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Considering the relevance of establishing biodiversity conservation tools, the study aimed to investigate the TCM199 supplemented with different follicle-stimulating hormone (FSH) concentrations on survival and development of fresh and vitrified preantral follicles enclosed in red-rumped agouti ovarian tissues cultured in vitro. In the first experiment, six pairs of ovaries were fragmented and cultured for 6 days according to groups: 10 ng/mL pFSH (FSH10 group) and 50 ng/mL (FSH50 group). Non-cultured tissues were considered as a control. In the second experiment, vitrified/warmed fragments of four pairs of ovaries were cultured with the best concentration of FSH established (cryopreserved and cultured group). Non-cryopreserved (fresh control group) and cryopreserved but non-cultured (non-cultured group) tissues were used as controls. For both experiments, preantral follicles were evaluated for survival and development using morphological and viability analysis by trypan blue staining. After culturing fresh samples, FSH50 showed a higher percentage of morphologically normal follicles when compared to FSH10 (P < 0.05). This same response was observed for primordial follicles. Regardless of the concentrations of FSH used during in vitro culture, no difference was observed regarding the percentage of viable follicles and diameters (P > 0.05). Thus, the FSH50 group was used for second experiment, in which 76.2 ± 7.2% normal preantral follicles previously vitrified was found after 6-day culture, also presenting the highest values (P < 0.05) for morphology of primordial follicles (95.2 ± 4.7%). Nevertheless, in vitro culture did not affect the viability and diameter of preantral follicles of cryopreserved tissues (P > 0.05). In conclusion, TCM199 supplemented with 50 ng/mL FSH was efficient in maintaining the in vitro survival of fresh and vitrified red-rumped agouti preantral follicles. This was the first study related to the in vitro culture of ovarian preantral follicles in this species, aiming to contribute to its conservation.

The aim of this study was to compare the effects of Slow Freezing (SF) and Solid-Surface Vitrification (SSV) on the cryopreservation of the apical ear skin of domestic cats using histological tools. Fragments of skin obtained from six cats (Felis silvestres catus) were processed and destined for cryopreservation by SF and SSV, using a solution composed of Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) plus dimethyl sulfoxide (DMSO) at 1.5 M or 3.0 M, for SF and SSV, respectively, in addition to 0.25 M sucrose and 10% fetal bovine serum (FBS). After warming, the samples were destined for histological processing for subsequent staining with hematoxylin-eosin, Gromori trichrome, and Weigert staining, as well as the marking of nucleolus organizing regions (NORs) using silver nitrate. Thus, using the VSS technique, characteristics such as epidermis thickness, dermis, and total skin thickness, presented values similar to the control group (p > 0.05). The VSS technique proved to be efficient in maintaining the number of epidermal cells and the percentage of collagen fibers. It is concluded that the application of the VSS technique proved to be superior in the histological maintenance of the apical auricular skin of domestic cats, assisting in the generation of a somatic bank in the species. El objetivo de este estudio fue comparar los efectos de la Congelación Lenta (CL) y la Vitrificación de Superficie Sólida (VSS) en la criopreservación de la piel auricular apical en gatos domésticos utilizando herramientas histológicas. Fragmentos de piel obtenidos de seis gatos (Felis silvestres catus) fueron procesados ​​y destinados a la crioconservación por CL y VSS, utilizando una solución compuesta de Medio Esencial Mínimo Modificado por Dulbecco (DMEM) más dimetil sulfóxido (DMSO) a 1,5 M o 3,0 M, para CL y VSS, respectivamente, además de 0,25 M sacarosa y 10% de suero fetal bovino (SFB). Después del calentamiento, las muestras se destinaron al procesamiento histológico para la tinción posterior con tinción con hematoxilina-eosina, tricromo gromico y coloración de Weigert, así como el marcado de regiones organizadoras de nucleolos (NORs) utilizando nitrato de plata. Por lo tanto, utilizando la técnica VSS, características como el grosor de la epidermis, la dermis y el grosor total de la piel, presentaron valores similares al grupo de control (p > 0,05). La técnica VSS demostró ser eficiente para mantener el número de células epidérmicas y el porcentaje de fibras de colágeno. Resulta que la aplicación de la técnica VSS demostró ser superior en el mantenimiento histológico de la piel auricular apical de los gatos domésticos, ayudando en la generación de un banco somático en la especie. O objetivo do presente trabalho foi comparar os efeitos da Congelação Lenta (CL) e da Vitrificação em Superfície Sólida (VSS) na criopreservação da pele auricular apical de gatos domésticos utilizando ferramentas histológicas. Fragmentos de pele obtidos a partir de seis gatos (Felis silvestres catus) foram processados e destinadas à criopreservação por CL e VSS, utilizando uma solução composta por Meio Essencial Mínimo Modificado por Dulbecco (DMEM) acrescida de dimetilsulfóxido (DMSO) a 1,5 M ou 3,0 M, para CL e VSS, respectivamente, além de 0,25 M de sacarose e 10% de soro fetal bovino (SFB). Após o aquecimento, as amostras foram destinadas ao processamento histológico para posterior realização das colorações com hematoxilina-eosina, tricrômico de Gômori, e coloração de Weigert, bem como foi realizada a marcação de regiões organizadoras de nucléolo (NORs) utilizando nitrato de prata. Na técnica de VSS, características como espessura da epiderme, derme e espessura total da pele, apresentaram valores similares ao grupo controle (p > 0,05). Além disso, a VSS mostrou-se eficiente na manutenção do número de células epidermais e percentual de fibras de colágenas. Conclui-se que a aplicação da técnica de VSS mostrou-se superior na manutenção histológica da pele auricular apical de gatos domésticos, auxiliando na geração de um banco somático da espécie.

A criopreservação da pele representa uma ferramenta interessante para a conservação da biodiversidade animal. Nesse contexto, diferentes protocolos já foram empregados e ajustes metodológicos, especialmente quanto ao tipo e a concentração dos crioprotetores, são constantemente desenvolvidos, tanto para mamíferos domésticos quanto silvestres. Embora ambos os métodos de criopreservação, congelação e vitrificação, tenham sido utilizados na conservação tecidual, este último é atualmente o mais usual. Além disso, métodos de análise para a averiguação da eficiência da técnica são necessários para garantir que a pele criopreservada mantenha suas características viáveis após o aquecimento. Em geral, a criopreservação permite o armazenamento adequado, tanto durante o transporte até o processamento no laboratório, quanto em longo prazo visando à formação de criobancos. As células somáticas recuperadas da pele podem ser empregadas também para estudos da fisiologia da espécie, diferenciação e reprogramação celular, clonagem reprodutiva e terapêutica. Portanto, a presente revisão objetiva apresentar os aspectos técnicos da criopreservação da pele, com ênfase sobre a eficiência dos métodos empregados em mamíferos e sua aplicação em biotecnologias reprodutivas.

The cryopreservation of skin is an interesting tool for the conservation of animal biodiversity. In this context, different protocols have been employed and methodological adjustments, especially on the type and the concentration of the cryoprotectants, are constantly being developed for both domestic and wild mammals. Although both methods of cryopreservation, freezing and vitrification, have been used for tissue preservation, the latter is the most common. Moreover, analysis methods for the investigation of technical efficiency are required to ensure that the cryopreserved skin will maintain their viable characteristics after warming. In general, the cryopreservation allows proper storage both during transport to the processing in the laboratory as in long time in order to cryobank formation. The somatic cells recovered these tissues can also be used also for physiology studies of the species, cell differentiation and reprogramming, reproductive and therapeutic cloning. Therefore, the present review aims to present the technical aspects of cryopreservation of skin, with emphasis on the efficiency of methods employed in mammals and its application in reproductive biotechnologies. A criopreservação da pele representa uma ferramenta interessante para a conservação da biodiversidade animal. Nesse contexto, diferentes protocolos já foram empregados e ajustes metodológicos, especialmente quanto ao tipo e a concentração dos crioprotetores, são constantemente desenvolvidos, tanto para mamíferos domésticos quanto silvestres. Embora ambos os métodos de criopreservação, congelação e vitrificação, tenham sido utilizados na conservação tecidual, este último é atualmente o mais usual. Além disso, métodos de análise para a averiguação da eficiência da técnica são necessários para garantir que a pele criopreservada mantenha suas características viáveis após o aquecimento. Em geral, a criopreservação permite o armazenamento adequado, tanto durante o transporte até o processamento no laboratório, quanto em longo prazo visando à formação de criobancos. As células somáticas recuperadas da pele podem ser empregadas também para estudos da fisiologia da espécie, diferenciação e reprogramação celular, clonagem reprodutiva e terapêutica. Portanto, a presente revisão objetiva apresentar os aspectos técnicos da criopreservação da pele, com ênfase sobre a eficiência dos métodos empregados em mamíferos e sua aplicação em biotecnologias reprodutivas.

A conservação de células e tecidos somáticos possui um papel importante para a preservação da biodiversidade, otimização em manejos reprodutivos e sistemas terapêuticos. Isso é possível através do aperfeiçoamento de técnicas de criopreservação e uso desse material genético em outras biotecnologias reprodutivas, como a transferência nuclear (clonagem). Nesse contexto, faz-se necessário uma análise precisa da amostragem biológica após a criopreservação, avaliando a viabilidade e, consequentemente, a eficiência da técnica de criopreservação empregada. Assim, essa revisão objetiva abordar as várias estratégias empregadas na determinação da eficiência dos métodos de criopreservação de células e tecidos somáticos, enfatizando seus aspectos teóricos e práticos em algumas espécies de mamíferos.

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-05-14T14:16:56Z No. of bitstreams: 1 SamaraSJM_DISSERT.pdf: 1362227 bytes, checksum: 900ce322880b6c52e3ef2db5c8f1982c (MD5) Made available in DSpace on 2019-05-14T14:16:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SamaraSJM_DISSERT.pdf: 1362227 bytes, checksum: 900ce322880b6c52e3ef2db5c8f1982c (MD5) Previous issue date: 2019-02-21 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O cateto é um tayassuídeo abundante na fauna sul-americana, de grande potencial ecológico e econômico. A fim de estender o conhecimento a respeito da sua biologia reprodutiva, estudou-se a influência dos períodos climáticos em um clima semiárido sobre seus parâmetros seminais e perfil bioquímico do plasma seminal. Para isso, o ejaculado de 12 machos adultos foi obtido por eletroejaculação durante o período seco (setembro a novembro de 2017) e chuvoso (fevereiro a abril de 2018) e em seguida analisados quanto ao volume, concentração, motilidade, funcionalidade da membrana, integridade da membrana, estado de condensação da cromatina, morfologia espermática e pH. Para análise bioquímica, as amostras foram centrifugadas a 385 ×g por 10 minutos e o sobrenadante armazenado a -20°C até análise, no qual foram aquecidos a 25°C por 2 minutos e analisados por meio de kits bioquímicos comerciais, cujas absorbâncias foram mensuradas em espectrofotômetro mediante os comprimentos de ondas sugeridos por cada kit. Os resultados foram expressos em média e erro padrão e comparados por ANOVA seguida do teste de Tukey (P0,05) entre as estações para vários constituintes do plasma seminal, com valores de 140,8 ± 36,03 mg/dL e 169,7 ± 19,9 mg/dL para ácido cítrico, 152,3 ± 33,65 mg/dL e 332,0 ± 99,6 mg/dL para colesterol, 8,0 ± 2,26 g/dL e 7,0 ± 1,5 g/dL para proteínas totais, 5,7 ± 0,5 mg/dL e 5,9 ± 0,24 mg/dL para magnésio, 315,6 ± 103,94 mEq/L e 271,3 ± 45,57 mEq/L para cloretos, 9,4 ± 3,26 g/dL e 3,0 ± 0,64 g/dL para albumina e 12,3 ± 5,0 mg/dL e 75,1 ± 39,53 mg/dL para fósforo, 210,9 ± 93,9 μg/dL e 423,2 ± 228,1 μg/dL para o ferro e 403,6 ± 117,6 mmol/L e 198,4 ± 108,0 mmol/L para frutosamina, obtidos durante as estações seca e chuvosa, respectivamente. Por outro lado, a frutose (115,7 ± 44,2a mg/dL/ 849,2 ± 142,6b mg/dL) e o cálcio (15,6 ± 5,09a mg/dL/32,3 ± 5,3b mg/dL) foram significativamente mais predominantes no período chuvoso (P 0.05) were found between the stations for several constituents of the seminal plasma, with values of 140.8 ± 36.03 mg / dL and 169.7 ± 19.9 mg / dL for citric acid, 152.3 ± 33.65 mg / dL and 332.0 ± 99.6 mg / dL for cholesterol, 8.0 ± 2.26 g / dL and 7.0 ± 1.5 g / dL for total proteins, 5.7 ± 0.5 mg / dL and 5.9 ± 0.24 mg / dL for magnesium, 315.6 ± 103.94 mEq / L and 271.3 ± 45.57 mEq / L for chlorides , 9.4 ± 3.26 g / dL and 3.0 ± 0.64 g / dL for albumin and 12.3 ± 5.0 mg / dL and 75.1 ± 39.53 mg / dL for phosphorus, 210 , 9 ± 93.9 μg / dL and 423.2 ± 228.1 μg / dL for iron and 403.6 ± 117.6 mmol / L and 198.4 ± 108.0 mmol / L for fruits, obtained during dry and rainy seasons, respectively. On the other hand, fructose (115.7 ± 44.2a mg / dL / 849.2 ± 142.6b mg / dL) and calcium (15.6 ± 5.09a mg / dL / 32.3 ± 5.3b mg / dL) were significantly more prevalent in the rainy season (P

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Os bancos de recursos somáticos desempenham um papel crucial na conservação da diversidade genética, permitindo a conservação de amostras biológicas de diferentes populações. As células somáticas de onça-parda podem ser recuperadas desses bancos e usadas em técnicas assistidas para promover sua multiplicação e conservação. Em resposta à redução da população desta espécie de importância ecológica, o presente trabalho teve como objetivos avaliar os danos causados pela criopreservação na formação de bancos de tecidos somáticos (Etapa 1), bem como caracterizar linhagens celulares após cultivo prolongado e criopreservação (Etapa 2). Para tanto, fragmentos do pavilhão auricular derivados de quatro onças-pardas mantidas em zoológicos da cidade de Fortaleza, Ceará, foram distribuídos em duas etapas. Na primeira etapa, fragmentos criopreservados e não criopreservados foram avaliados quanto à espessura da pele, cartilagem, número de células, número de halos perinucleares, percentual de matriz colágena, e atividade proliferativa tecidual. Além disso, células resultantes dos fragmentos cultivados foram avaliadas quanto à morfologia, aderência, confluência, viabilidade, atividade proliferativa, atividade metabólica, estresse oxidativo e níveis de apoptose. Na segunda etapa, células caracterizadas como fibroblastos por imunocitoquímica, foram avaliadas quanto ao período de cultivo (primeira, terceira e décima passagem) e efeitos da criopreservação sobre morfologia, ultraestrutura, viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e níveis de apoptose. Na primeira etapa, a criopreservação aumentou a espessura da camada córnea nos tecidos, o número de halos perinucleares e lacunas vazias. Apesar disso, a criopreservação foi capaz de manter os padrões normais de fibroblastos, mesmo apresentando aumento no percentual de fibras colágenas. Além disso, a criopreservação manteve o potencial proliferativo dos tecidos e dos parâmetros avaliados durante o cultivo in vitro, principalmente quanto à viabilidade, atividade proliferativa e níveis de apoptose. Contudo, células de tecidos criopreservados apresentaram diminuição do metabolismo e do ΔΨm. Na segunda etapa, as células mostraram uma morfologia fusiforme típica com núcleos ovais localizados centralmente. As células foram identificadas como fibroblastos por marcação com vimentina. O cultivo in vitro após a primeira, terceira e décima passagem não alterou a maioria dos parâmetros avaliados. As células na terceira e décima passagem mostraram uma redução nos níveis de EROs (P < 0,05). A ultraestrutura revelou dano morfológico nos prolongamentos e núcleos de células derivadas da terceira e décima passagem. Além disso, a criopreservação resultou em uma redução no ΔΨm em comparação com as células não criopreservadas. Em conclusão, tecidos somáticos de onça-parda submetidos à criopreservação são viáveis e mantêm a integridade do tecido, apresentando alterações mínimas após o aquecimento. Adicionalmente, fibroblastos viáveis podem ser obtidos de tecidos somáticos do pavilhão auricular de onça-parda, com pequenas alterações após a décima passagem de cultivo in vitro e criopreservação Somatic resource banks play a crucial role in the conservation of genetic diversity, allowing the conservation of biological samples from different populations. Puma somatic cells can be recovered from these banks and used in assisted techniques to promote their multiplication and conservation. In response to the reduction in the population of this species of ecological importance, the present study aimed to evaluate the damages caused by cryopreservation in the formation of somatic tissue banks (Step 1), as well as to characterize cell lines after prolonged culture and cryopreservation (Step 2). For this purpose, fragments of the ear derived from four pumas kept in zoos in the city of Fortaleza, Ceará, were distributed in two stages. In the first stage, cryopreserved and non-cryopreserved fragments were evaluated for skin and cartilage thickness, number of cells, number of perinuclear halos, percentage of collagen matrix, and tissue proliferative activity. Moreover, cells resulting from the cultured fragments were evaluated for morphology, adherence, confluence, viability, proliferative activity, metabolic activity, oxidative stress, and levels of apoptosis. In the second stage, cells characterized as fibroblasts by immunocytochemistry were evaluated for the culture period (first, third and tenth passage) and effects of cryopreservation on morphology, ultrastructure, viability, proliferative activity, metabolism, levels of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and levels of apoptosis. In the first stage, cryopreservation increased the thickness of the corneum layer in the tissues and the number of perinuclear halos and empty gaps. Despite this, cryopreservation was able to maintain normal fibroblast patterns, even with an increase in the percentage of collagen fibers. Additionally, cryopreservation maintained the proliferative potential of the tissues and parameters evaluated during in vitro culture, mainly regarding viability, proliferative activity, and levels of apoptosis. Nevertheless, cells of cryopreserved tissues showed decreased metabolism and ΔΨm. In the second stage, the cells showed a typical spindle-shaped morphology with centrally located oval nuclei. The cells were identified as fibroblasts by staining with vimentin. In vitro culture after the first, third and tenth pass did not change most of the evaluated parameters. The cells in the third and tenth pass showed a reduction in ROS levels (P < 0.05). The ultrastructure revealed morphological damage in the extensions and nuclei of cells derived from the third and tenth passages. Also, cryopreservation resulted in a reduction in ΔΨm compared to non-cryopreserved cells. In conclusion, puma somatic tissues submitted to cryopreservation are viable and maintain the integrity of the tissue, with minimal changes after warming. Additionally, viable fibroblasts can be obtained from somatic tissues of the puma ear, with minor changes after the tenth passage of in vitro culture and cryopreservation

