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Microbial organisms have key roles in numerous physiological processes in the human body and have recently been shown to modify the response to immune checkpoint inhibitors1,2. Here we aim to address the role of microbial organisms and their potential role in immune reactivity against glioblastoma. We demonstrate that HLA molecules of both glioblastoma tissues and tumour cell lines present bacteria-specific peptides. This finding prompted us to examine whether tumour-infiltrating lymphocytes (TILs) recognize tumour-derived bacterial peptides. Bacterial peptides eluted from HLA class II molecules are recognized by TILs, albeit very weakly. Using an unbiased antigen discovery approach to probe the specificity of a TIL CD4+ T cell clone, we show that it recognizes a broad spectrum of peptides from pathogenic bacteria, commensal gut microbiota and also glioblastoma-related tumour antigens. These peptides were also strongly stimulatory for bulk TILs and peripheral blood memory cells, which then respond to tumour-derived target peptides. Our data hint at how bacterial pathogens and bacterial gut microbiota can be involved in specific immune recognition of tumour antigens. The unbiased identification of microbial target antigens for TILs holds promise for future personalized tumour vaccination approaches., Nature, 617 (7962), ISSN:0028-0836, ISSN:1476-4687

Cancer treatment with immune checkpoint blockade (ICB) often induces immune-related adverse events (irAEs). We hypothesized that proteins coexpressed in tumors and normal cells could be antigenic targets in irAEs and herein described DITAS (discovery of tumor-associated self-antigens) for their identification. DITAS computed transcriptional similarity between lung tumors and healthy lung tissue based on single-sample gene set enrichment analysis. This identified 10 lung tissue–specific genes highly expressed in the lung tumors. Computational analysis was combined with functional T cell assays and single-cell RNA sequencing of the antigen-specific T cells to validate the lung tumor self-antigens. In patients with non–small cell lung cancer (NSCLC) treated with ICB, napsin A was a self-antigen that elicited strong CD8+T cell responses, with ICB responders harboring higher frequencies of these CD8+T cells compared with nonresponders. Human leukocyte antigen (HLA) class I ligands derived from napsin A were present in human lung tumors and in nontumor lung tissues, and napsin A tetramers confirmed the presence of napsin A–specific CD8+T cells in blood and tumors of patients with NSCLC. Napsin A–specific T cell clonotypes were enriched in lung tumors and ICB-induced inflammatory lung lesions and could kill immortalized HLA-matched NSCLC cells ex vivo. Single-cell RNA sequencing revealed that these T cell clonotypes expressed proinflammatory cytokines and cytotoxic markers. Thus, DITAS successfully identified self-antigens, including napsin A, that likely mediate effective antitumor T cell responses in NSCLC and may simultaneously underpin lung irAEs.

Single-cell RNA sequencing data and TCR data from "Autoreactive napsin A-specific T cells are enriched in lung tumors and inflammatory lung lesions during checkpoint blockade", Berner et al. &nbsp

To understand and treat immunology-related diseases, a comprehensive, unbiased characterization of major histocompatibility complex (MHC) peptide ligands is of key importance. Preceding the analysis by mass spectrometry, MHC class I peptide ligands are typically isolated by MHC immunoaffinity chromatography (MHC-IAC) and less often by mild acid elution (MAE). MAE may provide a cheap alternative to MHC-IAC for suspension cells but has been hampered by the high number of contaminating, MHC-unrelated peptides. Here, we optimized MAE, yielding MHC peptide ligand purities of more than 80%. When compared with MHC-IAC, obtained peptides were similar in numbers, identities, and to a large extent intensities, while the percentage of cysteinylated peptides was 5 times higher in MAE. The latter benefitted the discovery of MHC-allotype-specific, distinct cysteinylation frequencies at individual positions of MHC peptide ligands. MAE revealed many MHC ligands with unmodified, N-terminal cysteine residues which get lost in MHC-IAC workflows. The results support the idea that MAE might be particularly valuable for the high-confidence analysis of post-translational modifications by avoiding the exposure of the investigated peptides to enzymes and reactive molecules in the cell lysate. Our improved and carefully documented MAE workflow represents a high-quality, cost-effective alternative to MHC-IAC for suspension cells. ISSN:1535-3893 ISSN:1535-3907

