma iz banke seruma i vakcinisanih krava pokazali su skoro savršenu saglasnost poređenih metoda (k=0,913). S druge strane, visoka saglasnost poređenih metoda (k=0,7239) je postignuta kod uporednog ispitivanja modifikovanog VNT i komercijalnog ELISA testa za detekciju antitela protiv LSDV u uzorcima krvnih seruma vakcinisanih krava i njihove teladi. Ispitivanjem uzoraka krvnih seruma iz banke seruma goveda pre pojave LSD u Republici Srbiji izračunata je specifičnost modifikovanog VNT od 100%, a komercijalnog ELISA testa od 99,2%. S obzirom da je VNT zlatni standard serološke dijagnostike LSD, izračunata je osetljivost komercijalnog ELISA testa u odnosu na modifikovani VNT za detekciju antitela u uzorcima krvnih seruma vakcinisanih krava od 88,24% i za detekciju antitela protiv LSDV u uzorcima krvnih seruma vakcinisanih krava i njihove teladi od 86,44%. Rezultati ovog istraživanja su pokazali da se modifikovani VNT i komercijalni ELISA test (proizvođača „IDvet“) mogu koristiti za detekciju antitela protiv LSDV. Modifikovani VNT se pokazao kao jednostavniji i brži za izvođenje u odnosu na preporučeni VNT od strane OIE. Datum, Lumpy skin disease (LSD) is a viral disease of cattle, very important from an economic aspect, due to significant losses that can cause in livestock production. Rapid and reliable laboratory tests are necessary, both for early detection of disease and determination of the status of the herds, as well as for monitoring of the immune status of individual animals after vaccination, which is still the most effective measure for controlling the spread of LSD. In order to implement effective LSD control measures, such as timely vaccination, particularly in calves and serological monitoring, it is necessary to carry out researches related to postvaccinal immune response, both in adult cattle and in their calves. The goal of this doctoral dissertation is to monitor the presence of antibodies against lumpy skin disease virus (LSDV) in vaccinated cows, to monitor the persistence of maternal antibodies in calves born to vaccinated cow, as well as to carry out the validation process and confirm the use of the modified virus neutralization test developed at the Department of virology of the Scientific veterinary institute "Novi Sad", Serbia. The material for testing used in this study originated from cattle in areas where no LSD outbreaks were registered during the epizootic in Serbia in 2016 (South Bačka, Srem and South Banat Districts), and the vaccination of cattle against LSD started in July 2016. A comparative examination was carried out on a total of 355 cow blood sera samples, 15 colostrum samples and 270 calf blood sera samples. ELISA and virus neutralization test (VNT) were used for comparative examination of samples on the presence of antibodies against LSDV. ELISA test was performed using the commercial set kit ID Screen® Capripox Double Antigen Multi-species manufactured by IDvet (France), while a 3-day VNT was performed using Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cell line and LSDV isolated from clinically infected cow. The first presence of specific antibodies against LSDV in vaccinated cows was detected 20 days after vaccination, the highest seroconversion was determined 30 days after vaccination, and the presence of antibodies against LSDV could be detected during four months after vaccination by VNT and commercial ELISA in 34% and 30% of vaccinated cattle, respectively. The presence of specific antibodies against the LSDV by ELISA method could bedetermined 90 days after calving in 16.67% of calves, 105 days after calving in 10% of calves, and in the last sampling interval, 120 days after calving, in only 6.67% of calves. In above-mentioned sampling intervals, the presence of specific antibodies by VNT could be determined in 10%, 6.67%, and 3.33% of calves. In any sampling period we did not determined that all calves were seropositive to LSDV. On calving day, the presence of specific antibodies against LSDV was detected in 63.33% of cow blood sera samples by ELISA, in 73.33% of cow blood sera samples by VNT method, while the presence of antibodies was found in 86.67% of colostrum samples by both methods. A statistical analysis showed a significantly higher level of antibodies in the colostrum compared to the cow blood sera. The results of comparative examination of modified VNT and commercial ELISA test for the detection of antibodies against LSDV in blood sera samples from the sera bank and of vaccinated cows showed an almost perfect agreement of the compared methods (k = 0.913). On the other hand, the substantial agreement of the compared methods (k = 0.7239) was achieved in a comparative examination of modified VNT and commercial ELISA test for the detection of antibodies against LSD in blood sera samples of vaccinated cows and their calves. The specificity of modified VNT and commercial ELISA was 100% and 99.2% respectively. It was calculated by testing blood sera samples from sera bank before the occurrence of LSD in the Republic of Serbia. Since VNT is “the gold standard” serological test for LSDV, the sensitivity of commercial ELISA in relation to modified VNT was calculated for the detection of antibodies in blood sera samples of vaccinated cows of 88.24% and for the detection of antibodies against LSDV in blood sera samples of vaccinated cows and their calves of 86.44%. The results of this study showed that modified VNT and commercial ELISA manufactured by „IDvet“ can be used for the detection of antibodies against LSDV. Modified VNT proved to be simpler to perform and to take less time compared to the recommended VNT by the OIE.