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Aims: Diabetic nephropathy is a major consequence of inflammation developing in type 1 diabetes, with interleukin-8 (IL-8)-CXCR1/2 axis playing a key role in kidney disease progression. In this study, we investigated the therapeutic potential of a CXCR1/2 non-competitive allosteric antagonist (Ladarixin) in preventing high glucose-mediated injury in human podocytes and epithelial cells differentiated from renal stem/progenitor cells (RSC) cultured as nephrospheres. Materials and methods: We used human RSCs cultured as nephrospheres through a sphere-forming functional assay to investigate hyperglycemia-mediated effects on IL-8 signalling in human podocytes and tubular epithelial cells. Results: High glucose impairs RSC self-renewal, induces an increase in IL-8 transcript expression and protein secretion and induces DNA damage in RSC-differentiated podocytes, while exerting no effect on RSC-differentiated epithelial cells. Accordingly, the supernatant from epithelial cells or podocytes cultured in high glucose was able to differentially activate leucocyte-mediated secretion of pro-inflammatory cytokines, suggesting that the crosstalk between immune and non-immune cells may be involved in disease progression in vivo. Conclusions: Treatment with Ladarixin during RSC differentiation prevented high glucose-mediated effects on podocytes and modulated either podocyte or epithelial cell-dependent leucocyte secretion of pro-inflammatory cytokines, suggesting CXCR1/2 antagonists as possible pharmacological approaches for the treatment of diabetic nephropathy.

Introduction and Aims In renal pathologies the regeneration of injured kidney portions may rely on the ability of resident stem/progenitor cells to proliferate and replace the damaged tissue, although the intrinsic capacity for tissue repair and regeneration is limited in mammalian kidney. However, the existence and identity of renal stem/progenitor cells with nephrogenic potential and their possible use in renal tissue repair is largely debated. Aim of this work is to evaluate the possibility to obtain adult renal stem cells from cultures of clonal human nephrospheres. Methods Nephrospheres were obtained from adult renal cells and sphere forming efficiency (SFE) was calculated. To identify and isolate stem cells from nephrospheres the PKH dye was used and CD133 and CD24 markers permitted to better characterize them. The ability of stem cells to differentiate into multiple lineages was evaluated using specific media. The regenerative abilities were evaluated transplanting the cells under the renal capsule of nude mice and by culturing nephrosphere and PKHhigh cells on decellularized slices of human renal tissue, obtained by using different detergents. Results Nephrospheres were obtained after 10 days in culture with a SFE of 0.8%. On the basis of PKHhigh status, a purified stem cell population able to self-renew and generate a differentiated epithelial, endothelial and podocytic progeny was identified in the nephrospheres. PKHhigh cells were able to survive in vivo maintaining an undifferentiated status. A PKHhigh subpopulation, characterized by CD133+/CD24- phenotype, identified a homogeneous cell population displaying strong in vitro self-renewal and multipotency capacity. Moreover nephrosphere cells were able to repopulate decellularized slices of human renal tissue and also PKHhigh stem cells seem to have the same ability as shown by our preliminary data. Conclusions The sphere-forming functional approach coupled with the PKHhigh status, that still has to be disclosed, permitted the isolation of a purified and homogeneous population of resident renal stem cells. The demonstrated abilities of these cells to survive in vivo and to repopulate decellularized slices of renal tissues make them attractive candidates for nephron regeneration and application in regenerative medicine.