We describe the results of two vaccinations of a self-experimenting healthy volunteer with SARS-CoV-2-derived peptides performed in March and April 2020, respectively. The first set of peptides contained eight peptides predicted to bind to the individual's HLA molecules. The second set consisted of ten peptides predicted to bind promiscuously to several HLA-DR allotypes. The vaccine formulation contained the new TLR 1/2 agonist XS15 and was administered as an emulsion in Montanide as a single subcutaneous injection. Peripheral blood mononuclear cells isolated from blood drawn before and after vaccinations were assessed using Interferon-γ ELISpot assays and intracellular cytokine staining. We detected vaccine-induced CD4 T cell responses against six out of 11 peptides predicted to bind to HLA-DR after 19 days, following vaccination, for one peptide already at day 12. We used these results to support the design of a T-cell-inducing vaccine for application in high-risk patients, with weakened lymphocyte performance. Meanwhile, an according vaccine, incorporating T cell epitopes predominant in convalescents, is undergoing clinical trial testing.

We have previously shown that conformational change in the β2-integrin is a very early activation marker that can be detected with fluorescent multimers of its ligand intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 for rapid assessment of antigen-specific CD8+ T cells. In this study, we describe a modified protocol of this assay for sensitive detection of functional antigen-specific CD4+ T cells using a monoclonal antibody (clone m24 Ab) specific for the open, high-affinity conformation of the β2-integrin. The kinetics of β2-integrin activation was different on CD4+ and CD8+ T cells (several hours vs. few minutes, respectively); however, m24 Ab readily stained both cell types 4-6 h after antigen stimulation. With this protocol, we were able to monitor ex vivo effector and memory CD4+ and CD8+ T cells specific for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), and hepatitis B virus (HBV) in whole blood or cryopreserved peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of infected or vaccinated individuals. By costaining β2-integrin with m24 and CD154 Abs, we assessed extremely low frequencies of polyfunctional CD4+ T cell responses. The novel assay used in this study allows very sensitive and simultaneous screening of both CD4+ and CD8+ T cell reactivities, with versatile applicability in clinical and vaccination studies.

Increased concentrations of circulating chromatin, especially oligo-nucleosomes, are observed in sepsis, cancer and some inflammatory autoimmune diseases like systemic lupus erythematosus (SLE). In SLE, circulating nucleosomes mainly result from increased apoptosis and decreased clearance of apoptotic cells. Once released, nucleosomes behave both as an autoantigen and as a damage-associated molecular pattern (DAMP) by activating several immune cells, especially pro-inflammatory cells. Deoxyribonuclease 1 (DNase1) is a major serum nuclease whose activity is decreased in mouse and human lupus. Likewise, the mitochondrial chaperone tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated protein-1 (Trap1) protects against oxidative stress, which is increased in SLE. Here, using wild type, DNase1-deficient and DNase1/Trap1-deficient mice, we demonstrate that DNase1 is a major serum nuclease involved in chromatin degradation, especially when the plasminogen system is activated. In vitro degradation assays show that chromatin digestion is strongly impaired in serum from DNase1/Trap1-deficient mice as compared to wild type mice. In vivo, after injection of purified chromatin, clearance of circulating chromatin is delayed in DNase1/Trap1-deficient mice in comparison to wild type mice. Since defective chromatin clearance may lead to chromatin deposition in tissues and subsequent immune cell activation, spleen cells were stimulated in vitro with chromatin. Splenocytes were activated by chromatin, as shown by interleukin (IL)-12 secretion and CD69 up-regulation. Moreover, cell activation was exacerbated when Trap1 is deficient. Importantly, we also show that cytokines involved in lupus pathogenesis down-regulate Trap1 expression in splenocytes. Therefore, combined low activities of both DNase1 and Trap1 lead to an impaired degradation of chromatin in vitro, delayed chromatin clearance in vivo and enhanced activation of immune cells. This situation may be encountered especially, but not exclusively, in SLE by the negative action of cytokines on Trap1 expression.