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES As cutias são mamíferos silvestres que apresentam importantes funções ecológicas por serem dispersadoras de sementes, além de contribuírem para o equilíbrio da cadeia alimentar. Esses animais são utilizados como modelo experimental tanto para o aperfeiçoamento de técnicas reprodutivas, quanto para a formação de bancos de germoplasma. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi utilizar a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) como ferramenta para o resgate e conservação do uso de gametas femininos de cutias (Dasyprocta leporina). A tese foi dividida em dois capítulos experimentais. No primeiro experimento foi analisado o uso do TCM-199 suplementado com diferentes concentrações de pFSH (10 e 50 ng/mL) sobre a morfologia, desenvolvimento e viabilidade de folículos ovarianos pré-antrais (FOPAS) inclusos em tecido ovariano. Em seguida, verificou-se o efeito desse sistema de cultivo in vitro (CIV) sobre os mesmos parâmetros dos FOPAS previamente à vitrificação. Após o cultivo, o grupo FSH50 apresentou maior porcentagem de folículos morfologicamente normais quando comparado ao grupo FSH10 (P < 0,05). Além disso, essa mesma resposta foi observada para os folículos primordiais. Independentemente das concentrações de FSH utilizadas durante o CIV, não foi observada diferença em relação ao percentual de folículos viáveis (P > 0,05). Assim, o grupo FSH50 foi utilizado para experimento posterior, no qual um total de 76,2 ± 7,2% de PAFs normais previamente vitrificados foi observado após a cultivo de 6 dias, apresentando os maiores valores (P < 0,05) para a morfologia dos folículos primordiais (95,2 ± 4,7 %). Contudo, o cultivo manteve a viabilidade dos FOPAS derivados de tecidos criopreservados (P > 0,05). No segundo experimento, os ovários de oito fêmeas foram recuperados e fragmentados, com quatro fragmentos de córtex imediatamente fixados e avaliados (grupo fresco). Os demais fragmentos foram processados pelo método de vitrificação de superfície sólida (SSV) ou ovarian tissue cryosystem (OTC) usando soro fetal bovino (SFB), etilenoglicol (EG) e sacarose (SAC) como crioprotetores, armazenados por duas semanas a -196 ºC e aquecidos. Posteriormente, os fragmentos foram submetidos a um cultivo in vitro de 24 h e avaliados quanto à carga microbiológica, morfologia dos FOPAS e integridade do DNA. Não houve contaminação fúngica; entretanto, as amostras vitrificadas de dois indivíduos apresentaram contaminação bacteriana de 79.200 unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC) / mL para SSV e 3.120 UFC / mL para OTC. Em relação à morfologia dos FOPAS, ambos os sistemas proporcionaram preservação adequada da morfologia, com valores superiores a 70% dos folículos normais observados antes e após a cultivo. O TUNEL revelou que tanto a SSV (52,39%) quanto o OTC (41,67%) podem preservar a integridade do DNA após a vitrificação e após 24 h de cultivo. Para a proliferação celular, baixas taxas foram detectadas para amostras frescas (11,53%) e SSV (29,87%); contudo, nenhuma evidência de proliferação foi encontrada quando OTC foi usado. Assim, o uso da MOIFOPA em cutias permitiu a conservação através da vitrificação em superfície sólida e utilizando o sistema OTC, bem como apresentou resultados promissores para o cultivo in vitro de FOPAS inclusos em tecido ovariano previamente vitrificados The agouti are wild mammals that have important ecological functions for being seed dispersers, in addition to contributing to the balance of the food chain. These animals are used as an experimental model both for the improvement of reproductive techniques and for the formation of germplasm banks. In this context, the aim of the present study was to use the manipulation of oocytes included in preantral ovarian follicles (MOIFOPA) as a tool for the rescue and conservation of the use of female agouti gametes (Dasyprocta leporina). The thesis was divided into two experimental chapters. In the first experiment, the use of TCM-199 supplemented with different concentrations of pFSH (10 and 50 ng/mL) was analyzed on the morphology, development and viability of preantral ovarian follicles (PAFs) included in ovarian tissue. Then, the effect of this in vitro culture system (IVC) on the same PAFs parameters prior to vitrification was verified. After cultivation, the FSH50 group had a higher percentage of morphologically normal follicles when compared to the FSH10 group (P < 0.05). Furthermore, this same response was observed for primordial follicles. Regardless of the FSH concentrations used during the IVC, no difference was observed in relation to the percentage of viable follicles (P > 0.05). Thus, the FSH50 group was used for a further experiment, in which a total of 76.2 ± 7.2% of previously vitrified normal PAFs was observed after 6 days of cultivation, with the highest values (P < 0.05) for the morphology of the primordial follicles (95.2 ± 4.7%). However, the culture maintained the viability of FOPAS derived from cryopreserved tissues (P > 0.05). In the second experiment, the ovaries of eight females were retrieved and fragmented, with four cortex fragments immediately fixed and evaluated (fresh group). The remaining fragments were processed by the solid surface vitrification (SSV) or ovarian tissue cryosystem (OTC) method using fetal bovine serum (SFB), ethylene glycol (EG) and sucrose (SAC) as cryoprotectants, stored for two weeks at -196 ºC and heated. Afterwards, the fragments were submitted to an in vitro culture for 24 h and evaluated for microbiological load, PAFs morphology and DNA integrity. There was no fungal contamination; however, vitrified samples from two individuals showed bacterial contamination of 79,200 colony-forming units per milliliter (CFU) / mL for SSV and 3.120 CFU / mL for OTC. Regarding the morphology of PAFs, both systems provided adequate preservation of morphology, with values above 70% of normal follicles observed before and after cultivation. TUNEL revealed that both SSV (52.39%) and OTC (41.67%) can preserve DNA integrity after vitrification and after 24 h of culture. For cell proliferation, low rates were detected for fresh samples (11.53%) and SSV (29.87%); however, no evidence of proliferation was found when OTC was used. Thus, the use of manipulation of oocytes included in preantral ovarian follicles in agouti allowed conservation through vitrification on solid surface and using the OTC system, as well as presented promising results for the in vitro culture of PAFs included in previously vitrified ovarian tissue

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O óleo essencial de Syzygium aromaticum (OESA) possui comprovada atividade antioxidante. Contudo, por seus bioativos serem de diferentes constituições, é necessária a aplicação de estudos bioguiados para denotar o maior potencial antioxidante do OESA, bem como determinar a concentração ideal. Assim, considerando que a produção in vitro de embriões (PIVE) em bovinos apresenta eficiência variável em virtude das condições de estresse oxidativo, a suplementação do meio com esses compostos pode ser uma alternativa para otimizar a técnica. Portanto, o objetivo foi avaliar o potencial antioxidante dos bioativos isolados do OESA em oócitos bovinos, sobre a maturação nuclear e citoplasmática, viabilidade das células do cumulus, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), níveis de glutationa intracelular (GSH), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), desenvolvimento embrionário partenogenético (Etapa 1); e diferentes concentrações do bioativo definido na primeira etapa sobre os mesmos parâmetros (Etapa 2). Para tanto, oócitos foram maturados nas seguintes suplementações: OESA20 (20 μg/mL OESA), EUG (83 μM eugenol), β-CA (19 μM β-cariofileno), ACT (12 μM acetato de eugenila), CIS (100 μM cisteamina) e controle (sem antioxidante) para a Etapa 1; e eugenol E83 (83 μM eugenol), E100 (100 μM eugenol), E120 (120 μM eugenol), controle positivo (100 μM cisteamina) e controle negativo (sem antioxidante) para Etapa 2. Na etapa 1, todos os antioxidantes foram superiores ao controle nas taxas de metáfase II (MII, P < 0,05). Contudo, EUG, OESA20 e CIS aumentaram as taxas de extrusão do primeiro corpúsculo polar (1CP, P < 0,05). Além disso, EUG apresentou taxas de expansão e viabilidade das células do cumulus superiores aos demais grupos (P < 0,05). As taxas de maturação citoplasmática por distribuição mitocondrial foram maiores nos grupos EUG e ACT, e para os padrões de agregação mitocondrial se destacaram EUG, ACT e CIS (P < 0,05). Os níveis de EROs foram reduzidos e os de GSH aumentaram com o EUG e CIS (P < 0,05). Ainda, todos os grupos mostraram menores níveis de ΔΨm comparado ao grupo controle e β-CA (P < 0,05). EUG, OESA20 e CIS promoveram maiores taxas de clivagem e qualidade embrionária, mas o EUG promoveu uma maior taxa de blastocistos e estruturas com ≥ 8 células (P < 0,05). Apesar da ação dos demais bioativos serem positivas, o eugenol promoveu a maior atividade e foi usado na etapa seguinte. Na etapa 2, as taxas de MII foram superiores para E83 quando comparados aos demais grupos (P < 0,05). E83, E120 e o controle positivo aumentaram as taxas de 1CP (P < 0,05). E83 e controle positivo resultaram em expansão e viabilidade de células cumulus superiores (P < 0,05). A maturação citoplasmática não diferiu entre os grupos com antioxidantes, mas, a agregação mitocondrial se destacou em E83 e controle positivo (P < 0,05). Um ΔΨm menor foi mostrado nos grupos suplementados com antioxidantes (P < 0,05). Os níveis de EROs reduziram com os grupos E83 e controle positivo, e os de GSH aumentaram com esses e o E120 (P < 0,05). A taxa de clivagem e o número de blastocistos eclodidos foi maior em E83, assim como a qualidade embrionária (P < 0,05). Em conclusão, apesar do β-CA e ACT terem efeitos antioxidantes, 83 μM de eugenol adicionado aos meios de MIV foi a mais interessante alternativa entre os bioativos para a manutenção da qualidade de oócitos bovinos, bem como promover o aumento do subsequente desenvolvimento embrionário The Syzygium aromaticum essential oil (EOSA) has proven antioxidant activity. Nevertheless, because its bioactive substances are of different constitutions, it is necessary to apply bioguided studies to denote the greater antioxidant potential of EOSA, as well as to determine the ideal concentration. Thus, considering that the in vitro embryo production (IVEP) in cattle has variable efficiency, due to oxidative stress conditions, medium supplementation with these compounds may be an alternative to optimize the technique. Therefore, the aim was to evaluate the antioxidant potential of EOSA bioactives in bovine oocytes on nuclear and cytoplasmic maturation, viability of cumulus cells, levels of reactive oxygen species (ROS), levels of intracellular glutathione (GSH), mitochondrial membrane potential (ΔΨm), parthenogenetic embryonic development (Step 1); and different concentrations of the bioactive defined in the first step on the same parameters (Step 2). Oocytes were matured in the following supplements: EOSA20 (20 μg/mL EOSA), EUG (83 μM eugenol), β-CA (19 μM β-caryophyllene), ACT (12 μM acetyl acetate), CYS (100 μM cysteamine) and control (without antioxidant) for step 1; and E83 (83 μM eugenol), E100 (100 μM eugenol), E120 (120 μM eugenol), positive control (100 μM cysteamine) and negative control (without antioxidant) for step 2. In the step 1, all antioxidants were superior to the control for metaphase II (MII) rates (P < 0.05). Nevertheless, EUG, EOSA20 and CYS increased the extrusion rates of the first polar body (1PB, P < 0.05). Moreover, EUG showed a superior expansion and viability of the cumulus cells rates (P < 0.05). The rates of cytoplasmic maturation by mitochondrial distribution were higher in the EUG and ACT, and for the patterns of mitochondrial aggregation EUG, ACT and CYS stood out (P < 0.05). ROS levels were reduced and GSH levels were increased with EUG and CYS (P < 0.05). All groups showed lower levels of ΔΨm compared to the control and β-CA (P < 0.05). EUG, EOSA20 and CYS promoted higher rates of cleavage and embryonic quality, but EUG promoted a higher rate of blastocysts and structures with ≥ 8 cells in the cleavage (P < 0.05). Although the action of the other bioactive agents was positive, eugenol promoted the greatest activity and was used in the next step. In the step 2, the MII rates were higher in the E83 when compared other groups (P < 0.05). E83, E120 and the positive control increased the rates of 1PB (P < 0.05). E83 and positive control resulted in higher expansion and viability of cumulus cells (P < 0.05). Cytoplasmic maturation did not differ among groups with antioxidants, but mitochondrial aggregation stood out in E83 and positive control (P < 0.05). A lower ΔΨm was shown in the groups supplemented with antioxidants (P < 0.05). The ROS levels decreased with E83 and positive control, and the GSH levels increased with these and the E120 (P < 0.05). The cleavage rate and the number of hatched blastocysts was higher in the E83, as well as the embryonic quality (P < 0.05). In conclusion, although β-CA and ACT have positive antioxidant effects, 83 μM of eugenol added to IVM medium was the most interesting alternative among bioactive agents for maintaining the quality of bovine oocytes, as well as promoting the increase of subsequent embryonic development