La fragilità è una sindrome geriatrica definita da un progressivo declino età-correlato di diverse facoltà fisiologiche, che si traduce in una ridotta funzionalità d’organo e in un’aumentata vulnerabilità in condizioni di stress. Fried e coll. propongono una definizione operativa delle fragilità. La letteratura riporta un’alta prevalenza di fragilità in individui affetti da insufficienza renale cronica. Tra questi soggetti, il rischio di sviluppare fragilità è aumentato di due/tre volte rispetto ai soggetti sani. Ad oggi, la definizione e la valutazione della fragilità in questi pazienti è ancora controversa. Tuttavia quello che si sa è che l’invecchiamento è un processo strettamente correlato alla ridotta capacità delle cellule staminali di auto-rinnovarsi e differenziarsi. Quest’alterazione delle funzioni delle cellule staminali può svolgere un ruolo chiave nella fisiopatologia delle malattie associate all’invecchiamento, inclusa la disfunzione renale. Il nostro gruppo ha identificato e isolato le cellule staminali renali adulte a partire da colture clonali di nefrosfere umane. All’interno di queste sono presenti cellule a diversa differenziazione e maturazione, tra queste anche le staminali identificate come PKHhigh/CD133+/CD24-, multipotenti e in grado di ripopolare scaffold renali decellularizzati. Date queste premesse l'obiettivo del progetto è valutare gli effetti di condizioni biologiche legate alla fragilità sul comportamento delle cellule staminali renali adulte umane e capire se tali condizioni sono in grado di esaurire il pool di cellule staminali e alterarne la funzione. In primo luogo abbiamo arruolato soggetti fragili, pre-fragili e non-fragili e giovani sani come controllo e raccolto i rispettivi plasmi e cellule mononucleate dal sangue periferico (PBMC). Sia nelle PBMC che nelle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche circolanti abbiamo valutato il danno al DNA osservando una percentuale di cellule positive al danno statisticamente più alta nei pazienti fragili rispetto agli altri gruppi. Per valutare il reale effetto delle condizioni biologiche legate alla fragilità sulle proprietà delle RSC, le colture di NS, ottenute da nefrectomie, sono state trattate con il plasma dei soggetti arruolati. Abbiamo valutato dapprima le capacità di autorinnovamento delle cellule trattate e osserviamo una significativa diminuzione dell'efficienza di formazione della sfera, indice di autorinnovamento, nei soggetti fragili rispetto ai non fragili e ai giovani. Successivamente, abbiamo valutato il danno al DNA, i ROS intracellulari, la proliferazione e la vitalità nelle cellule staminali/progenitrici renali ottenute dopo la dissociazione delle NS. Non sono state evidenziate differenze nella vitalità e nella proliferazione cellulare tra i gruppi, mentre il danno al DNA e i ROS intracellulari sono aumentati nelle cellule delle NS trattate con plasma di anziani fragili rispetto a quelle trattate con gli altri plasmi. Ciò potrebbe indicare che la diminuzione della capacità di autorinnovamento nelle cellule trattate con il plasma di pazienti fragili e un aumento del danno al DNA e dei ROS intracellulari non sono correlati con la morte o la proliferazione cellulare, ma con un'elevata presenza di mediatori infiammatori e ROS nel plasma dei pazienti fragili. Per confermare questi dati abbiamo analizzato lo stress ossidativo e il profilo di 40 citochine infiammatorie nel plasma dei soggetti arruolati. Si ha un aumento dello stress ossidativo nel plasma dei soggetti fragili rispetto agli altri gruppi, così come un’aumentata presenza o l’esclusività di alcune citochine infiammatorie. Questi dati preliminari suggeriscono che esiste una combinazione di stress ossidativo e citochine pro-infiammatorie nel plasma di pazienti fragili che contribuiscono ad aumentare il danno al DNA e i ROS intracellulari alterando conseguentemente le caratteristiche di staminalità delle cellule delle NS. Frailty is a geriatric syndrome that can be defined as an age-related progressive impairment of multiple physiological systems, resulting in a significantly reduced capacity to compensate for external stressors. Fried and colleagues proposed a phenotype characterization of frailty through five physical criteria, so this can be possible only after the onset of clinical manifestations without the possibility of a precocious diagnosis. Several studies report a high prevalence of frailty in both old and young individuals with kidney dysfunction, and this further increases with advancing age and progressive decline of renal function. Elderly individuals with chronic kidney disease (CKD) are two to three times more likely to be frail than those with normal renal function. However, the