The diversity of human leukocyte antigens (HLAs) enables the presentation of immense repertoires of peptides, including tumor-associated antigens (TAAs). As a surrogate for immunopeptidome diversity, the HLA evolutionary divergence (HED) between individual HLA alleles might directly define the ability to present TAAs, a prerequisite for graft-versus-leukemia effects. We therefore analyzed the impact of HED on survival within a cohort of 171 acute myeloid leukemia (AML) patients after matched donor allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Low HED (&lt, 25th percentile) of HLA class I (HEDclass I) or HLA-DR antigens (HEDDR) was a strong determinant for adverse overall survival after allogeneic HSCT (OS), with a hazard ratio for death of 1.9 (95% CI 1.2&ndash, 3.2) and 2.1 (95% CI 1.3&ndash, 3.4), respectively. Defining a cutoff value for the combined HEDtotal (HEDclass I and HEDDR), the respective 5 year OS was 29.7% and 64.9% in patients with low and high HEDtotal (p &lt, 0.001), respectively. Furthermore, the risk of relapse was significantly higher in patients with low HEDtotal (hazard ratio (HR) 2.2, 95% CI 1.3&ndash, 3.6) and event-free survival (EFS) was significantly reduced (5 year EFS 25.7% versus 54.4%, p &lt, 0.001). We here introduce HED, a fundamental metric of immunopeptidome diversity, as a novel prognostic factor for AML patients undergoing allogeneic HSCT.

Biomaterials play an increasing role in clinical applications and regenerative medicine. A perfectly designed biomaterial should restore the function of damaged tissue without triggering an undesirable immune response, initiate self-regeneration of the surrounding tissue and gradually degrade after implantation. The immune system is well recognized to play a major role in influencing the biocompatibility of implanted medical devices. To obtain a better understanding of the effects of biomaterials on the immune response, we have developed a highly sensitive novel test system capable of examining changes in the immune system by biomaterial. Here, we evaluated for the first time the immunopeptidome, a highly sensitive system that reflects cancer transformation, virus or drug influences and passes these cellular changes directly to T cells, as a test system to examine the effects of contact with materials. Since monocytes are one of the first immune cells reacting to biomaterials, we have tested the influence of different materials on the immunopeptidome of the monocytic THP-1 cell line. The tested materials included stainless steel, aluminum, zinc, high-density polyethylene, polyurethane films containing zinc diethyldithiocarbamate, copper, and zinc sulfate. The incubation with all material types resulted in significantly modulated peptides in the immunopeptidome, which were material-associated. The magnitude of induced changes in the immunopeptidome after the stimulation appeared comparable to that of bacterial lipopolysaccharides (LPS). The source proteins of many detected peptides are associated with cytotoxicity, fibrosis, autoimmunity, inflammation, and cellular stress. Considering all tested materials, it was found that the LPS-induced cytotoxicity-, inflammation- and cellular stress-associated HLA class I peptides were mainly induced by aluminum, whereas HLA class II peptides were mainly induced by stainless steel. These findings provide the first insights into the effects of biomaterials on the immunopeptidome. A more thorough understanding of these effects may enable the design of more biocompatible implant materials using in vitro models in future. Such efforts will provide a deeper understanding of possible immune responses induced by biomaterials such as fibrosis, inflammation, cytotoxicity, and autoimmune reactions.

Background: We previously showed that the bacterial lipopeptide Pam3Cys-Ser-Ser, meanwhile established as a toll-like receptor (TLR) 1/2 ligand, acts as a strong adjuvant for the induction of virus specific CD8+ T cells in mice, when covalently coupled to a synthetic peptide.Case presentation: We now designed a new water-soluble synthetic Pam3Cys-derivative, named XS15 and characterized it in vitro by a TLR2 NF-κB luciferase reporter assay. Further, the capacity of XS15 to activate immune cells and stimulate peptide-specific CD8+ T and NK cells by 6-sulfo LacNAc+ monocytes was assessed by flow cytometry as well as cytokine induction using immunoassays. The induction of a functional immune response after vaccination of a volunteer with viral peptides was assessed by ELISpot assay and flow cytometry in peripheral blood cells and infiltrating cells at the vaccination site, as well as by immunohistochemistry and imaging.XS15 induced strong ex vivo CD8+ and TH1 CD4+ responses in a human volunteer upon a single injection of XS15 mixed to uncoupled peptides in a water-in-oil emulsion (Montanide™ ISA51 VG). A granuloma formed locally at the injection site containing highly activated functional CD4+ and CD8+ effector memory T cells. The total number of vaccine peptide-specific functional T cells was experimentally assessed and estimated to be 3.0 × 105 in the granuloma and 20.5 × 106 in peripheral blood.Conclusion: Thus, in one volunteer we show a granuloma forming by peptides combined with an efficient adjuvant in a water-in-oil-emulsion, inducing antigen specific T cells detectable in circulation and at the vaccination site, after one single vaccination only. The ex vivo T cell responses in peripheral blood were detectable for more than one year and could be strongly boosted by a second vaccination. Hence, XS15 is a promising adjuvant candidate for peptide vaccination, in particular for tumor peptide vaccines in a personalized setting.