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Dada a importância das informações sobre o desenvolvimento intrauterino em tayassuídeos, objetivou-se descrever a morfologia externa de embriões e fetos de catetos criados em cativeiro. Foram utilizados dois conceptos para cada idade gestacional aos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 dias pós-cópula (dpc), e recém nascidos aos 140 dpc. No primeiro terço gestacional, têm-se acentuada curvatura corporal, vesículas encefálicas, somitos, órgãos internos, placóide do cristalino, saliência auricular, brotos dos membros. Aos 25 dias pós-cópula (dpc), os embriões apresentaram comprimento crown-rump (CCR) de (10,20 ± 0,85 mm), e peso (0,16 ± 0,02 g); aos 30 dpc CR (13,78 ± 0,08 mm) e peso (0,36 ± 0,02 g); aos 40 dpc CCR (22,12 ± 0,04 mm) e peso (1,37 ± 0,02 g). No segundo terço gestacional, os fetos perderam a curvatura corporal, com maior definição anatômica, como: formação do esqueleto, pavilhão auricular externo, narinas, pálpebras, pelos táteis, fechamento das suturas cranianas. Além disso, aos 50 dpc visualizou-se a glândula odorífera dorsal e diferenciação do tubérculo genital, com CCR (59,66 ± 0,66 mm) e peso (12,36 ± 0,79 g); aos 60 dpc, CCR (80,12 ± 4,12 mm) e peso (32,74 ± 2,27 g); aos 70 dpc, CCR (110,40 ± 1,23 mm) e peso (83,79 ± 3,20 g); aos 80 dpc, CCR (137,01 ± 2,06 mm) e peso (187,69 ± 17,20 g); aos 90 dpc, CCR (150,80 ± 4,24 mm) e peso (211,02 ± 10,11 g). No terço final da gestação, os órgãos encontravam-se completamente formados, com escurecimento da pele, abertura das pálpebras, erupção dentária, desenvolvimento da glândula odorífera dorsal, órgãos sexuais externos, e anexos fâneros. Aos 100 dpc apresentavam CCR (156,75 ± 2,33 mm) e peso (257,63 ± 1,65 g); aos 120 dpc CCR (209,65 ± 18,03 mm) e peso (399,40 ± 48,79 g). Já os neonatos apresentavam CCR (266,10 ± 6,22 mm) e peso (913,05 ± 10,82 g). Os dados permitiram determinar a curva de crescimento pré-natal, possibilitando uma estimativa mais confiável tendo em vista a utilização de idades gestacionais reais. Além disso, este estudo fornece informações que podem contribuir com o manejo reprodutivo adequado, e que agreguem no emprego de biotecnologias reprodutivas na espécie Given the importance of the information on intrauterine development in tayassuids, the objective of this study was to describe the external morphology of embryos and fetuses of collared peccaries raised in captivity. Two concepts were used for each gestational age and newborns. On the first third of gestation, there is a marked body curvature, brain vesicles, somites, internal organs, crystalline placoid, auricular protrusion, limb buds. At the 25th day post-copulation (dpc), the embryos had a crown-rump length (CCR) of (10.20 ± 0.85 mm), weighing (0.16 ± 0.02 g); at 30 dpc CCR (13.78 ± 0.08 mm), weighing (0.36 ± 0.02 g); and at 40 dpc CCR (22.12 ± 0.04 mm), weighing (1.37 ± 0.02 g). On the second gestational third, fetuses had lost their body curvature, with greater anatomical definition, such as: skeletal formation, external ear, nostrils, eyelids, tactile hair, closure of cranial sutures. In addition, at 50 dpc, the dorsal scent gland and genital tubercle differentiation were visualized, with CCR (59.66 ± 0.66 mm), weighing (12.36 ± 0.79 g); at 60 dpc, CCR (80.12 ± 4.12 mm), weighing (32.74 ± 2.27 g); at 70 dpc, CCR (110.40 ± 1.23 mm), weighing (83.79 ± 3.20 g); at 80 dpc, CCR (137.01 ± 2.06 mm), weighing (187.69 ± 17.20 g); and at 90 dpc, CCR (150.80 ± 4.24 mm), weighing (211.02 ± 10.11 g). In the final third of gestation, the organs were completely formed, with skin darkening, opening of the eyelids, dental eruption, development of the dorsal odorous gland, external sexual organs, and gender attachments. At 100 dpc it presents CCR (156.75 ± 2.33 mm), weighing (257.63 ± 1.65 g); and at 120 dpc CCR (209.65 ± 18.03 mm), weighing (399.40 ± 48.79 g). The neonates, on the other hand, had CCR (266.10 ± 6.22 mm), weighing (913.05 ± 10.82 g). The data made it possible to determine the neonatal growth, allowing a more reliable estimation, considering the utilization of a real gestational age. This study also provides information that may contribute to the adequate reproductive management, and it furthermore aggregates in the use of reproductive biotechnologies of the species

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O direcionamento dos primeiros passos para a realização da transferência nuclear de célula somática (TNCS) em catetos garantirá uma ferramenta efetiva na conservação da espécie, perante sua acelerada diminuição populacional e sua atividade ecológica indispensável para o ecossistema. Para tanto, a presente tese foi dividida em duas etapas (três experimentos por etapa), sendo a primeira etapa o estudo das células doadoras de núcleo ou carioplastos e a segunda etapa, o estudo das células doadoras de citoplasma ou citoplastos. Assim, diante da importância de carioplastos de qualidade reconhecida para a TNCS, nós inicialmente estabelecemos cinco linhagens de fibroblastos de catetos, monitorando a viabilidade, atividade metabólica e estresse oxidativo, de acordo com os efeitos do número de passagens (primeira, terceira e décima) e criopreservação. Embora não haja efeito desses critérios sobre a viabilidade, células em décima passagem tiveram uma redução de seu metabolismo. Adicionalmente, células congeladas/descongeladas tiveram um aumento no número de espécies reativas de oxigênio e potencial de membrana mitocondrial. Além disso, sabendo da importância de manter estas células armazenadas em um biobanco de maneira adequada, nós otimizamos a solução crioprotetora utilizada na congelação lenta de fibroblastos de catetos. Deste modo, a solução composta por 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) com 0,2 M de sacarose e 50% de soro fetal bovino (SFB) foi considerada a solução mais eficiente em manter a viabilidade, atividade proliferativa, metabolismo e níveis adequados de estresse oxidativo de células somáticas de catetos, quando comparada a soluções na ausência de sacarose e com 10% de SFB em diferentes combinações. Finalmente, um passo essencial no estabelecimento dos carioplastos para a TNCS consiste na sincronização das células em G0/G1 do ciclo celular. Deste modo, nós avaliamos diferentes métodos de sincronização do ciclo celular: (i) supressão de soro (SS) por um a quatro dias, (ii) inibição por contato (IC) por um a três dias e (iii) agentes químicos [DMSO, 6-dimetilaminopurina (6-DMAP), ciclohexamida (CHX), e citocalasina B (CB)] por um a dois dias, em termos de seus efeitos sobre a sincronização em G0/G1 e viabilidade. Assim, nós observamos que a IC por três dias foi o método mais eficiente para sincronização do ciclo celular e manutenção da viabilidade de fibroblastos de catetos. Portanto, com estes três experimentos, nós estabelecemos a etapa de carioplastos da TNCS de catetos, obtendo células de qualidade e aptas a serem usadas como doadoras de núcleo. Na segunda etapa, nós, inicialmente, adequamos as condições de maturação in vitro (MIV) de oócitos de catetos, avaliando o tempo de MIV e o efeito do fator de crescimento epidermal (EGF) sobre a habilidade meiótica. Assim, nós concluímos que 48 h é o período adequado para a MIV de oócitos quando comparado ao tempo de 24 h, de acordo com o potencial meiótico. Ainda, observou-se que o EGF pode ser utilizado para otimizar o meio de MIV. Finalmente, no terceiro experimento, nós avaliamos a habilidade de desenvolvimento destes oócitos após ativação artificial, usando a ionomicina como ativador primário e comparando diferentes ativadores secundários (6-DMAP, CHX e CB). Nós verificamos que a ativação química usando ionomicina e 6-DMAP foi a mais eficiente combinação, tendo esta tese alcançado como resultado significativo, uma taxa de 27,6% de blastocistos de catetos derivados da ativação oocitária artificial. Em síntese, nós obtivemos carioplastos e citoplastos que poderão ser empregados na TNCS de catetos, deixando a ponto as etapas fundamentais para a clonagem desta espécie. Ainda, destaca-se que os conhecimentos aqui gerados poderão ser aplicados em estudos de fecundação in vitro, compreensão do desenvolvimento embrionário, produção de células induzidas à pluripotência, e ensaios de toxicidade. Portanto, este trabalho foi um grande passo para a conservação de catetos The direction of the first steps for the achievement of somatic cell nuclear transfer (SCNT) in collared peccary will guarantee an effective tool in the conservation of the species, in view of its accelerated population decrease and its essential ecological activity for the ecosystem. Therefore, the present thesis was divided into two steps (three experiments per step), being the first step the study of the donor cells of nucleus or karyoplast and the second stage, the study of the donor cells of cytoplasm or cytoplasts. Thus, in view of the importance of acknowledge quality karyoplast for SCNT, we initially established five cell lines of collared peccary fibroblasts, monitoring viability, metabolic activity and oxidative stress, according to the effects of the number of passages (first, third and tenth) and cryopreservation. Although there is no effect of these criteria on viability, cells in tenth passage had a reduction in their metabolism. Additionally, frozen/thawed cells had an increase in the number of reactive oxygen species and mitochondrial membrane potential. Moreover, knowing the importance of maintaining these cells stored in a biobank properly, we optimize the cryoprotectant solution used in the slow freezing of collared peccary fibroblasts. Thus, the solution composed of 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) with 0.2 M sucrose and 50% fetal bovine serum (FBS) was considered the most efficient solution in maintaining the viability, proliferative activity, metabolism and adequate levels of oxidative stress of somatic cell cells, when compared to solutions in the absence of sucrose and with 10% FBS in different combinations. Finally, an essential step in establishing the karyoplast for SCNT is the synchronization of cells in G0/G1 of the cell cycle. Thus, we evaluated different cell cycle synchronization methods: (i) serum suppression (SS) for one to four days, (ii) contact inhibition (CI) for one to three days and (iii) chemical agents [DMSO, 6-dimethylaminopurine (6-DMAP), cyclohexamide (CHX), and cytochalasin B (CB)] for one to two days, in terms of their effects on G0/G1 synchronization and viability. Thus, we observed that the IC for three days was the most efficient method for synchronizing the cell cycle and maintaining the viability of collared peccary fibroblasts. Consequently, with these three experiments, we have established karyoplast stage of SCNT in collared peccary, obtaining quality cells and able to be used as nuclear donors. In the second stage, we initially adjusted the in vitro maturation (IVM) conditions of collared peccary oocytes, evaluating the IVM time and the effect of the epidermal growth factor (EGF) on the meiotic ability. Thus, we concluded that 48 h is the appropriate period for oocyte IVM when compared to 24 h, according to meiotic potential. Still, it was observed that EGF can be used to optimize the IVM medium. Finally, in the third experiment, we evaluated the developmental ability of these oocytes after artificial activation, using ionomycin as the primary activator and comparing different secondary activators (6-DMAP, CHX and CB). We found that chemical activation using ionomycin and 6-DMAP was the most efficient combination, with this thesis achieving as a significant result, a rate of 27.6% of blastocysts of collared peccaries derived from oocyte artificial activation. In summary, we got karyoplast and cytoplasts that may be employed in the SCNT of collared peccary, leaving the point the fundamental steps for the cloning of this species. Furthermore, it is emphasized that the knowledge generated here can be applied for in vitro fertilization, studies understanding of embryonic development, production cells induced to pluripotency, and toxicity assessments. Therefore, this work was a great step for the conservation of collared peccaries

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O quantitativo populacional cada vez mais reduzido de onças-pintadas, associado à sua importância ecológica, tem resultado no desenvolvimento de estratégias que promovam a sua conservação. Nesse sentido, células somáticas derivadas da pele destes animais podem ser empregadas para essa finalidade, seja na produção de embriões clones, na obtenção de células induzidas à pluripotência e nos estudos genéticos da espécie. Para tanto, o estabelecimento adequado destas amostras é etapa inicial para essas aplicações. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os danos gerados pelas condições de cultivo in vitro e criopreservação sobre o estabelecimento de cinco linhagens fibroblásticas derivadas de onças-pintadas adultas. Assim, fragmentos da pele da região auricular apical de uma fêmea e quatro machos foram cultivados in vitro para a obtenção das células somáticas. Inicialmente, para a identificação do tipo celular, células foram confirmadas como fibroblastos após análise morfológica e de imunofluorescência, e as cinco linhagens (um animal/uma linhagem) foram submetidas a dois experimentos. No primeiro experimento, células foram avaliadas em diferentes passagens do cultivo (primeira, terceira décima) para viabilidade, metabolismo e atividade proliferativa. No segundo experimento, células criopreservadas foram avaliadas quanto a viabilidade, metabolismo, atividade proliferativa, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e apoptose após descongelação em uma, três e dez passagens de cultivo. Células não criopreservadas foram utilizadas como controle. O cultivo in vitro após a primeira (26,1 h ± 4,9), terceira (22,9 h ± 1,6) e décima passagem (22,8 h ± 3,7) e criopreservação (30,0 h ± 1,4) não afetaram a atividade proliferativa. Além disso, nenhuma diferença foi observada para a viabilidade após a primeira (98,9% ± 0,8), terceira (92,5% ± 6,2), décima (95,7% ± 1,4) passagem e criopreservação (73,2% ± 9,8). Contudo, células cultivadas até a décima passagem (49,0% ± 3,3) e criopreservadas (32,7% ± 2,8) reduziram seu metabolismo. Adicionalmente, células criopreservadas mostraram em unidades de fluorescência arbitrárias altos níveis de EROs (1,4 ± 0,1) e ΔΨm alterado (0,9 ± 0,0), quando comparados às células não criopreservadas (1,0 ± 0,1 e 1,0 ± 0,2). Finalmente, células criopreservadas e cultivadas após dez passagens reduziram a atividade proliferativa reduzida (45,1% ± 12,0) e número de células viáveis (30,4% ± 5,7), quando comparadas as células criopreservadas e cultivadas após uma e três passagens. Em conclusão, fibroblastos viáveis podem ser estabelecidos a partir da orelha de onças-pintadas e que embora essas células não tenham mostrado alterações na viabilidade e atividade proliferativa, elas sofrem danos durante um longo cultivo e criopreservação nas condições estudadas The increasingly small population quantity of jaguars, associated with their ecological importance, has resulted in the development of strategies that promote their conservation. In this sense, somatic cells derived from the skin of these animals can be used for this purpose, either in the production of clone embryos, in obtaining cells induced to pluripotency and in genetic studies of the species. Thus, the proper establishment of these samples is an initial step for these applications. Therefore, the aim of the present study was to assess the damage caused by in vitro culture and cryopreservation conditions on the establishment of five fibroblast lines derived from adult jaguars. Thus, fragments of skin from the apical auricular region of one female and four males were cultured in vitro to obtain somatic cells. Initially, to identify the cell type, cells were confirmed as fibroblasts after morphological and immunofluorescence analysis, and the five strains (one animal/one line) were subjected to two experiments. In the first experiment, cells were evaluated in different culture passages (first, third, tenth) for viability, metabolism and proliferative activity. In the second experiment, cryopreserved cells were evaluated for viability, metabolism, proliferative activity, levels of reactive oxygen species (ROSs), mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and apoptosis after thawing and one, three and ten culture passages. Noncryopreserved cells were used as controls. The in vitro culture after the first (26.1 h ± 4.9), third (22.9 h ± 1.6) and tenth passage (22.8 h ± 3.7) and cryopreservation (30.0 h ± 1.4) did not affect proliferative activity. Moreover, no difference was observed for viability after the first (98.9% ± 0.8), third (92.5% ± 6.2), tenth (95.7% ± 1.4) passage and cryopreservation (73.2% ± 9.8). Nevertheless, cells cultured to the tenth passage (49.0% ± 3.3) and cryopreserved (32.7% ± 2.8) reduced their metabolism. Additionally, cryopreserved cells showed high levels of ROS (1.4 ± 0.1) and altered ΔΨm (0.9 ± 0.0) in arbitrary fluorescence units, when compared to non-cryopreserved cells (1.0 ± 0.1 and 1.0 ± 0.2). Finally, cryopreserved cells and cultured after ten passages reduced the reduced proliferative activity (45.1% ± 12.0) and number of viable cells (30.4% ± 5.7), when compared to cryopreserved and cultured cells after one and three passages. In conclusion, viable fibroblasts can be established from jaguars’ ears and that although these cells have not shown changes in viability and proliferative activity, they suffer damage during a long culture and cryopreservation under the studied conditions