relationship between CKD and frailty is still unclear. The aging process can have adverse effects on stem cells; their self-renewal ability declines and their differentiation potential into the various cell types is altered. Aging-induced exhaustion and deterioration of stem cell pool and functions may play a key role in the pathophysiology of aging-associated diseases, including kidney dysfunction. Our group isolated a pure population of multipotent renal stem-like cells by a functional approach, taking advantage from the ability of renal stem cells (RSC) to grow as nephrospheres (NS). Investigating the expression of renal progenitor markers described in literature, our group identified in NS a homogeneous PKHhigh/CD133+/CD24- cell population displaying in vitro stem-cell properties, able to repopulate human decellularized renal scaffold and exhibiting multipotency. In this scenario, we tested whether in the organism of elderly and frail people there are biological conditions able to alter RSC behavior, justifying the high prevalence of chronic kidney dysfunction in the frail status and its severity. First, we recruited frail, pre-frail and non-frail subjects, and young subjects as controls and we obtained whole blood that was separated into plasma and PBMC. We studied DNA damage in both PBMC and circulating hematopoietic progenitor/stem cells (cHPSC) and we observed a statistically higher percentage of cells positive for DNA damage in frail patients compared to all the other groups. To assess the real effect of biological conditions related to frailty on adult RSC properties, NS cultures, obtained from nephrectomies, were treated with 10% plasma of enrolled frail and non-frail subjects and healthy young. We first evaluated the self-renewal abilities of treated cells and we observe a significant decrease in sphere forming efficiency, indication of self-renewal, in frail subjects compared to both non-frail and young people. Subsequently, we evaluated DNA damage, intracellular ROS, proliferation and viability in renal stem/progenitor cells obtained after NS dissociation after plasma treatment. We find no differences in viability and proliferation between groups, while DNA damage and intracellular ROS increased in NS cells treated with plasma of frail seniors compared to those treated with the other plasmas. This might indicate that the decrease of self-renewal ability in cell treated with plasma of frail patients and an increase of DNA damage and intracellular ROS are not correlated to cell death or proliferation, but with a high presence of inflammatory mediators and ROS in the plasma of frail patients. To confirm these data we analyzed the oxidative stress and the profile of 40 inflammatory cytokines on plasma of enrolled subjects. We observed an increase in oxidative stress and osome inflammatory cytokines in frail plasma compared to other plasmas. These preliminary data suggested that there is a combination of oxidative stress and pro-inflammatory cytokines in plasma of frail patients that contribute to increase DNA damage and intracellular ROS and consequently alter stem characteristics of NS cells.

In circa il 25-30% dei pazienti con carcinoma renale a cellule chiare (ccRCC) la diagnosi viene fatta quando la malattia è già ad uno stadio avanzato e circa il 30% di questi pazienti presenta metastasi ossee. È stato descritto un coinvolgimento del TGF-β1 nel promuovere aggressività, invasione e metastasi ossee nel ccRCC. Noi abbiamo già dimostrato che l'enzima della matrice extracellulare lisil ossidasi (Lox), noto per promuovere la migrazione e l'invasione cellulare attraverso il riarrangiamento del citoscheletro, è overespresso nel ccRCC. Lox, attraverso l'attivazione degli osteoclasti e l'inibizione degli osteoblasti, ha un ruolo chiave nella formazione delle lesioni ossee premetastatiche nel carcinoma mammario e del colon. Noi abbiamo precedentemente evidenziato che la produzione di TGF-β1 è modulata dalla tirosina chinasi Arg nelle cellule tubulari renali umane. Arg modula, attraverso il riarrangiamento del citoscheletro, l'invasione e la metastatizzazione del carcinoma mammario e prostatico. In base a questi dati e utilizzando come modelli in vitro colture cellulari primarie e linee cellulari, abbiamo valutato le interazioni molecolari tra TGF-β1, Lox e Arg in cellule di ccRCC e gli effetti funzionali di queste interazioni sull'invasione tumorale e sul comportamento degli osteoclasti e degli osteoblasti responsabili della formazione di lesioni ossee premetastatiche. L'espressione e la secrezione di TGF-β1 e Lox, e l'espressione della proteina Arg erano aumentate nelle colture primarie di ccRCC rispetto a quelle di cortex normale. Nelle colture di ccRCC