Objective: Although meningioma are amongst the most common intracranial tumors, available treatment options beyond surgery and radiotherapy are virtually not existent. However, in many cases surgery alone is not sufficient (e.g. meningeomatosis, recurrence, infiltration, challenging localisation). T-cell[for full text, please go to the a.m. URL], 70. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Neurochirurgie (DGNC), Joint Meeting mit der Skandinavischen Gesellschaft für Neurochirurgie

Cancer immunotherapy has experienced a breakthrough by the introduction of checkpoint inhibition with antibodies. Response appears to be correlated with mutation load; the majority of cancer patients are nonresponders, possibly due to absence of immunogenic neoepitopes. We analyze the entire detectable landscape of HLA ligands on tumor samples, consisting of 1000 through 5000 peptides per sample, and find dozens to hundreds of peptides in germline sequence with apparently tumor specific expression, based on the absence of these peptides on adjacent autologous benign tissue and absence on a large number of normal tissue samples from all organs and tissue types available for analysis. We have evidence that non-mutated HLA ligands with tumor specific expression should be efficient as targets for personalized antigen specific immunotherapy, in particular if used with an efficient adjuvant., Proceedings on Cancer-Immuno-Oncology, Vol 1 No 1 (2018)

Scientific Data, 5, ISSN:2052-4463

DCs are professional APCs playing a crucial role in the initiation of T-cell responses to combat infection. However, systemic bacterial infection with various pathogens leads to DC-depletion in humans and mice. The mechanisms of pathogen-induced DC-depletion remain poorly understood. Previously, we showed that mice infected with Yersinia enterocolitica (Ye) had impaired de novo DC-development, one reason for DC-depletion. Here, we extend these studies to gain insight into the molecular mechanisms of DC-depletion and the impact of different bacteria on DC-development. We show that the number of bone marrow (BM) hematopoietic progenitors committed to the DC lineage is reduced following systemic infection with different Gram-positive and Gram-negative bacteria. This is associated with a TLR4- and IFN-γ-signaling dependent increase of committed monocyte progenitors in the BM and mature monocytes in the spleen upon Ye-infection. Adoptive transfer experiments revealed that infection-induced monopoiesis occurs at the expense of DC-development. Our data provide evidence for a general response of hematopoietic progenitors upon systemic bacterial infections to enhance monocyte production, thereby increasing the availability of innate immune cells for pathogen control, whereas impaired DC-development leads to DC-depletion, possibly driving transient immunosuppression in bacterial sepsis. Fil: Pasquevich, Karina Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas ; Argentina. University of Tübingen; Alemania Fil: Bieber, Kristin. University of Tübingen; Alemania Fil: Günter, Manina. University of Tübingen; Alemania Fil: Grauer, Matthias. University of Tübingen; Alemania Fil: Pötz, Oliver. University of Tübingen; Alemania Fil: Schleicher, Ulrike. Universität Erlangen; Alemania Fil: Biedermann, Tilo. University of Tübingen; Alemania Fil: Beer-Hammer, Sandra. University of Tübingen; Alemania Fil: Bühring, Hans-Jörg. University of Tübingen; Alemania Fil: Rammensee, Hans-Georg. University of Tübingen; Alemania Fil: Zender, Lars. University of Tübingen; Alemania Fil: Autenrieth, Ingo B.. University of Tübingen; Alemania Fil: Lengerke, Claudia. University of Tübingen; Alemania Fil: Autenrieth, Stella E.. University of Tübingen; Alemania