Trabalho não financiado por agência de fomento, ou autofinanciado A presença de bactérias no sêmen pode causar perdas na função espermática e, consequentemente, interferir nas biotecnologias reprodutivas que façam uso desse material biológico. Dito isso, objetivou-se descrever a microbiota bacteriana aeróbia do sêmen e prepúcio dos catetos (Pecari tajacu) criados em cativeiro, bem como o impacto do uso de substâncias antimicrobianas na carga bacteriana e função espermática durante a conservação do sêmen dessa espécie. No primeiro experimento, foi realizada a cultura das bactérias aeróbias em amostras de sêmen e prepúcio de nove animais, bem como a quantificação destas e avaliação de parâmetros espermáticos no sêmen. Os isolados foram identificados e testados frente a concentrações de penicilina-estreptomicina, gentamicina e do gel da Aloe vera. Corynebacterium spp. e Staphylococcus spp. foram isolados em maior número no sêmen (64,1% e 20,5%, respectivamente) e no prepúcio (60,6% e 24,2%, respectivamente), variando de 0,4 a 21 × 105 unidades formadoras de colônia (UFC) por mililitro. A carga de Corynebacterium spp. foi correlacionada negativamente (P < 0,05) com a integridade da membrana espermática (r = −0.73055) e velocidade curvilinear (r = −0.69048). A combinação penicilina-estreptomicina (PE) e gentamicina (G) inibiram a maioria dos microrganismos enquanto a A. vera demonstrou baixa atividade antimicrobiana. No segundo experimento, foi analisada a toxicidade de antimicrobianos sobre a longevidade espermática pelo teste de termo resistência em seis amostras de sêmen, sendo cada uma diluída em Tris (controle) e em Tris acrescido da combinação penicilina-estreptomicina (2000 UI/mL-2 mg/mL) ou de gentamicina (70 μg/mL), e mantidas por 180 min a 37 °C. Verificou-se que os tratamentos não diferiram (P > 0,05) até 180 min, mas que o tratamento contendo G reduziu (P < 0,05) a integridade da membrana e a atividade mitocondrial das células espermáticas aos 180 min (53,1 ± 7,1% e 50,7 ± 6,2%, respectivamente) se comparado a 0 min (80,5 ± 4,7% e 86,3 ± 3,4%, respectivamente). No terceiro experimento, foi avaliado o efeito de duas concentrações de PE (2000 UI/mL – 2 mg/mL [2] e 1000 UI/mL – 1 mg/mL [1]) e G (70 μg/mL [7] e 30 μg/mL [3]) adicionadas aos diluentes Tris + 20% de gema de ovo (TG) e Tris + 20% de A. vera (TA) sobre a carga bacteriana e qualidade espermática em 10 amostras de sêmen mantidas sob refrigeração (5 °C) até 36 h. O tratamento contendo PE2, PE1 e G7, independente do diluente, controlaram (P < 0,05) o crescimento bacteriano durante o armazenamento (variando de 0.5 ± 0.3 103 a 10 ± 4.1 x 103 UFC/mL) até 36 h. Os tratamentos diluídos com TG com qualquer um dos antimicrobianos não demonstraram diferenças (P > 0,05) para a carga bacteriana e parâmetros espermáticos entre 0 e 36 h. Os tratamentos com TA, com ou sem antimicrobianos, afetaram (P < 0,05) a integridade da membrana e atividade mitocondrial dos espermatozoides após 12 h. O tratamento TG-G7 se destacou por manter algumas variáveis espermáticas por mais tempo, como a motilidade total (41,9 ± 6,1%) e progressiva (15 ± 2,6%) até 24 h, bem como a integridade de membrana (58.3 ± 2.1%) e velocidade curvilínea (76.7 ± 5.8%) até 36 h. Diante dos resultados, demonstrou-se a ocorrência de bactérias contaminantes no sêmen e prepúcio de catetos criados em cativeiro, com destaque para Corynebacterium spp. e Staphylococcus spp., bem como um impacto negativo da primeira sobre a função espermática no sêmen fresco. A combinação penicilina-estreptomicina (2000 UI/mL-2 mg/mL) e gentamicina (70 μg/mL) podem ser adicionadas ao Tris na diluição de sêmen, incubado a 37 °C por até 120 min, sem causar efeitos tóxicos aos espermatozoides. Estas drogas também foram eficazes no controle das bactérias presentes no sêmen refrigerado destes animais, por até 36 h, sem causar prejuizo a longevidade espermática The presence of bacteria in the semen can cause losses in sperm function and, consequently, interfere with reproductive biotechnologies that make use of this biological material. That said, the objective was to describe the aerobic bacterial microbiota of captive collared peccaries (Pecari tajacu) semen and foreskin, as well as the impact of the use of antimicrobial substances on the bacterial load and sperm function during the semen conservation of this species. In the first experiment, aerobic bacteria were cultured in semen and foreskin samples from nine animals, as well as their quantification and evaluation of sperm parameters in the semen. The isolates were identified and tested against concentrations of penicillin-streptomycin, gentamicin and Aloe vera gel. Corynebacterium spp. and Staphylococcus spp. were isolated in greater numbers in semen (64.1% and 20.5%, respectively) and in the foreskin (60.6% and 24.2%, respectively), ranging from 0.4 to 21 × 105 colony-forming units (CFU) per milliliter. The load of Corynebacterium spp. it was negatively correlated (P 0.05) until 180 min, but that the treatment containing G reduced (P < 0.05) the sperm membrane integrity and mitochondrial activity at 180 min (53, 1 ± 7.1% and 50.7 ± 6.2%, respectively) if compared to 0 min (80.5 ± 4.7% and 86.3 ± 3.4%, respectively). In the third experiment, the effect of two concentrations of SP (2 mg/mL - 2000 IU/mL [2] and 1 mg/mL - 1000 IU/mL [1]) and G (70 μg/mL [7] and 30 μg/mL [3]) added to Tris + 20% egg yolk (TE) and Tris + 20% A. vera (TA) diluents on bacterial load and sperm quality in 10 semen samples kept under refrigeration (5 ° C) up to 36 h. The treatment containing SP2, SP1 and G7, regardless of the diluent, controlled (P < 0.05) the bacterial growth during storage (ranging from 0.5 ± 0.3 103 to 10 ± 4.1 x 103 CFU/mL) up to 36 h. Treatments diluted with TE with any of the antimicrobials showed no differences (P > 0.05) for bacterial load and sperm parameters between 0 and 36 h. TA treatments, with or without antimicrobials, affected (P < 0.05) the sperm membrane integrity and mitochondrial activity after 12 h. The TE-G7 treatment stood out for maintaining some sperm variables for a longer time, such as total motility (41.9 ± 6.1%) and progressive (15 ± 2.6%) up to 24 h, as well as membrane integrity (58.3 ± 2.1%) and curvilinear velocity (76.7 ± 5.8%) up to 36 h. Given the results, it was demonstrated the occurrence of bacterial contaminants in semen and foreskin peccaries bred in captivity, especially Corynebacterium spp. and Staphylococcus spp., as well as a negative impact of the first on sperm function in fresh semen. The streptomycin-penicillin combination (2 mg/mL - 2000 IU/mL) and gentamicin (70 μg/mL) can be added to Tris in the semen dilution, incubated at 37 °C for up to 120 min, without causing toxic effects to sperm. These drugs were also effective in controlling the bacteria present in the refrigerated semen of these animals, for up to 36 h, without affecting sperm longevity

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A criopreservação de tecido gonadal masculino pode ser usada na conservação de material genético, no intuito da formação de um banco de germoplasma permitindo a manutenção da variabilidade genética em animais pré-puberes e adultos. Diante disso, objetivou-se estabelecer um protocolo eficiente de criopreservação de tecido testicular de catetos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 10 animais adultos, 5 em cada experimento, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres da UFERSA. No experimento I, cinco pares de testículos foram fragmentados (9 mm3) e alocados em grupos não-vitrificados (controle) e vitrificados em superfície sólida (VSS), após a exposição a diferentes crioprotetores (dimetilsulfóxido - DMSO 3,0 M, etileno glicol - EG 3,0 M e a combinação 1,5 M DMSO/1,5 M EG). As amostras não-vitrificadas e vitrificadas foram avaliadas quanto à histomorfologia, ultraestrutura, viabilidade e potencial de capacidade proliferativa. A conservação adequada da organização ultraestrutural do túbulo seminífero em termos de presença de lúmen e junções celulares foi observada somente com o uso da combinação DMSO/EG. Independentemente do crioprotetor, a vitrificação conservou efetivamente a visualização e a condensação nuclear das células de maneira semelhante à observada no grupo não vitrificado. Além disso, a combinação DMSO/EG proporcionou uma melhor conservação das membranas basais dos túbulos seminíferos que o DMSO (P < 0,05). Somente a combinação DMSO/EG manteve o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia (3,69 Regiões Organizadoras de Nucléolos - NORs/célula) e célula de Sertoli (3,19 NORs/célula) semelhantes aos controles (3,46 e 3,31 NORS/célula, respectivamente). Portanto, DMSO/EG é melhor que o DMSO ou o EG sozinho para VSS de tecido testicular de cateto adulto. No experimento II, cinco pares de testículos foram fragmentados (3 mm3) e alocados a grupos não-criopreservados (controle) e criopreservados usando três métodos de criopreservação: congelação lenta (CL), vitrificação em criotubos (VC) e VSS, sendo então expostos a diferentes combinações de crioprotetores (1,5 M DMSO/1,5 M EG, 1,5 M DMSO/1,5 M glicerol – G, e 1,5 M G/1,5 M EG). As amostras, não-criopreservadas e criopreservadas foram avaliadas quanto à fragmentação de DNA, viabilidade, potencial de capacidade proliferativa e histomorfologia. Apenas no uso de DMSO/EG durante a CL e VC foi possível conservar a integridade do DNA de modo similar ao controle (P>0,05). Em adição, observou-se que, independentemente do método de criopreservação, as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram capazes de conservar a viabilidade (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram o potencial de capacidade proliferativa para espermatogônia de modo similar; entretanto, apenas o G/EG, nos métodos de CL e VSS, foram inferiores ao controle para célula de Sertoli (P>0,05). Finalmente, o protocolo de CL usando as combinações DMSO/EG e DMSO/G foram melhores em evitar o aparecimento de edemas que G/EG – CL e DMSO/G – VSS (P 0.05). In addition, it was observed that, regardless the cryopreservation method, the DMSO/EG and DMSO/G combinations were able to preserve viability (P> 0.05). All treatments maintained the proliferative capacity potential for spermatogonia in a similar manner; however, G/EG in the SF and SSV methods impaired the proliferative potential of Sertoli cells (P> 0.05). Finally, the SF protocol using the DMSO/EG or DMSO/G combinations were better at preventing edema than G/EG for SF and DMSO/ G for SSV (P

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-03-13T20:37:48Z No. of bitstreams: 1 ÉricaAP_DISSERT.pdf: 2659940 bytes, checksum: 58ce5f4b33a30c1f066b1635248ddbc2 (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-13T20:37:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ÉricaAP_DISSERT.pdf: 2659940 bytes, checksum: 58ce5f4b33a30c1f066b1635248ddbc2 (MD5) Previous issue date: 2019-02-22 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A onça-pintada é um carnívoro de elevada importância ecológica para a biodiversidade mundial. Sua atual condição de vulnerabilidade a extinção requer estratégias de conservação, como a criopreservação de tecidos somáticos. Contudo, o emprego de técnicas de criopreservação depende do conhecimento das características histológicas e celulares dos tecidos em estudo. Portanto, os objetivos foram descrever histologicamente e por cultivo in vitro a pele do pavilhão auricular apical (Etapa 1) e comparar três técnicas de criopreservação [congelação lenta (CL), vitrificação direta em criotubos (VDC) e vitrificação em superfície sólida (VSS)] sobre a conservação dessas amostras de onça-pintada (Etapa 2). Para tanto, fragmentos foram recuperados de cinco animais oriundos de zoológicos do Brasil. Na primeira etapa, amostras de apenas dois animais, sendo um de pelagem amarela e outro de pelagem preta, foram avaliadas quanto à espessura da pele, quantificação e distribuição das células, percentual de matriz colágena, atividade proliferativa e viabilidade dos tecidos após cultivo. Para a segunda etapa, fragmentos foram criopreservados por CL, VDC ou VSS, e comparados com fragmentos não criopreservados (controle) quanto à espessura da pele, número de células, percentual de matriz colágena, e atividade proliferativa tecidual. Além disso, células resultantes dos fragmentos cultivados foram avaliadas quanto à morfologia, aderência, confluência, viabilidade, atividade proliferativa e metabólica. Assim, na primeira etapa, o estudo histomorfométrico mostrou uma espessura da pele total de 273,2 μm e 274,6 μm para onça pelagem amarela e preta, respectivamente. Além disso, melanócitos e fibroblastos para onça amarela foram de 9,3 e 23,0 e para onça preta foram de 11,3 e 26,8, respectivamente. Um percentual de matriz colágena de 67,0% e 49,0% foi observado para onça de pelagem amarela e preta, respectivamente. Adicionalmente, ambos os animais apresentaram uma atividade proliferativa celular variando de 1,20–1,30 e todos os fragmentos foram hábeis para promover o desprendimento celular, atingindo a subconfluência entre 10 a 15 dias. Na segunda etapa, todos os fragmentos criopreservados, independente da técnica empregada, mostraram uma redução na espessura da derme e da pele (P < 0,05). Embora uma matriz colágena similar ao grupo controle tenha sido observada somente para os fragmentos derivados dos grupos CL e VSS, todas as técnicas mantiveram o número de fibroblastos (P > 0,05). Além disso, VDC e VSS mantiveram a atividade proliferativa dos tecidos após o aquecimento. Após o cultivo, somente CL e VSS foram eficientes para a recuperação de células somáticas, de acordo com a maioria dos parâmetros avaliados. Em conclusão, a pele do pavilhão auricular de onça-pintada amarela e preta possui algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto à espessura, densidade de matriz colágena, e número de melanócitos e fibroblastos. Contudo, o padrão de crescimento celular foi similar a outros felídeos silvestres. Além disso, a VSS foi a técnica mais eficiente para a criopreservação de pele de onça-pintada, quando comparada a VDC e CL. Estes resultados irão contribuir para a formação criobancos nesta espécie, direcionando a criopreservação adequada de amostras somáticas para aplicações em medicina regenerativa e tecnologias de reprodução assistida The jaguar is a carnivore of high ecological importance for the world's biodiversity. Its current condition of vulnerability to extinction requires conservation strategies, such as cryopreservation of somatic tissues. Nevertheless, the use of cryopreservation techniques depends on the knowledge of the histological and cellular characteristics of the tissues under study. Therefore, the aims were described by histological techniques and by in vitro culture the apical ear skin (Step 1) and to compare three cryopreservation techniques [slow freezing (SF), direct vitrification in cryotubes (DVC) and solid-surface vitrification (SSV)] on the conservation of these jaguar samples (Step 2). Thus, fragments were recovered derived from five animals from zoos of Brazil. In the first step, samples of only two animals, one with yellow and one black pelage, were evaluated for skin thickness, cell quantification and distribution, percentage of collagen matrix, proliferative activity and tissue viability after culture. For the second step, fragments were cryopreserved by SF, DVC or SSV, and compared to non-cryopreserved fragments (control) for skin thickness, number of cells, percentage of collagen matrix, and tissue proliferative activity. Moreover, cells resulting from the cultured fragments were evaluated for morphology, adhesion, confluence, viability, proliferative and metabolic activity. Thus, in the first stage, the histomorphometric study showed a total skin thickness of 273.2 μm and 274.6 μm for jaguars of yellow and black pelage, respectively. Likewise, melanocytes and fibroblasts for yellow jaguar were 9.3 e 23.0 and to black jaguar were of 11.3 e 26.8, respectively. A percentage of collagen matrix of 67.0% e 49.0% was observed for jaguars of yellow and black pelage, respectively. Additionally, both animals had a cell proliferative activity ranging from 1.20–1.30 and all the fragments were able to promote cell detachment, reaching the subconfluence between 10 and 15 days. In the second step, all the cryopreserved fragments, regardless of the technique employed, showed a reduction in the thickness of the dermis and skin (P < 0.05). Although a collagen matrix similar to the control group was observed only for the fragments derived from the SF and SSV groups, all techniques maintained the number of fibroblasts (P > 0.05). Additionally, DVC and SSV maintained tissue proliferative activity after warming. After culture, only SF and SSV were efficient for the recovery of somatic cells, according to most of the evaluated parameters. In conclusion, the apical ear skin of the yellow and black jaguar has some variations relative to other mammals, regarding thickness, collagen matrix density, and number of melanocytes and fibroblasts. Nevertheless, the pattern of cell growth was similar to other wild felids. Moreover, SSV was the most efficient technique for jaguar skin cryopreservation when compared to DVC and SF. These results will contribute to the formation of crybanks of this species, directing the adequate cryopreservation of somatic samples for applications in regenerative medicine and assisted reproduction technologies