la secrezione di TGF-β1 e Lox era positivamente correlata. Il trattamento con TGF-β1 della linea cellulare di ccRCC, 786-O, aumentava l'espressione e la secrezione di Lox e riduceva il livello della proteina Arg. L'inibitore del recettore del TGF-β SB431542 contrastava questi effetti. L'inibizione del signaling Smad-dipendente del TGF-β con SIS3 e dell'attività del proteasoma con MG132 riaumentava il livello della proteina Arg. Il silenziamento di Arg con un siRNA specifico induceva nelle cellule 786-O un aumento della secrezione di TGF-β1 e Lox, contrastata dal trattamento con SB431542. Inoltre, il silenziamento di Arg nelle cellule 786-O ha ridotto l'invasione cellulare valutata con saggio di invasione 3D in collagene, anche in presenza del trattamento con TGF-β1. L'inibizione del signaling di TGF-β1 con SB431542 riduceva l'invasione cellulare anche in cellule silenziate per Arg. Il trattamento con terreni condizionati di cellule 786-O inibiva la proliferazione degli osteoblasti MC3T3-E1 e aumentava la differenziazione osteoclastica delle cellule RAW264.7, come valutato dalla colorazione della fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP). L'inibitore di Lox, βAPN, contrastava parzialmente questi effetti. I risultati preliminari ottenuti utilizzando i terreni condizionati di colture primarie di ccRCC hanno confermato queste osservazioni. Nel complesso questi dati suggeriscono che nelle cellule di ccRCC Arg modula la produzione di Lox mediante secrezione di TGF-β1 che, a sua volta, modula la stabilità della proteina Arg attraverso un pathway Smad-dipendente. La caratterizzazione delle complesse interazioni tra TGF-β1, Lox e Arg che modulano l'invasione delle cellule di ccRCC e il comportamento degli osteoblasti e degli osteoclasti coinvolti nella formazione di lesioni ossee premetastatiche, può far luce sui meccanismi molecolari della progressione del ccRCC. About 25-30% of clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) patients show an advanced stage of disease at the time of diagnosis, and about 30% of these patients have matastasis affecting bones. An involvement of TGF-β1 in promoting ccRCC aggressiveness, invasion and bone metastasis has been described. We previously showed that the extracellular matrix modifying enzyme lysyl oxidase (Lox), which promotes cell migration and invasion through cytoskeleton rearrangement, was overexpressed in ccRCC. Lox has a key role in formation of premetastatic bone lesions in breast and colon cancer through osteoclast activation and osteoblast inhibition. Previous data evidenced that TGF-β1 production is modulated by Arg tyrosine kinase in human renal tubular cells. Arg modulates, through cytoskeleton rearrangement, invasion and metastasis of breast and prostate cancers. Based on these data and using in vitro models of primary cell cultures and cell lines, we evaluated the molecular interactions among TGF-β1, Lox and Arg in ccRCC cells and the functional effects of these interactions on tumor invasion and osteoclast and osteoblast behavior responsible for premetastatic bone lesion formation. The expression and secretion of TGF-β1 and Lox, and Arg protein expression, were increased in ccRCC versus normal cortex primary cultures. In ccRCC cultures TGF-β1 and Lox secretion were positively correlated. TGF-β1 treatment of ccRCC 786-O cell line upregulated Lox expression and secretion and downregulated Arg protein level. The TGFβ-receptor inhibitor SB431542 reverted these effects. Inhibition of Smad-dependent TGF-β pathway by SIS3 and proteasome activity by MG132 rescued Arg protein level. Arg silencing by siRNA in 786-O cells induced an increment of TGF-β1 and Lox secretion, reverted by SB431542 treatment. Moreover, Arg silencing in 786-O cells decreased cell invasion analyzed by 3D invasion assay in collagen, even in presence of TGF-β1 treatment. TGF-β1 signalling inhibition with SB431542 reduced cell invasion even in Arg silenced cells. Treatment with 786-O conditioned media inhibited MC3T3-E1 osteoblast proliferation and increased osteoclastic differentiation of RAW264.7 cells, as evaluated by TRAP staining. Lox inhibitor βAPN partially reverted these effects. Preliminary results obtained using conditioned media of ccRCC primary cultures confirmed these observations. Overall, these data suggest that in ccRCC cells Arg modulates Lox production by secretion of TGF-β1 that, in turn, modulates Arg protein stability through a Smad-dependent pathway. The characterization of the complex interactions among TGF-β1, Lox and Arg, which modulate ccRCC cell invasion and osteoblast and osteoclast behavior involved in premetastatic bone lesion formation, can shed light on the molecular mechanisms of ccRCC progression.