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-02-28T18:02:40Z No. of bitstreams: 1 LíviaBC_TESE.pdf: 2536040 bytes, checksum: 1e07086c287e77d17cbda56dadf8e096 (MD5) Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2019-04-10T14:08:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LíviaBC_TESE.pdf: 2536040 bytes, checksum: 1e07086c287e77d17cbda56dadf8e096 (MD5) Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2019-04-10T14:08:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LíviaBC_TESE.pdf: 2536040 bytes, checksum: 1e07086c287e77d17cbda56dadf8e096 (MD5) Made available in DSpace on 2019-04-10T14:08:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LíviaBC_TESE.pdf: 2536040 bytes, checksum: 1e07086c287e77d17cbda56dadf8e096 (MD5) Previous issue date: 2019-01-18 Trabalho não financiado por agência de fomento, ou autofinanciado A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais permite aumentar o potencial reprodutivo e garantir a conservação da biodiversidade. Neste sentido, objetivou-se estabelecer protocolos eficientes para o isolamento, cultivo e criopreservação de folículos pré-antrais de catetos. Em um primeiro experimento, ovários de seis fêmeas adultas foram destinados a diferentes métodos de isolamento folicular: enzimático utilizando a colagenase tipo IV, mecânico, utilizando lâmina de bisturi, e associação de ambos. Dentre estes, a maior quantidade (P < 0,05) de folículos foi obtido pelo método enzimático (961,7 ± 132,9), o qual também resultou na maior percentagem de folículos viáveis (98,7 ± 0,6%). Em adição, a integridade dos folículos obtidos pelo método enzimático foi confirmada pela microscopia eletrônica de varredura e por fluorescência (86%) após cultivo de 24 h. No segundo experimento, identificou-se a expressão dos receptores ALK-5 (tipo I) e BMPRII (tipo II) em fragmentos ovarianos de catetos por meio de PCR. Em seguida, procedeu-se o cultivo in vitro de tecido ovariano de seis animais por 1 ou 7 dias com Fator de Crescimento e Diferenciação 9 GDF-9 (0, 50, 100 ou 200 ng/mL). Verificou-se que os folículos cultivados por 7 dias com 200 ng/mL de GDF-9 mantiveram o diâmetro folicular e oocitário similar àqueles observados no dia 1. Em comparação com o controle fresco, a porcentagem de folículos em crescimento foi significativamente em todos os tratamentos, especialmente na concentração 200 ng/mL de GDF-9 por 7 dias. Ainda, a presença de GDF-9 a 200 ng/mL melhorou a proliferação celular após o cultivo. No experimento 3, o tecido ovariano foi vitrificado tanto em uperfície sólida como no sistema cryosystem com 3M etilenoglicol (EG), 3M dimetilsulfóxido (DMSO) ou 1,5 M EG associado a 1,5 M DMSO. Após vitrificação, constatou-se que todos os tratamentos mantiveram, de modo similar, a proporção de folículos viáveis e a ocorrência de proliferação celular. No entanto, todos os tratamentos mantiveram a proporção de PFs normais como o grupo controle (75,6 ± 8,6%), exceto (P

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-03-14T12:36:33Z No. of bitstreams: 1 MariaVOS_DISSERT.pdf: 2874285 bytes, checksum: 2619796d38d3c762a7be202e31df1eb0 (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-14T12:36:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MariaVOS_DISSERT.pdf: 2874285 bytes, checksum: 2619796d38d3c762a7be202e31df1eb0 (MD5) Previous issue date: 2018-06-29 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O uso de antioxidantes naturais em meios de cultivo pode ser uma alternativa para minimizar os efeitos negativos do estresse oxidativo produzido pelas condições in vitro. Nesse sentido, o óleo essencial de Syzygium aromaticum (OESA) possui propriedades terapêuticas, incluindo atividade antioxidante, e poderia ser utilizado durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos e incubação de espermatozoides bovinos. Portanto, o objetivo foi avaliar a atividade antioxidante do OESA sobre os gametas bovinos, especificamente sua adição (i) durante a MIV e influência sobre a maturação nuclear, maturação citoplasmática, viabilidade das células do cumulus, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e desenvolvimento embrionário partenogenético; e (ii) durante a incubação por 1 e 6 h de espermatozoides epididimários e sua influência sobre a qualidade espermática e níveis de EROs. Para tanto, gametas foram cultivados em meios contendo as seguintes suplementações: OESA0 (sem antioxidante), OESA10 (10 μg/mL de OESA), OESA15 (15 μg/mL de OESA), OESA20 (20 μg/mL de OESA), CIS (100 μM de cisteamina, somente para os oócitos) e Controle (somente para espermatozoides frescos, imediatamente avaliados). Assim, quanto à influência do OESA durante a MIV, nenhuma diferença foi observada para as taxas de maturação. Contudo, OESA15, OESA20 e CIS melhoraram a viabilidade das células do cumulus após a MIV, sendo somente o OESA20 maior que o OESA0 (P < 0,05). Além disso, embora nenhuma diferença tenha sido observada para os níveis de EROs (P > 0,05), oócitos derivados dos grupos OESA15, OESA20 e CIS mostraram ΔΨm menor que os oócitos do grupo OESA0 (P < 0,05). Adicionalmente, embora nenhuma diferença tenha sido observada para as taxas de clivagem de oócitos ativados partenogeneticamente, OESA20 melhorou as taxas de blastocistos, tanto quando calculada pelo número total de oócitos cultivados, quando pelo número total de oócitos clivados. Ainda, essas taxas de blastocistos foram diferentes do OESA0 e similares ao grupo CIS. Quanto à qualidade dos embriões produzidos, os grupos OESA15 e OESA20 mostraram um maior número de blastômeros quando comparados ao OESA0 (P < 0,05). Já quanto à influência do OESA durante a incubação dos espermatozoides, nenhuma diferença foi observada para a morfologia espermática (P > 0,05). Contudo, espermatozoides incubados na presença de OESA preservaram os parâmetros ao longo do tempo, especialmente para integridade estrutural e funcional da membrana plasmática, atividade mitocondrial, velocidade curvilínea e atividade metabólica (P < 0,05). Além disso, espermatozoides derivados do grupo OESA15 mantiveram resultados similares ao grupo controle para velocidade média após 6 h de incubação, integridade funcional da membrana e percentual de membrana danificada e mitocôndria inativa (P < 0,05). Ainda, nenhuma diferença foi observada para os níveis de EROs após a incubação. Em conclusão, OESA a 20 μg/mL e 15 μg/mL adicionado aos meios durante a MIV e a incubação espermática, respectivamente, pode ser uma interessante alternativa de antioxidante para manutenção da qualidade de gametas bovinos in vitro The use of natural antioxidants in culture media may be an alternative to minimize the negative effects of oxidative stress produced by in vitro conditions. In this sense, the essential oil of Syzygium aromaticum (EOSA), has therapeutic properties, including antioxidant activity, and could be used during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and incubation of bovine spermatozoa. Therefore, the aim was to evaluate the antioxidant activity of EOSA on bovine gametes, specifically its addition (i) during IVM and influence on nuclear maturation, cytoplasmic maturation, viability of cumulus cells, reactive oxygen species (ROS) levels, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), and parthenogenetic embryonic development; and (ii) during incubation for 1 and 6 h of epididymal spermatozoa and its influence on sperm quality and ROS levels. Thus, gametes were cultured in media containing the following supplements: EOSA (without antioxidants), EOSA 10 (10 μg/mL of EOSA), EOSA15 (15 μg/mL of EOSA), EOSA20 (20 μg/mL of EOSA) (100 μM of cysteamine, only for oocytes) and Control (only for fresh spermatozoa, immediately evaluated). Thus, regarding the influence of EOSA during IVM, no difference was observed for maturation rates. Nevertheless, EOSA15, EOSA 20 and CYS improved the viability of cumulus cells after IVM, being only the EOSA20 group greater than EOSA0 (P < 0.05). Moreover, although no difference was observed for ROS levels (P > 0.05), oocytes derived from the EOSA15, EOSA20 and CYS groups showed ΔΨm lower than the EOSA0 (P < 0.05) oocytes. Additionally, although no differences was observed for cleavage rates of the parthenogenetically activated oocytes, EOSA20 improved blastocyst rates, both when calculated by the total number of cultured oocytes, and by the total number of cleaved oocytes. Also, these blastocyst rates were different from EOSA0 group and similar to CYS group. As to the quality of the embryos produced, OESA15 and OESA20 groups showed a higher number of blastomeres when compared to OESA0 (P < 0.05). Regarding the influence of EOSA during sperm incubation, no difference was observed for sperm morphology (P > 0.05). Nevertheless, spermatozoa incubated in the presence of EOSA preserved the parameters over time, especially for structural and functional integrity of the plasma membrane, mitochondrial activity, curvilinear velocity and metabolic activity (P < 0.05). Moreover, spermatozoa derived from the EOSA15 group maintained similar results to the control group for medium velocity after 6 h of incubation, functional integrity of the membrane and percentage of damaged membrane and inactive mitochondria (P < 0.05). Also, no difference was observed for ROS levels after incubation. In conclusion, OESA at 20 μg/mL and 15 μg/mL added to media during IVM and sperm incubation, respectively, may be an interesting antioxidant alternative for maintaining the quality of bovine gametes in vitro

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-03-14T13:07:43Z No. of bitstreams: 1 LuanaGPB_DISSERT.pdf: 958241 bytes, checksum: 67525eb317a0e2042d269d1dc0edafec (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-14T13:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuanaGPB_DISSERT.pdf: 958241 bytes, checksum: 67525eb317a0e2042d269d1dc0edafec (MD5) Previous issue date: 2018-06-29 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES A presente dissertação teve por objetivo descrever a ultraestrutura de espermatozoides frescos e criopreservados de catetos por meio das microscopias eletrônicas de varredura (MEV) e transmissão (MET). Para tanto, três catetos machos adultos foram submetidos à eletroejaculação e o sêmen obtido foi imediatamente avaliado quanto à motilidade, integridade e funcionalidade da membrana, integridade da cromatina e morfologia por meio da microscopia de luz. Posteriormente, as amostras foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de gema de ovo (20%) e glicerol (6%), descongeladas após uma semana e avaliadas. Amostras de sêmen fresco e descongelado foram combinadas em pools distintos de espermatozoides que foram processados para MEV e MET, sendo microfotografadas e avaliadas. Após a descongelação, observou-se um declínio na motilidade espermática, integridade e funcionalidade da membrana (P < 0,05), porém a morfologia espermática e a integridade da cromatina avaliadas pela microscopia de luz não foram significativamente afetadas. Por meio da MEV, identificou-se que os espermatozoides de catetos apresentam cabeça achatada em forma de pá, medindo 6,1 ± 0,1 μm de comprimento e 3,8 ± 0,1 μm de largura, com um vasto acrossomo (4,3 ± 0,1 μm) apresentando uma clara demarcação entre a região pós-acrossomal, sendo delimitada por uma borda distendida, denominada de espessamento marginal. As caudas normais mediram 38,1 μm, sendo formadas por uma extensa peça intermediária de 15,5 μm de comprimento. Nas amostras descongeladas, tanto a MEV quanto a MET forneceram informações sobre crioinjúrias não detectadas através da microscopia de luz como a presença de vesículas no acrossomo, membrana plasmática frouxa, mitocôndrias vacuolizadas, fibras densas desorganizadas e cromatina descondensada. Em conclusão, o presente estudo fornece a primeira descrição da ultraestrutura dos espermatozoides de catetos. Além disso, a MEV e a MET contribuíram na identificação de alguns danos nanométricos provocados pelo processo de criopreservação, fornecendo informações valiosas para o aprimoramento de importantes protocolos usados para a formação de biobancos The objective of the present work was to describe the ultrastructure of fresh and cryopreserved spermatozoa from collared peccaries by scanning (SEM) and transmission electron microscopy (TEM). Three adult males were submitted to electroejaculation and semen was immediately evaluated for motility, membrane integrity and functionality, chromatin integrity and morphology. Subsequently, the samples were cryopreserved in Tris extender plus egg yolk (20%) and glycerol (6%), thawed after one week and evaluated. Samples of fresh and frozen-thawed semen were combined in distinct pools that were processed for SEM and TEM,. After thawing, there was a decline in sperm motility, membrane integrity and functionality (P < 0.05), sperm morphology and chromatin integrity assessed by light microscopy were not significantly affected. Analysis by SEM revealed that collared peccaries’ sperm presents a flattened head in a paddle format, measuring 6.1 ± 0.1 μm in length and 3.8 ± 0.1 μm in width. Collared peccaries’ sperm had a long acrosome (4.3 ± 0.1 μm), presenting a clear demarcation across the post-acrosomal region, being delimited by a distended border, called the marginal thickening. Normal tails measured 38.1 μm, formed by an extensive midpiece with 15.5 μm in length. In frozen-thawed analysis by SEM and TEM detected presence of vesicles in the acrosome, loose plasma membrane, vacuolized mitochondria, dense fibers disorganized, and decondensed chromatin. In conclusion, we provide the first description of the ultrasctruture on sperm from collared peccaries. Moreover, SEM and TEM help us to identify some nanometric damage caused by freezing-thawing procedures, thus providing valuable information for the improvement of protocols used for biobanking formation

Submitted by Wiqlifi Bruno de Freitas Melo (wbruno@ufersa.edu.br) on 2019-03-08T19:29:26Z No. of bitstreams: 1 LuizaBQN_DISSERT.pdf: 2106305 bytes, checksum: 2432b3886d7a9af0dde8d4038ea80708 (MD5) Made available in DSpace on 2019-03-08T19:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuizaBQN_DISSERT.pdf: 2106305 bytes, checksum: 2432b3886d7a9af0dde8d4038ea80708 (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES clonagem por transferência nuclear de células somáticas consiste numa atraente ferramenta para a conservação da biodiversidade e sua eficiência depende da obtenção e seleção de células doadoras de núcleo derivadas da pele de indivíduos de interesse. Especificamente para catetos, mamíferos silvestres encontrados algumas vezes em regiões de difícil acesso ou distantes de laboratórios especializados, o armazenamento a 4–6°C de tecidos da pele seria uma alternativa para a conservação do material genético desses animais. Portanto, o objetivo foi avaliar diferentes períodos de armazenamento e a presença de meio nutritivo sobre a recuperação de células somáticas derivadas da pele de catetos. Para tanto, 476 explantes auriculares (9,0 mm3) recuperados de onze animais adultos, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA), foram distribuídos em sete grupos: amostras não refrigeradas (controle) e refrigeradas na ausência ou presença de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco suplementado com 2,2 g/L de bicarbonato de sódio, 10% de soro fetal bovino e 2% de solução de antibiótico-antimicótico por 10, 30 e 50 dias de estocagem. Para as análises histológicas, amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4%, processadas e coradas com hematoxilina-eosina para avaliação da espessura da epiderme e derme, número de fibroblastos e halos. Além disso, fragmentos foram avaliados quanto à quantificação de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e atividade metabólica por brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Para as análises de cultivo in vitro, explantes foram cultivados e avaliados quanto à morfologia celular, qualidade do cultivo, viabilidade celular por azul de tripan, atividade proliferativa pela determinação da curva de crescimento e tempo de duplicação da população celular e atividade metabólica pelo ensaio de MTT. Comparações entre os fragmentos refrigerados e não refrigerados foram analisadas usando o software GraphPad Prisma. Quanto à espessura tecidual, apenas os fragmentos armazenados por 50 dias na ausência de meio nutritivo, apresentaram uma redução e aumento, respectivamente, da espessura da epiderme (55,8 ± 3,2 μm vs. 64,8 ± 2,1 μm) e derme (172,7 ± 2,5 μm vs. 147,6 ± 2,5 μm) quando comparado ao controle (P < 0,05). Além disso, o período de estocagem, independente da presença de meio, promoveu uma redução do número de fibroblastos e aumento no número de halos. Ainda, o número de AgNORs indicando atividade proliferativa, e atividade metabólica dos explantes, diminuíram com o período de armazenamento. Após o cultivo in vitro dos explantes, apenas os fragmentos armazenados sem meio por 50 dias não foram capazes de obter células somáticas. Além disso, células oriundas de explantes na presença de meio por 10 dias mostraram características similares às células de explantes não refrigerados, especialmente quanto à duração do cultivo, tempo de duplicação da população celular, dia de todos os explantes aderidos e tempo total de subconfluência. Desta forma, células viáveis de catetos podem ser recuperadas de fragmentos teciduais armazenados por até 50 dias na presença de meio nutritivo; contudo, tecidos somáticos refrigerados até 10 dias na presença de meio resultaram em células mais viáveis Cloning by somatic cell nuclear transfer is an attractive tool for biodiversity conservation and its efficiency depends on the obtaining and selection of nucleus donor cells derived from the skin of individuals of interest. Specifically for collared peccaries, wild mammals found sometimes in regions difficult to access or far from specialized laboratories, the storage at 4–6°C of skin tissues would be an alternative for the conservation of the genetic material of these animals. Therefore, the aim was to evaluate different periods of storage and the presence of nutrient medium on the recovery of somatic cells derived from skin of collared peccaries. Thus, 476 ear explants (9.0 mm3) recovered from eleven adult animals from the Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA) were distributed in seven groups: samples not refrigerated (control) and refrigerated in absence or presence of Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium supplemented with 2.2 g/L sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum and 2% antibiotic–antimycotic for 10, 30 and 50 days of storage. For the histological analyzes, samples were fixed in 4% paraformaldehyde, processed and stained with hematoxylin-eosin for evaluation of epidermal and dermal thickness, number of fibroblasts and halos. Moreover, fragments were evaluated for the quantification of argyrophilic nucleolar organizer region (AgNORs) and metabolic activity by 3-[4,5-dimethylthiazol- 2-yl] -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). For in vitro culture analyzes, explants were cultured and evaluated for cell morphology, culture quality, cell viability by trypan blue, proliferative activity by determination of the growth curve and doubling time of the cell population and metabolic activity by MTT assay. Comparisons between the refrigerated and not refrigerated fragments were analyzed using the GraphPad Prisma software. As for the tissue thickness, only the fragments stored for 50 days in the absence of nutrient medium showed a reduction and increase, respectively, in the thickness of the epidermis (55.8 ± 3.2 μm vs. 64.8 ± 2.1 μm) and dermis (172.7 ± 2.5 μm vs. 147.6 ± 2.5 μm) when compared to control (P < 0.05). Moreover, the storage period, regardless of the presence of medium, promoted a reduction in the number of fibroblasts and increase in the number of halos. Also, the number of AgNORs indicating proliferative activity, and metabolic activity of the explants, decreased with the storage period. After the in vitro culture of the explants, only the fragments stored without medium for 50 days were not able to obtain somatic cells. Likewise, cells from explants in the presence of medium for 10 days showed similar characteristics to the cells of not refrigerated explants, especially regarding the duration of culture, doubling time of the cell population, day of all attached explants and subconfluence total time. Thus, viable cells derived from collared peccaries can be recovered from tissue fragments stored for up to 50 days in the presence of nutrient medium; nevertheless, refrigerated somatic tissues up to 10 days in the presence of medium resulted in more viable cells