Il meccanismo alla base della riparazione di un danno a cellule renali è ancora oggi oggetto di dibattito e potrebbe coinvolgere sia cellule terminalmente differenziate che l'esistenza di cellule staminali multipotenti quiescenti. Sfruttando il saggio di formazione di sfere e la tecnica del FACS sorting, il nostro gruppo ha isolato una popolazione di cellule marcate col clorante PKH26 che avessero caratteristiche di cellule staminali renali adulte (PKHhigh). In precedenza abbiamo valutato la capacità di queste cellule di differenziare in vitro in lineage epiteliale, podocitico ed endoteliale. Abbiamo anche dimostrato che la popolazione PKHhigh è eterogenea nella sua composizione e all'interno delle nefrosfere le cellule con capacità simil-staminali sono PKHhigh/CD133+/CD24- (RSC). Abbiamo recentemente pubblicato che le nostre cellule delle nefrosfere, che comprendono cellule PKHhigh e la loro progenie PKHlow/neg, sono in grado di ripopolare scaffold renali umani decellularizzati. Con questa ricerca, ora abbiamo come scopo: i) di dimostrare le capacità rigenerative delle cellule staminali PKHhigh, anche in assenza della loro progenie PKHlow/neg. ii) di trovare la signature molecolare delle RSC che, tra PKHhigh, sono le cellule con capacità staminali più ampie. Per raggiungere questi obiettivi, abbiamo messo in coltura cellule PKHhigh su scaffold acellulari per 30 giorni e le cellule delle strutture ripopolate sono state caratterizzate mediante immunofluorescenza sequenziale, utilizzando specifici marcatori di differenziamento. Alcune strutture hanno indicato un differenziamento terminale in lineage epiteliale tubulare prossimale o distale o in quello endoteliale. Solo poche strutture mostravano invece la coespressione di alcuni o di tutti i marcatori testati, suggerendo un fenotipo ancora immaturo. Per la comprensione della signature molecolare delle RSC, è stata eseguita l'analisi trascrittomica delle RSC stesse, della loro progenie PKHlow/neg e di colture primarie terminalmente differenziate e sono stati evidenziati geni differenzialmente espressi (DEG). L’analisi bioinfomatica mediante Gene Set Enrichment Analysis ha suggerito uno stato immaturo delle nostre RSC, ma comunque diverso da cellule staminali embrionali. Infine, incrociando le liste di DEG sono stati ottenuti potenziali marcatori e alcuni di essi sono stati selezionati e validati. In conclusione, abbiamo evidenziato le capacità differenziative in senso epiteliale sia prossimale che distale ed endoteliale delle cellule PKHhigh. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule PKHhigh, completamente prive di qualsiasi marcatore endoteliale, sono in grado di dare origine a strutture simil-endoteliali. La coespressione occasionale di marcatori epiteliali ed endoteliali in strutture ripopolate potrebbe indicare uno stato precoce di transizione verso un differenziamento terminale. Il possibile ruolo della progenie PKHlow / neg nel velocizzare il differenziamento terminale delle cellule PKHhigh dovrà essere chiarito. Infine, la signature delle RSC ottenuta potrà aprire la possibilità di isolamento diretto di cellule staminali renali adulte da tessuto renale normale. The mechanism underlying the recovery of renal cell injury is still a matter of debate that concerns the involvement of fully differentiated cells, or the existence of quiescent scattered multipotent stem cells. By sphere forming assay and sorting, our group isolated a population of PKH26 most fluorescent cells with characteristics of adult renal stem-like cells (PKHhigh cells). We previously assessed the ability of PKHhigh cells to differentiate in vitro along epithelial, podocytic and endothelial lineages. We also demonstrated that PKHhigh population is heterogeneous in composition and within nephrospheres the cells with stem capacities are PKHhigh/CD133+/CD24- (RSC). We recently published that our nephrosphere cells, comprising PKHhigh cells and their PKHlow/neg progeny, are able to repopulate human decellularized renal scaffolds. With this research, we now aim: I) to prove the regenerative capabilities of PKHhigh stem-like cells, even in absence of their PKHlow/neg progeny. II) to find the molecular signature of RSC that among PKHhigh cells are those with the wider stem capacities. To reach these aims, we cultured isolated PKHhigh cells on acellular scaffolds for 30 days and the cells of the repopulated structures were characterized by sequential immunofluorescence using specific markers of differentiation. Some structures indicated a specific lineage differentiation into proximal and distal tubular epithelium and endothelium. Only few structures coexpressed some or all markers tested, indicating still immature phenotypes. For the disclosure of RSC molecular signature, transcriptomic analysis of RSC, of their PKHlow/neg progeny and of terminally differentiated primary cell cultures (PCC) was performed and differentially expressed genes (DEG) were evidenced. Bioinformatic Gene Set Enrichment Analysis suggested a renal immature status of our RSC, but different from embryonic stem cells. Crossing DEG lists potential markers were obtained and some of them were selected and validated. In conclusion, we highlighted the proximal and distal tubular epithelial and endothelial differentiative and regenerative abilities of PKHhigh cells. Moreover, we showed that PKHhigh cells, completely lacking any endothelial marker, were able to give rise to endothelial-like structures. The occasional coexpression of epithelial and endothelial markers in repopulated structures may indicate a transitional early status toward cell differentiation. The eventual role of the PKHlow/neg progeny of PKHhigh cells in speeding up the complete PKHhigh differentiation will be clarified. Finally, the obtained RSC signature would open the possibility for the direct isolation of adult renal stem-like cells from normal kidney tissue.

Cancer stem cells (CSC) are a rare subset of malignant cells that constitute a reservoir of tumor‐initiating cells with the ability to both self‐renew and differentiate into bulk tumors. As well as for other tumors, also in Renal Cell Carcinoma (RCC) the identification of CSCs might represent a step toward the development of therapies able to totally eradicate the disease. In the present study, cells with stem properties were identified from cultures of clonal tumor spheres obtained from RCC tissues after standardization of sphere‐forming assay on RCC 786‐0 cell line. Spheres obtained from the cell line and from RCC tissues were similar in term of phenotypic features, growth kinetics and sphere forming efficiency (SFE). These spheres exhibited the expression of pluripotency genes as well as the activation of self‐renewal pathways, when compared to the cultures representative of the bulk tumor population. Moreover they overexpressed the adenosine deaminase acting on RNA (ADAR1 and ADAR2) that might be involved in the regulation of self‐renewal as demonstrated by the increase of SFE after overexpression in 786‐0 cell line. When injected in immunocompromised mice, cells from spheres had a higher ability to give rise to tumor. Moreover tumor spheres from RCC tissues, as well as from 786‐0, showed a heterogeneous composition, with different cell subpopulations, displaying diverse self‐renewal ability. These subpopulations were identified on the basis of the different intensity of fluorescence of the PKH26 dye, able to discriminate quiescent cells within a proliferating population. The ability to self‐renew of the different PKH populations depended on the grading of the tumor. Although not distinguishing CSCs from the bulk tumor, surface marker expression in combination with PKH assay further confirmed the heterogeneity of cells within the spheres and allowed to identify an enrichment of CD105+ and CD133+CD105+ cells in the self‐renewing PKHhigh population. In this study, by characterizing for the first time molecular pathways, such as Notch, JAK/STAT and RNA editing, that distinguish spheres, enriched in putative CSCs, from the bulk tumor, represented by primary cell cultures, we provided possible targets for new therapies that need to be further characterized in order to discern their role. Moreover, the combination of PKH assay and surface markers might be helpful for a better definition of the CSC population within RCC.