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O preá possui o corpo coberto por pêlos macios, cores variando do cinza ao marrom e são desprovidos de cauda. Os membros torácicos apresentam quatro dígitos e os pélvicos apenas três, e são curtos. Similaridades das características reprodutivas do preá com primatas superiores, os torna potenciais modelos experimentais, entre estas, o período gestacional, o tamanho da prole, o desenvolvimento dos filhotes, a placentação e a subplacenta. Em geral o ciclo reprodutivo é influenciado por mecanismos hormonais, dentre estes o regulado pela melatonina parece atuar sobre o preá, haja vista que esta espécie é tida como animal de hábito crepuscular. Assim, observando as características da espécie objetivou-se estudar a placenta, subplacenta e ovário do preá aos 30 dias de gestação submetidos à diferentes condições de iluminação. Para isto utilizou-se 15 preás fêmeas com cópula monitorada citologia vaginal. Identificada a cópula separava-se as fêmeas em grupos, sendo um submetido a iluminação constante, chamado de grupo claro, outro submetido ao escuro constante chamado de grupo escuro e o terceiro grupo mantido em condições normais. Aos trinta dias de gestação coletava-se as placentas e os ovários que eram pesados e mensuarados. As amostras eram fragmentadas fixadas por 48 h em paraformaldeido 4% em PBS 0.1M e pH 7.4, e incluídas em parafina segundo técnicas usuais. Secções de cinco micrômetros, foram coletados seriadamente e corados por HE. Pelo princípio de Cavalieri, o volume de referência foi calculado e com o auxílio de sistemas de testes de pontos e linhas, ImageJ® (bundled with 64-bit Java 1.6.0_24), foram calculados a densidade de volume, a densidade de superfície e a área de superfície para a placenta e para calcular a população folicular dos ovários de cada grupo experimental. Os dados foram analisados estatisticamente com uso do programa SigmaPlot (Systat Software Inc®) com grau de significância p≤0,05. realizou-se também imunofluorescência para receptores de melatonina (Santa Cruz Biotechnology, Inc.®). A placenta do preá apresentou diferenças morfométricas significativas entre o grupo controle e os demais em todos os aspectos analisados. Quanto ao volume o maior foi observado no grupo controle (5,37 cm3) e o menor no grupo claro (3,40 cm3) e dentre os constituintes placentários os ligados ao interlóbulo foram mais influenciado pela ausência de luz, a subplacenta apresentou diferença no estágio de desenvolvimento entre os grupos, condição evidenciada pela diferença no volume. A área vascular apresentou aumento nos grupos claro e escuro em relação ao grupo controle, assim como a distribuição dos receptores no tecido placentário. Já os ovários apresentaram forma elipsoide, superfície lisa, cor amarela. Os folículos mais abundantes foram os primordiais em todos os grupos sem diferença significativa. No entanto, os folículos antrais apresentaram o número significativamente superior no grupo escuro quando comparado aos demais grupos e a marcação para os receptores de melatonina foi mais evidente em folículos maduros e principalmente no grupo escuro. Assim, conclui-se que as diferentes condições de iluminação causam alterações morfológicas no tecido placentário e ovariano de preás e em especial a ausência de luz, influenciam na morfofisiologia do ovário The spix’s yellow toothed cavy has the body covered by soft hairs, colors ranging from gray to brown and are devoid of tail. The thoracic limbs present four digits and the pelvic limbs only three, and are short. Similarities of the reproductive characteristics of spix’s yellow-toothed cavy with superior primates make them potential experimental models, among them, the gestational period, the size of the offspring, the development of the pups, the placentation and the subplacenta. In general the reproductive cycle is influenced by hormonal mechanisms, among them the one regulated by melatonin seems to act on the preá, since this species is considered like animal of twilight habit. Thus, observing the characteristics of the species, the objective was to study the placenta, subplacenta and ovary of preá at 30 days of gestation submitted to different lighting conditions. For this it was used 15 female pretas with copula monitored vaginal cytology. Once the females were identified, the females were separated into groups, one being subjected to constant lighting, called a light group, another being submitted to a constant dark called a dark group, and the third group maintained under normal conditions. The placentas and ovaries were collected at the thirty-day gestation, which were weighed and measured. The samples were fragmented fixed for 48 h in 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS and pH 7.4, and embedded in paraffin according to usual techniques. Sections of five micrometers were serially collected and stained by HE. Based on the Cavalieri principle, the reference volume was calculated and, with the aid of ImageJ® (bundled with 64-bit Java 1.6.0_24) point-and-line test systems, the volume density, surface density and the surface area for the placenta and to calculate the follicular population of the ovaries of each experimental group. The data were statistically analyzed using SigmaPlot (Systat Software Inc) program with significance level p≤0.05. immunofluorescence was also performed for melatonin receptors (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). The spix’s yellow-toothed cavy placenta presented significant morphometric differences between the control group and the others in all aspects analyzed. The largest volume was observed in the control group (5.37 cm3) and the lowest in the clear group (3.40 cm3) and among the placental constituents the ones connected to the interlobe were more influenced by the absence of light, the subplacenta presented difference in stage of development between groups, a condition evidenced by the difference in volume. The vascular area showed increase in the light and dark groups in relation to the control group, as well as the distribution of the receptors in the placental tissue. The ovaries had an ellipsoid shape, a smooth surface, a yellow color. The most abundant follicles were the primordial in all groups with no significant difference. However, the antral follicles showed significantly higher numbers in the dark group when compared to the other groups and the marking for melatonin receptors was more evident in mature follicles and especially in the dark group. Thus, it is concluded that the different lighting conditions cause morphological changes in the placental and ovarian tissue of preas and especially the absence of light, influence the morphology of the ovary

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T14:18:25Z No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Made available in DSpace on 2017-08-21T16:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The donkeys (Equus asinus) are individuals historically relevant for the occupation of inhospitable areas around the world, but they have been losing importance due to the modernization of urban centers and the creation of traction and cultivation technologies. Due to this fact, many donkey breeds are already extinct or passing through a rapid process of population decrease. Among these breeds, the Northeast donkey, an endemic breed in Brazil, is highlighted. One of the strategies for conservation is the use of biotechnologies that facilitate reproduction, such as the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) that maximize the availability of oocytes for in vitro fertilization. The starting point for the use of this and other techniques are known reproductive physiology details of this breed as the characteristics of their gametes. The objective of this study was to estimate and to characterize the population of ovarian PFs derived from Northeast breed donkeys. Twenty females aging 5.1 ± 3.2 years and weighing 105.2 ± 18.6 kg were used. Animals were subjected to an ovariectomy procedure guided by laparoscopy for ovary collection. As the equines, donkey ovaries presented a kidney form and their parenchymal zone were extracted, taking the ovulation fossa as basis. Fragments of ovary were fixed in Carnoy, dehydrated in increasing Ethanol concentrations (70 to 99%), clarified using xylene and finally included in histological paraffin wax blocks. These blocks were serially sectioned on 7 μm slices at using a microtome. Every 120th slice was mounted on glass slides, stained with hematoxylin–eosin and read in inverted optical microscope. PFs presenting visible oocyte nuclei were measured at using an ocular micrometer and classified as primordial, primary or secondary. PFs were also classified and counted as morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells; or as degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasm shrinkage, and occasionally, granulosa cell layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. The PF population was estimated by using the formula: (number of follicles × number of sections × thickness of sections)/(number of sections observed × range of oocyte nuclei diameter). The results allowed us to estimate a total population of 21,135.3 ± 10,646.1 PFs per animal. From this population, 91.3% PFs were classified as primordial, 8.2% PFs as primary, and 0.3% as secondary. multioocyte PFs were observed in all animals, and they were more frequently present in primordial follicles, representing 0.99% of total PFs counted. The estimated population was distributed between the right and left ovaries, at 54.6% and 45.4%, respectively. Most PFs were considered morphologically normal (90.2%) and the smallest, degenerate (9.8%). An inversely proportional relationship between age and follicular population was identified, similarly to the relation between weight and follicular population. In the second experiment, the ovarian tissue of animals from the same group was subjected to a vitrification procedure using dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) as cryoprotectants in separate and associated. When comparing treatments, the use of DMSO 3M (81.7 ± 37.5%), EG 3M (83.7 ± 27.4%) and the combination of both DMSO 3M + EG 3M (81.8 ± 46.8%) allowed a greater percentage of follicular survival. When vitrified using the DMSO + EG combination, a higher percentage (62.5 ± 29.1%) of viable follicles was observed in relation to the other vitrification treatments (P 0.05). Thus, we concluded that the combination DMSO 3M plus EG was more efficient for the vitrification of ovarian tissue taken from Equus asinus, allowing adequate preservation of PAFS morphology, viability, DNA integrity and cell proliferative capacity. This work presented for the first time the estimate of ovarian preantral follicles in donkeys of the Northeastern breed and successful vitrification Os jumentos (Equus asinus) são animais historicamente relevantes para a ocupação de áreas inóspitas em todo o mundo, mas tem perdido espaço devido à modernização dos centros urbanos e a mecanização agrícola e transporte motorizado. Assim, muitas raças de jumentos já foram extintas ou encontram-se em rápido processo de queda populacional, e dentre elas está a raça Nordestina, endêmica do Brasil. Uma das estratégias de conservação é o uso de biotecnologias que favoreçam a reprodução assistida, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) que maximiza a disponibilidade de oócitos para outras biotécnicas. O ponto de partida para o uso desta e outras biotécnicas é conhecer detalhes da fisiologia reprodutiva e dos gametas da espécie ou raça que se deseja manipular. O objetivo desta tese é caracterizar e conservar por meio da vitrificação a população de folículos ovarinos pré-antrais (FP) em fêmeas asininas da raça Nordestina. No primeiro experimento, dez fêmeas com idade média de 5,1 ± 3,2 anos e peso médio de 105,2 ± 18,6 kg, constituíram o grupo de estudo. As mesmas foram submetidas a procedimento de ovariectomia guiada por laparoscopia para coleta dos ovários. Assim como nos demais equídeos, os ovários das jumentas apresentam formato reniforme e suas zonas parenquimatosa, incluindo a fossa ovariana, foram extraídas. Fragmentos do ovário foram fixados com carnoy, desidratados com etanol em concentrações crescentes (70 a 99%), clarificados usando xilol e finalmente inclusos em blocos de parafina histológica. Estes blocos foram sequencialmente seccionados em micrótomo em frações de 7μm. Uma a cada 120 frações foi montada em lâminas de vidro e corada com hematoxilina-eosina e lida em microscópio ótico. Os FPs que apresentaram núcleo visível foram fotografados, mensurados com uso de software e classificados como primordiais, primários e secundários. Os FPs classificados e contados foram identificados como normais ou degenerados. A população de FPs foi estimada usando a fórmula: (número de PF observados × número total de secções × espessura das secções) dividido pelo (número de secções observadas × diâmetro médio do núcleo dos oócitos). A população média estimada foi de 21.135,3 ± 10.646,1 FPs por animal. Destes, 91,3% foram identificados como primordiais, 8,2% como folículos primários e 0,4% como secundários. Folículos com múltiplos oócitos foram observados em todos os animais, todos classificados como primordiais, representando 0,99% do total de folículos. A população de PF estimada estava distribuída entre os ovários direito e esquerdo, em 54,6% e 45,4% respectivamente. A maior parte dos PFs foi considerada morfologicamente normal (90,2%) e a menor parcela, degenerados (9,8%). Foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a idade e a população folicular, semelhante à relação entre peso e população folicular. No segundo experimento, o tecido ovariano de jumentas foram submetidos a procedimento de vitrificação em superfície sólida usando dimetil sulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG), isoladamente em diferentes concentrações (3M e 6M) e associados, como agentes crioprotetores. Quando comparados aos tratamentos o uso do DMSO 3M (81,7 ± 37,5%), EG 3M (83,7 ± 27,4%) e a combinação de DMSO 3M + EG 3M (81,8 ± 46,8%) apresentaram um grande percentual de folículos morfologicamente normais. O uso do DMSO 3M + EG 3M, apresentou o maior percentual (62,5 ± 29,1%) de folículos viáveis em relação aos demais tratamentos (P

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-03-22T14:51:38Z No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) Made available in DSpace on 2017-03-22T14:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) Previous issue date: 2016-11-01 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The cryopreservation of somatic tissue derived from collared peccaries represents an interesting step in the obtainment and conservation of cells for nuclear transfer (cloning). In this sense, tissue vitrification protocols need to be optimized to ensure maximum preservation of viable cell characteristics. Therefore, the aims of this study were to characterize histologically the peripheral auricular integumentary system (Stage 1) and evaluate different cryoprotectants in the solid-surface vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Stage 2). Thun, ear fragments (9.0 mm3) were collected of sixteen animals derived from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In the first stage, tissue samples were evaluated for the characterization of layers, its components and proliferative activity. For the second stage, tissue fragments were cryopreserved by solidsurface vitrification using Dulbecco modified minimum essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum and different cryoprotectants and concentrations [dimethylsulfoxide (DMSO, 3.0 M), ethylene glycol (EG; 3.0 M) and association DMSO/EG (1.5 M; 1.5 M) in the absence and presence of sucrose (0.25M)]. After two weeks, warmed and non-vitrified (control) fragments were analyzed using histological techniques. Thus, for both steps, tissue samples were evaluated using hematoxylin-eosin and Gomori Trichrome, quantification of regions argyrophilic nucleolar organizer (AgNORs) and viability by MTT assay (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Also, in the first stage, fragments were analyzed by transmission electronic microscopy. Thus, in the first stage, sizes of 104.2 μm and 222.6 μm were observed in the epidermis and dermis, with a volumetric ratio of 36.6% and 58.7%, respectively. Moreover, in the epidermis were evidenced the basal layer (22.5 μm), intermediate (53.5 μm) and cornea (28.2 μm), with mean values of 65.3 epithelial cells, 43.4 melanocytes and 14.8 perinuclear halos. Already the dermis has 127 fibroblasts with 2.5 AgNORs by nucleolus. Additionally, the metabolic activity was 0.243. In the second stage, the 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7) and dermis (34.5 vs. 36.6), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), and AgNOR ratio (0.09 vs. 0.17), respectively. In conclusion, the peripheral auricular integumentary system derived from collared peccaries possessed some variations compared to other mammals, as the number of layers and thickness of the epidermis, number of epithelial cells, melanocytes and proliferative parameters. Moreover, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose resulted in a better cryoprotectant composition in the vitritification for somatic tissue of collared peccaries A criopreservação de tecido somático de catetos representa uma etapa interessante na obtenção e conservação de células para a transferência nuclear (clonagem). Nesse sentido, protocolos de vitrificação tecidual necessitam ser otimizados para garantir a máxima conservação das características viáveis das células. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar histologicamente o sistema tegumentar da região auricular periférica (Etapa 1) e avaliar diferentes crioprotetores na vitrificação em superfície sólida de tecido somático de catetos (Etapa 2). Para tanto, fragmentos auriculares (9,0 mm3) foram recuperados de dezesseis animais oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA). Na primeira etapa, amostras teciduais foram avaliadas quanto à caracterização das camadas, seus componentes e atividade proliferativa. Para a segunda etapa, fragmentos teciduais foram criopreservados por vitrificação em superfície sólida em meio essencial mínimo modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino e diferentes crioprotetores e concentrações [dimetilsulfóxido (DMSO; 3,0 M), etilenoglicol (EG; 3,0 M) e associação DMSO/EG (1,5 M; 1,5 M) na ausência e presença de sacarose (0,25 M)]. Após duas semanas, fragmentos aquecidos e não criopreservados (controle) foram analisados usando técnicas histológicas. Assim, para ambas as etapas, amostras teciduais foram avaliadas usando colorações hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori, quantificação de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e viabilidade pelo ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Ainda, na primeira etapa, fragmentos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, na primeira etapa, tamanhos de 104,2 μm e 222,6 μm foram observados para epiderme e derme, com uma proporção volumétrica de 36,6% e 58,7%, respectivamente. Além disso, na epiderme, foram evidenciadas as camadas basal (22,5 μm), intermediárias (53,5 μm) e córnea (28,2 μm), com valores médios de 65,3 de células epidermais, 43,4 melanócitos e 14,8 de halos perinucleares. Já a derme apresentou 127 fibroblastos com 2,5 AgNORs por nucléolo. Adicionalmente, a atividade metabólica foi de 0,243. Na segunda etapa, a combinação de 3,0 M de EG com sacarose foi adequada em manter as características teciduais normais quando comparado com os fragmentos não vitrificados, especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7) e derme (34,5 vs. 36,6), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0) e razão de AgNOR (0,09 vs. 0,17), respectivamente. Em conclusão, o sistema tegumentar auricular periférico de catetos possuiu algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto ao número de camadas e espessura da epiderme, quantidade de células epidermais, melanócitos e parâmetros proliferativos. Além disso, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose resultaram na melhor composição de crioprotetores na vitrificação de tecido somático de catetos 2017-03-21

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-03-07T12:56:11Z No. of bitstreams: 1 MagdaLTS_DISSERT.pdf: 1454861 bytes, checksum: 4612469437c8dd924c24af03a052758d (MD5) Made available in DSpace on 2017-03-07T12:56:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MagdaLTS_DISSERT.pdf: 1454861 bytes, checksum: 4612469437c8dd924c24af03a052758d (MD5) Previous issue date: 2016-03-30 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The maintenance of metabolic activities during the in vitro culture of somatic cells of wild animals, especially collared peccary (Pecari tajacu), is an interesting step in the conservation of these cells for use in nuclear transfer (cloning). In this context, it is necessary to optimize the in vitro culture conditions of somatic cell by establishment of some appropriate supplementations to the media, in order to ensure the maximum preservation of the viable cell characteristics. Therefore, this study aimed to optimize the composition of the culture means of somatic cell derived from ear tissue of collared peccaries, evaluating two concentrations of fetal bovine serum (E1: FBS; 10% vs. 20%) and epidermal growth factor (E2: EGF, 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Thus, tissue fragments from 18 adult animals were submitted to primary culture and subcultures for 40 days until the fourth passage and the resulting cells were analyzed for morphology, adhesion, subconfluence, proliferative activity for developing growth curve for seven days and determining the population doubling time (PDT), viability by trypan blue and functional/metabolic activity by assay 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). Moreover, in the E1, comparisons as cell adhesion were performed with cells cultured in the presence of bovine serum albumin (BSA, 0.5% and 1.0%). All data were analyzed by ANOVA followed by post hoc test. In the E1, no difference (P>0.05) was observed between the concentrations of FBS for the number of adhered [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39] and subconfluent fragments [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39], day all adhered [SFB10: 3.5 vs. SFB20: 3.0], with growth [SFB10: 7.4 vs. SFB20: 7.2] and subconfluent samples [SFB10: 11.8 vs. SFB20: 11.8]. However, significant values were observed in cells cultured in the presence of 20% FBS for viability [SFB10: 85.6% vs. SFB20: 98.2%], PDT [SFB10: 155.4 h vs.77.25 h] and MTT assay [SFB10: 0.57-0.57 vs. SFB20: 0.82-0.99 (D5-D7)]. Additionally, comparisons of supplementation of BSA and FBS confirm the potential FBS cell adhesion. Thus, 20% FBS was used in the following experiment. In the evaluation of the presence of EGF in culture, no difference was observed in the evaluated parameters for the number of attached [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] and subconfluent fragments [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] day all adhered [EGF0: 4.9 vs. EGF5: 7.0 vs. EGF10: 3.5] growth [EGF0: 7.2 vs. EGF5: 8.2 vs. EGF10: 7.9] and subconfluent samples [0 EGF: 12.6 vs. EGF5: 16.6 vs. EGF10:12.6], viability [EGF0: 84.3% vs. EGF5: 88.8% vs. EGF10: 87.0%], PDT [EGF0: 69.6 h vs. EGF5: 64.8 h vs. EGF10: 65.3 h] and MTT assay [EGF0: 1.26-1.38 vs. EGF5: 1.06-1.14 vs. EGF10: 1.13-1.16 (D5-D7)]. In all experiments, the growth curves showed clear log and lag phases of development. In conclusion, 20% FBS is suitable for the recovery of somatic cells in vitro; however, EGF does not improve the quality of growing these cells A manutenção das atividades metabólicas durante o cultivo in vitro de células somáticas de animais silvestres, especialmente catetos (Pecari tajacu), representa uma etapa interessante na conservação dessas células para aplicação na transferência nuclear (clonagem). Nesse contexto, faz-se necessário a otimização das condições de cultivo in vitro de células somáticas pelo estabelecimento de algumas suplementações adequadas aos meios, visando garantir a máxima preservação das características celulares viáveis. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a composição do meio de cultivo de células somáticas derivadas de tecido auricular de catetos, avaliando duas concentrações de soro fetal bovino (E1: SFB; 10% vs. 20%) e fator de crescimento epidermal (E2: EGF; 5 ng/mL vs. 10 ng/mL). Para tanto, fragmentos teciduais de 18 animais adultos foram submetidos ao cultivo primário e subcultivos por 40 dias, até a quarta passagem e as células resultantes foram analisadas quanto à morfologia, aderência, subconfluência, atividade proliferativa pela elaboração de curva de crescimento por sete dias e determinação do tempo de duplicação da população (PDT), viabilidade por azul de tripano e atividade funcional/metabólica pelo ensaio de brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Além disso, no E1, comparações quanto à adesão celular foram realizadas com células cultivadas na presença de albumina sérica bovina (BSA, 0,5% e 1,0%). Todos os dados foram analisados por ANOVA seguido por teste post-hoc. No E1, nenhuma diferença (P>0,05) foi observada entre as concentrações de SFB para o número de fragmentos aderidos [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39] e subconfluentes [SFB10: 39/39 vs. SB20: 35/39], dia de todas as amostras aderidas [SFB10: 3,5 vs. SFB20: 3,0], com crescimento [SFB10: 7,4 vs. SFB20: 7,2] e subconfluentes [SFB10: 11,8 vs. SFB20: 11,8]. Contudo, valores significativos foram observados em células cultivadas na presença de SFB a 20% quanto à viabilidade [SFB10: 85,6% vs. SFB20: 98,2%], PDT [SFB10: 155,4 h vs.77,2 h] e ensaio de MTT [SFB10: 0,57-0,57 vs. SFB20: 0,82-0,99 (D5-D7)]. Adicionalmente, comparações da suplementação do BSA e SFB confirmaram o potencial de adesão celular do soro. Assim, SFB a 20% foi empregado no experimento seguinte. Já na avaliação da presença de EGF no cultivo, nenhuma diferença foi observada nos parâmetros avaliados para o número de fragmentos aderidos [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31] e subconfluentes [EGF0: 31/31 vs. EGF5: 31/31 vs. EGF10: 31/31], dia de todas as amostras aderidas [EGF0: 4,9 vs. EGF5: 7,0 vs. EGF10: 3,5], em crescimento [EGF0: 7,2 vs. EGF5: 8,2 vs. EGF10: 7,9] e subconfluentes [EGF0: 12,6 vs. EGF5: 16,6 vs. EGF10: 12,6], viabilidade [EGF0: 84,3% vs. EGF5: 88,8% vs. EGF10: 87,0%], PDT [EGF0: 69,6 h vs. EGF5: 64,8 h vs. EGF10: 65,3 h] e ensaio de MTT [EGF0: 1,26-1,38 vs. EGF5: 1,06-1,14 vs. EGF10: 1,13-1,16 (D5-D7)]. Em todos os experimentos, as curvas de crescimento apresentaram nítidas fases log e lag de desenvolvimento. Em conclusão, o SFB a 20% é adequado para a recuperação de células somáticas in vitro; contudo, o EGF não melhora a qualidade do cultivo dessas células 2017-03-07

O objetivo da presente tese foi aplicar biotécnicas no monitoramento e controle do ciclo estral de espécie silvestres do bioma caatinga, como ferramenta para aperfeiçoamento do manejo em cativeiro, bem como conservação ou multiplicação dessas espécies. A tese foi dividida em 3 experimentos. No primeiro, foi realizado o monitoramento do ciclo estral de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) por diferentes métodos de monitoramento, na qual foi observado ciclo estral com duração de 23,5 ± 3,12 dias, com uma fase folicular de 8,8 ± 1,4 dias e 15,62 ± 2,1 dias de fase lútea. Na fase folicular foram observadas secreção sanguinolenta vaginal, edema vulvar, presença de muco e facilidade de introdução do swab, com pico de estrógeno de 240,66 ± 12,69 pg/ml e predomínio de células superficiais na citologia vaginal, com visualização de folículos ovarianos por ultrassonografia. Na fase lútea foi observada ausência de secreção sanguinolenta e dificuldade de introdução do swab, além do aumento nos níveis de progesterona (10,83 ± 1,86 ng/ml) e visualização de corpo lúteo por ultrassom. No segundo experimento, dois protocolos para indução e sincronização de estro foram testados em cutias (Dasyprocta leporina). O primeiro, consistia na administração de duas doses de cloprostenol (5µg) com intervalo de nove dias; e o segundo, na administração de 30 µg de análogo de GnRH, seguida da administração de cloprostenol (5µg) após sete dias e uma nova dose de análogo de GnRH (30µg) após dois dias. Não houve diferença estatística entre os protocolos testados (P=0.1009). Entretanto, a prostaglandina isolada promoveu a indução de estro em 40% das fêmeas, em 3 e 6 dias, e as associações de cloprostenol e GnRH, em 60% das fêmeas, em 4 e 10 dias, após última dose administrada, com pico de estrógeno de 19,95 ± 2,41pg/ml e 9,67 ± 1,8pg/ml, respectivamente. Em ambos os tratamentos, essas fêmeas mostraram características externas de estro como abertura e hiperemia vulvar, muco vaginal e fácil penetração de swab. O terceiro experimento teve por objetivo comparar a eficiência de dois protocolos para sincronização de estro e adaptar a técnica de inseminação artificial (IA) em fêmeas de catetos (Pecari tajacu), sendo este realizado após identificação e aplicação do método de sincronização mais eficaz. O primeiro protocolo baseava-se na administração dupla de cloprostenol (120µg) com intervalo de nove dias, e o segundo, na associação de 400 UI de gonadotrofina coriônica equina e 200 UI de gonadotrofina coriônica humana, em dose única. Para a IA, as fêmeas foram sincronizadas com a associação eCG e hCG. Todas as fêmeas apresentaram estro. Com o uso do cloprostenol, as fêmeas mostraram estro nove dias após a última aplicação da droga, e na associação, após seis dias. Posteriormente à realização da IA, não foram visualizados embriões por ultrassonografia. No entanto, duas fêmeas apresentaram aumento uterino, com presença de líquido anecogênico no lúmen, e níveis altos de progesterona com 30 e 60 dias após a última IA (67.08 ± 16.85 ng/ml e 73.42 ± 22.59 ng/ml, respectivamente). Assim, como conclusão geral, o monitoramento da atividade ovariana em tatus-peba, bem como a indução e sincronização em cutias e catetos, permitem o uso dessas biotécnicas em larga escala, facilitando a gestão dessas espécies em cativeiro. The objective of the present thesis was to apply biotechnologies in monitoring and control the estrous cycle of wild species of the caatinga biome, as a tool for improving the management in captivity, as well as conservation or multiplication of these species. The thesis was divided into three experiments. The first was realized the monitoring of the estrous cycle in armadillos (Euphractus sexcinctus) by different monitoring methods, which was observed estrous cycle with duration of 23.5 ± 3.12 days, a follicular phase 8.8 ± 1.4 days and luteal phase of 15.62 ± 2.1 days. In the follicular phase were observed vaginal bloody discharge, vulvar edema, presence of mucus and ease of introduction of swab, with peak estrogen 240.66 ± 12.69 pg / ml and predominance of superficial cells in the vaginal cytology, with follicles observed by ovarian ultrasound. In the luteal phase was observed absence of bloody discharge and difficulty of introducing the swab, besides the increase in progesterone levels (10.83 ± 1.86 ng / ml) and corpus luteum viewing by ultrasound. In the second experiment, two protocols for induction and estrus synchronization were tested in agoutis (Dasyprocta leporina). The first consisted in the administration of two doses of cloprostenol (5μg) with nine-day interval; and the second, in the administration of 30 mcg GnRH analogue, followed by cloprostenol administration (5μg) after seven days and a new dose of GnRH analogue (30μg) after two days. There was no statistical difference between the protocols tested (P=0.1490). However, the isolated prostaglandin promoted estrus induction in 40% of females, 3 to 6 days, and cloprostenol and GnRH associations, 60% females, 4 and 10 days after last dose, with peak estrogen 19.95 ± 2,41pg / ml and 9.67 ± 1,8pg / ml, respectively. In both treatments, these females showed estrous external characteristics as opening and hyperemia vulvar, vaginal mucus and easy penetration swab. The third experiment was to compare the efficiency of two protocols for estrous synchronization and to adapt the artificial insemination (AI) in collared peccary females (Pecari tajacu), which was carried out after identification and to appliction the most effective method of synchronization. The first protocol was based on the dual administration of cloprostenol (120μg) with nine-day interval, and the second, in the association of 400 IU equine chorionic gonadotrophin (eCG) and 200 IU of human chorionic gonadotropin (hCG), a single dose. For IA, females were synchronized with eCG and hCG association. All females exhibited estrus. With the use of cloprostenol, females exhibited estrus nine days after the last drug application, and with use of the association, after six days. After the realization of AI, were not observed embryos by ultrasound. However, two females showed increased uterine with presence of anechogenic fluid in the lumen, and high levels of progesterone 30 to 60 days after the last IA (67.08 ± 16.85 ng / mL and 73.42 ± 22.59 ng / ml, respectively). Thus, as the general conclusion, the monitoring of ovarian activity in armadillos as well as the induction and synchronization in agouti and peccaries, allow the use of these biotechnologies in large scale, facilitating the management of these species in captivity.

O objetivo da presente tese foi utilizar a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré antrais (MOIFOPA) como ferramenta para o resgate e otimização do uso de gametas femininos oriundos de espécies silvestres do bioma Caatinga. A tese foi dividida em quatro experimentos. No primeiro, foi realizada a estimativa e descrição das características histológicas e ultraestruturas dos folículos pré antrais (FOPA) de cutias (Dasyprocta leporina), nos quais foram estimados 4419.8 ± 532.26 e 5397.52 ± 574.91 folículos para os ovários direito e esquerdo, respectivamente, sendo a maioria (86,63%) pertencente a categoria de folículos primordiais (P0,05). Adicionalmente, um aumento na proporção de FOPA em desenvolvimento foi verificada (P>0.05). Através da análise com Ag-NOR, observou-se que apenas o tratamento com TCM199/FSH manteve a proporção de proliferação celular similar ao dia 1 (P>0.05). A coloração com picrosirius red revelou que a MEC permaneceu intacta em todos os tratamentos (P>0.05). Assim, como conclusão geral, o uso da MOIFOPA nas referidas espécies permitiu o conhecimento de aspectos relacionados a sua morfofisiologia reprodutiva, possibilitando tanto a conservação do material genético destas espécies, com a possibilidade de formação de bancos de germoplasma, como a elucidação de mecanismos relacionados a sobrevivência e desenvolvimento dos FOPA in vitro. The objective of the present thesis was to use the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) as a tool for the female gametes rescue and optimization, from wild species of Caatinga biome. The thesis was divided into 4 experiments. At first experiment, it was performed the estimative and description of the agouti (Dasyprocta leporina) preantral follicles (PF) histologic and ultrastructural features, in which it was estimated 4419.8 ± 532.26 and 5397.52 ± 574.91 follicles for the right and left ovary, respectively, and the majority (86,63%) belonged to the primordial follicles category (P0.05). Also, an improvement of the proportion of intact growing PF was verified (P>0.05). By the Ag-NOR analysis it was observed that only the treatment using TCM199/FSH promoted the maintenance of cell proliferation similar to day 1 (P>0.05). The picrosirius red stain revealed that ECM remained intact in all treatments (P>0.05). Thus, as the general conclusion, the use of MOEPF in the refereed species allowed the knowledge of aspects related to its reproductive morphology and physiology, enabling the germplasm conservation, with the possibility of germplasm bank formation, as the elucidation of mechanisms related to the PF survive and in vitro development.

O objetivo foi estabelecer protocolos para obtenção e conservação de espermatozoides de cutias (Dasyprocta leporina) criadas em cativeiros no semi-árido brasileiro, visando sua exploração sustentável. Para tanto três experimentos foram realizados. No primeiro, foi avaliada a influência da interação entre dois tipos de sonda (ondas senoidais e quadráticas) e dois protocolos de estimulação (contínuo e seriado) sobre a eficiência da colheita de sêmen de cutias por eletroejaculação. A interação mais eficiente na obtenção de ejaculados com espermatozoides foi a que utilizou eletrodos em aneis associado com estímulos em série (4/7; 57%, P0,05) quando comparada as criopreservadas com dimetilsulfoxido. Finalmente, foi analisado o efeito dos métodos de obtenção de espermatozoides (eletroejaculação vs colheita epididimária) sobre a qualidade dos espermatozóides criopreservados. Como resultado as amostras obtidas por lavagem epididmária apresentaram motilidade de 25,0±10,9% e vigor 2,4±0,8 e as obtidas por eletroejaculação obtiveram 31,2±14,2% de motilidade e 2,2±0,7 de vigor, porém sem diferenças significativas (P>0,05), denotando a possibilidade de aplicar diretamente, com sucesso, o protocolo de criopreservação de espermatozoides epididimarios de cutias (Dasyprocta leporina) para ejaculados da mesma espécie. Na presente tese, foram alcançados avanços significativos na obtenção e processamento de espermatozoides de cutias, possibilitando a formação de bancos de germoplasmas a partir de amostras oriundas tanto dos epidídimos quanto por eletroejaculação. The general objective of this thesis was to stablish protocols to obtain and conserve agouti (Dasyprocta leporina) sperm bred in captivity in the Brazilian semi-arid, aiming its sustainable production. The thesis was divided in three experiments. In the first one, we studied the influence of the interaction between two probes (quadratics and sine waves) and two stimulation protocols (continuous and in series) on the agouti sperm collection by electroejaculation efficiency. The most efficient interaction on this obtainment was the one with probes with rings associated with stimuli in series (4/7; 57%, P0.05) when compared to the samples cryopreserved with dimethylsulfoxide. At last, we studied the effects of the methods to obtain sperm (electroejaculation vs epididymal collection) on post thawing sperm quality. The samples obtained by epididymal retrograde flushing showed values for motility of 25.0±10.9% and vigor 2.4±0.8, and those obtained by electroejaculation had 31.2±14.2% of motility and vigor of 2.2±0.7, however, without statistical difference (P>0.05), which shows the possibility to successfully use the epididymal sperm cryopreservation protocol on agouti ejaculated sperm. In conclusion, significant advances on obtainment and processing of agouti sperm were made, allowing the establishment of germplasm banks from sperm samples obtained from the epididymis or by electroejaculation.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LiviaBC_DISSERT.pdf: 1623953 bytes, checksum: e19274f0d36484b576e3067f86dd3035 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Conventional tests that evaluate sperm quality do not have the ability to measure the potential of a fertilizing sample. This study aimed to determine the ability of the collared peccary of sperm in interacting with swine oocytes recovered from antral follicles, perivitelline membrane binding capacity of the chicken egg, and finally identify relationships between sperm parameters and in vitro interaction tests. Thus study was divided in two experiments with 11 male collared peccaries from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In all experiments, the semen was collected by electroejaculation and evaluated for motility, vigour, viability, normal morphology, membrane integrity, and kinetic motility parameters by CASA. In the first experiment, semen samples were analyzed by an in vitro interaction test with swine oocytes conducted under a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 18 h at 38.5ºC. Thus, it was found that in all oocytes there interactions with the presence of spermatozoa (mean 100.00 ± 0.0), observed the mean of 19.85 ± 5.5 oocytes penetrated by spermatozoa, number bound spermatozoa 39.4 ± 4.6 and penetrated spermatozoa 2.46 ± 0.7. Also, verified a significant association between the number of bound sperm and straightness (STR) (R2=61.7%; P=0.04). In the second experiment, semen samples were frozen in a Tris-based extender plus egg yolk (10%), Aloe vera (10%) and glycerol (6%). After thawing, samples were analyzed by an egg perivitelline membrane biding test conducted under a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 20 min at 38.5ºC. As result, we identify 140.6 ± 19.4 sperm bound to the perivitelline membrane to fresh samples (binding range 33.9 308,7), while in frozen-thawed samples, a total of 125.1 ± 5.5 sperm were found (binding range 49.8 250.7) (P>0.05). Significant associations between frozen/thawed sperm bound to perivitelline membrane and various sperm parameters as vigor (54.6%), amplitude lateral head (R=55.1%), beat cross frequency (R=76.8%), straightness (R=61.8%) and linearity (R=62.2%) were found. In conclusion, that the two tests can be used for the functional evaluation of peccaries sperm. The perivitelline membrane binding test is a reliable, practical and relatively simple method that does not require expensive equipment and can be efficiently incorporated into the routine analysis of peccaries semen samples Os testes convencionais, que avaliam a qualidade seminal, não possuem a capacidade de predizer o potencial fecundante de uma amostra. Com o intuito de superar esse entrave, objetivou-se determinar a capacidade dos espermatozoides de catetos em promover interações com oócitos suínos recuperados de folículos antrais, bem como a capacidade de ligação à membrana perivitelina do ovo de galinha e identificação das relações dos mesmos com os parâmetros espermáticos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 11 catetos machos, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA). Em todos os experimentos, o sêmen foi colhido por eletroejaculação e avaliado quanto à motilidade espermática, vigor, viabilidade, morfologia, parâmetros cinéticos por análise computadorizada (CASA), integridade e funcionalidade da membrana espermática. No primeiro experimento, as amostras de sêmen fresco foram analisadas pelo teste de interação in vitro com oócitos suínos em 5% CO2 por 18 h a 38,5ºC. Assim, verificou-se que em todos os oócitos avaliados existia a presença de interações com espermatozoides (média de 100 ± 0,0), tendo sido observado uma média de 19,85 ± 5,5 de oócitos com espermatozoides penetrados, 39,4 ± 4,6 espermatozoides ligados/oócito e 2,46 ± 0,7 espermatozoides penetrados/oócito. Ainda, observou-se uma significativa associação entre o número de espermatozoides ligados com índice de progressão (R=61,7%). No segundo experimento, o sêmen foi criopreservado em diluente a base de Tris, suplementado com gema de ovo (10%), Aloe vera (10%) e glicerol (3%). Após a descongelação, as amostras foram analisadas pelo teste de ligação à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha, que foi realizado em atmosfera controlada contendo 5% CO2 por 20 min a 38,5ºC. As amostras de sêmen fresco apresentaram 140,6 ± 19,4 espermatozoides ligados a membrana perivitelina (taxa de variação de 33,9 308,7), já no sêmen congelado/descongelado, verificaram-se 125,1 ± 5,5 espermatozoides ligados (taxa de variação de 49,8 250,07) (P>0,05). Em adição, observou-se a existência de relações entre o teste de ligação e os parâmetros espermáticos: vigor (54,6%), deslocamento lateral da cabeça (R=55,1%), frequência de batimento cruzado (R=76,8%), índice de progressão (R=61,8%) e índice de linearidade (R=62,2%). Diante disso, conclui-se que ambos os testes podem ser utilizados para a avaliação funcional dos espermatozoides de catetos. Ainda, o teste de ligação à membrana perivitelina é um método confiável, prático e relativamente simples e que pode ser eficientemente incorporado à análise de rotina de amostras de sêmen catetos

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AnaLPS_DISSERT.pdf: 2906365 bytes, checksum: 9332744a34f68778b08f8668337ce882 (MD5) Previous issue date: 2015-02-10 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The present thesis had as objective optimized peccaries semen cryopreservation protocols (Pecari tajacu). Therefore, adult animals were used originated from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS) of the Federal Rural University of the Semi-Arid (UFERSA), which semen was collected by electroejaculation and immediately evaluated. The first experiment aimed at evaluating the effect of low-density lipoprotein (LDL) purified in relation to egg yolk (G) and defines the ideal concentration (20%, 10% and 5%) for semen cryopreservation in peccaries. After the data analysis it was found that LDL (20%) can be used to replace egg yolk having been verified 36.4 ± 5.3 and 21.8 ± 6.9% of the total sperm motility after thawing, respectively. The second experiment evaluated the action of Aloe vera gel (AV) both refrigeration and in the peccaries of semen freezing in different concentrations (20%, 10%, 5%) or associated with egg yolk (10%:10%). It was found that Aloe vera gel (20%) proved to be efficient cooling at 5 ° C, maintaining the longevity of sperm for up to 48 hours of total motility assessment having a 54.2 ± 21.3%; as the cryopreservation process, it was found that the use of Aloe vera 20% can replace egg yolk, but its association with gem promoted better preservation of viability (32.7 ± 2.3%), osmotic response (37.8 ± 4.2%) and membrane integrity (40.2 ± 3.1). In the third experiment evaluated the addition of the action (0.5% and 1.0%) of base detergent sodium dodecyl sulfate (SDS), Equex ® STM, the peccaries of semen. However, it was observed that, at any concentration proposal was effective in increasing the longevity of sperm cell peccaries over 15 minutes as previously described for the species. The experiments have been sufficient to answer the hypotheses and are useful for the improvement of semen cryopreservation protocols of collared peccary (Pecari tajacu) A presente tese teve como objetivo aperfeiçoar protocolos de criopreservação de sêmen de catetos (Pecari tajacu). Para tanto, foram utilizados animais adultos oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS) da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), cujo sêmen foi coletado por eletroejaculação e imediatamente avaliado. O primeiro experimento objetivou avaliar o efeito da lipoproteína de baixa densidade (LDL) purificada, em relação à gema de ovo (G) e determinar a concentração ideal (20%, 10% e 5%) para criopreservação de sêmen em catetos. Após a análise dos dados verificou-se que a LDL (20%) pode ser utilizada em substituição à gema de ovo, tendo sido verificados 36.4±5.3% e 21.8±6.9 de motilidade espermática total após a descongelação, respectivamente. No segundo experimento, avaliou-se a ação do gel de Aloe vera (AV) tanto na refrigeração quanto na congelação do sêmen de catetos, em diferentes concentrações (20%, 10%, 5%) ou associado à gema de ovo (10%:10%). Verificou-se que o gel de Aloe vera (20%) se mostrou eficiente para a refrigeração a 5°C, mantendo a longevidade espermática por até 48 horas de avaliação apresentando uma motilidade total de 54.2±21.3%; quanto ao processo de criopreservação, verificou-se que o uso de Aloe vera a 20% pode substituir a gema de ovo, porém a associação desta com a gema promoveram a melhor preservação da viabilidade (32.7±2.3%), resposta osmótica (37.8±4.2%) e integridade de membrana (40.2±3.1). No terceiro experimento verificou-se a ação da adição (0,5% e 1,0%) do detergente a base de dodecil sulfato de sódio (SDS), Equex ® STM, no sêmen de catetos. Entretanto, observou-se que este, em nenhuma concentração proposta, foi eficiente em aumentar a longevidade da célula espérmática de catetos além dos 15 minutos, conforme previamente descrito para a espécie. Os experimentos realizados foram suficientes a responder as hipóteses propostas, sendo úteis para o aperfeiçoamento de protocolos de criopreservação de sêmen de catetos (Pecari tajacu). Palavra Chave: Cateto, Criopreservação de sêmen, Lipoproteína de baixa Densidade, Dodecil Sulfato de Sódio, Gel de Aloe vera

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Os principais mecanismos envolvidos na fertilidade do sêmen de machos incluem as alterações pós traducionais, bem como a atividade de algumas proteínas no plasma seminal. Além disso, algumas enzimas são importantes para proteger as células espermáticas contra os danos causados pelas espécies reativas ao oxigênio (ERO’s). As proteínas seminais podem ser avaliadas laboratorialmente com o intuito de obter informações adicionais acerca do potencial reprodutivo dos animais avaliados e assim os estudos moleculares no plasma seminal tornam-se importantes para desvendar quais os mecanismos ou quais moléculas são essências na conservação da qualidade seminal. Nesse sentido, dois estudos foram conduzidos com o intuito de descrever componentes importantes do plasma seminal de catetos (Pecari tajacu LINNAEUS, 1758). Para tanto, inicialmente foram realizadas as análises seminais clássicas de motilidade, vigor, integridade funcional e estrutural da membrana, e a morfologia espermática, e assim observou-se que todos os animais estavam hígidos e sexualmente maduros. O primeiro experimento objetivou caracterizar as proteínas do plasma seminal dos catetos. Sendo assim, a proteômica do plasma seminal foi feita através de eletroforese bidimensional seguida da identificação por espectrofotometria de massa (LC – MS/MS), resultando na identificação de 93 spots no gel bidimensional, correspondentes a vinte e três diferentes proteínas e dentre elas, a PSP-1 foi encontrada em maior abundância. Esta proteína desempenha função de chaperona com outras proteínas que não possuem o dobramento apropriado, dessa forma, sua presença é essencial no plasma seminal. O segundo experimento analisou a atividade das enzimas catalase, superóxido dismutase, guaiacol peroxidase e ascorbato peroxidase no plasma seminal. Com o auxílio de espectrofotometria, não foi detectado atividade de nenhuma das enzimas estudadas, concluindo assim que outros mecanismos compensatórios protegem a célula espermática dos ataques das ERO’s, como por exemplo, a presença significativa da glutationa peroxidase (GPx) encontrada no plasma seminal dos catetos. Ambos os estudos contribuíram para o aumento das informações acerca da fisiologia reprodutiva dos catetos, visando posteriormente o uso de biotécnicas reprodutivas nessa espécie The main mechanisms involved in fertility of male include post-translational modifications as well as the presence or absence of certain proteins in seminal plasma. Furthermore, some enzymes are important to protect the sperm cells against damage caused by reactive oxygen species (ROS). The seminal proteins can be evaluated by laboratory for additional information about the reproductive potential of animals evaluated. Thus, the molecular studies of seminal plasma are important to uncover the mechanisms and molecules which are essential for the conservation of semen quality. Therefore, two studies were directed to describe important components of seminal plasma of peccaries (Pecari tajacu LINNAEUS, 1758). Initially, we conducted the classic seminal analysis of motility, vigor, functional and structural integrity of the sperm membrane and sperm morphology. As a result, we verified that all animals were healthy and sexually mature. The first study aimed to define the seminal plasma proteins, then proteomics seminal plasma was evaluated by two-dimensional electrophoresis and proteins were identified by mass spectrometry (LC - MS / MS). As a result, we identified 93 spots on bidimensional gel, corresponding to 23 different proteins, from which the PSP-1 was found in abundance. This protein plays a role of chaperone for other proteins incorrectly folded and it is essential in seminal plasma. The second study verified the existence of activity of catalase, superoxide dismutase, guaiacol peroxidase and ascorbate peroxidase in seminal plasma. The enzyme activity was analyzed by the spectrophotometry. As a result, no activity was detected for any enzyme. It is suggestive that other compensatory mechanisms protect the cells against ROS, for example, the significant presence of glutathione peroxidase (GPx) founded in the seminal plasma of peccaries. Both studies contributed for the increasing the information about the reproductive physiology of the peccaries and then the use of reproductive biotechnologies in this species