The lifelong generation of αβT cells enables us to continuously build immunity against pathogens and malignancies despite the loss of thymic function with age. Homeostatic proliferation of post-thymic naïve and memory T cells and their transition into effector and long-lived memory cells balance the decreasing output of naïve T cells, and recent research suggests that also αβT-cell development independent from the thymus may occur. However, the sites and mechanisms of extrathymic T-cell development are not yet understood in detail. γδT cells represent a small fraction of the overall T-cell pool, and are endowed with tremendous phenotypic and functional plasticity. γδT cells that express the Vδ1 gene segment are a minor population in human peripheral blood but predominate in epithelial (and inflamed) tissues. Here, we characterize a CD4(+) peripheral Vδ1(+) γδT-cell subpopulation that expresses stem-cell and progenitor markers and is able to develop into functional αβT cells ex vivo in a simple culture system and in vivo. The route taken by this process resembles thymic T-cell development. However, it involves the re-organization of the Vδ1(+) γδTCR into the αβTCR as a consequence of TCR-γ chain downregulation and the expression of surface Vδ1(+)Vβ(+) TCR components, which we believe function as surrogate pre-TCR. This transdifferentiation process is readily detectable in vivo in inflamed tissue. Our study provides a conceptual framework for extrathymic T-cell development and opens up a new vista in immunology that requires adaptive immune responses in infection, autoimmunity, and cancer to be reconsidered.

Introduction: During hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC), tumor cells are exposed both to cytostatic drugs and hyperthermia as well. The rationale for this treatment is an assumed synergy against malignant cells. However, this may also impact on immunological factors. We assessed effects[for full text, please go to the a.m. URL], 131. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie

Antigen stimulation of T-cell receptors on T cells induces an immediate increase in ligand-binding affinity and clustering in the plasma membrane of beta2-integrins, resulting in a strong binding to intercellular adhesion molecules (ICAMs) on target cells. This firm adhesion, e.g. of cytotoxic T cells to virus-infected or tumor cells with formation of cytotoxic synapses is required for target cell lysis. Therefore, upregulation of integrin-mediated adhesion after stimulation identifies functional effector T cells. Here we present a novel flow cytometry assay to enumerate antigen-specific CD8+ T cells using soluble multimeric ICAM1-Fc-F(ab’)2 fluorescent complexes to identify integrin activation induced after short-term stimulation in vitro. By optimizing and validating this assay we were able to identify pathogen-, tumor- or vaccine-induced CD8+T cells, and show its feasibility for assessing and isolating live, functional antigen-specific CD8+T cells. Performing coexpression analyses, we found that antigen-stimulated cells that expressed cytokines and mobilized CD107a were predominantly highly adherent CD8+T cells. Finally, CD8+ T cells that upregulated integrins were shown to mediate cytolytic activity in an antigen-specific manner. The most striking advantage of this method is the short-time incubation (several minutes) that is necessary to identify and isolate viable antigen-specific cytotoxic T cells by assessing upregulation of T cell adhesiveness, a critical step for elaborating multiple effector functions, including cytotoxicity and cytokine production.

Over the past decades, thermoablative techniques for the therapy of localized tumors have gained importance in the treatment of patients not eligible for surgical resection. Anecdotal reports have described spontaneous distant tumor regression after thermal ablation, indicating a possible involvement of the immune system, hence an induction of antitumor immunity after thermoinduced therapy. In recent years, a growing body of evidence for modulation of both adaptive and innate immunity, as well as for the induction of danger signals through thermoablation, has emerged. Induced immune responses, however, are mostly weak and not sufficient for the complete eradication of established tumors or durable prevention of disease progression, and combination therapies with immunomodulating drugs are being evaluated with promising results. This article aims to summarize published findings on immune modulation through radiofrequency ablation, cryoablation, microwave ablation therapy, high-intensity focused ultrasound, and laser-induced thermotherapy.

Mass spectrometry (MS)-based immunopeptidomics investigates the repertoire of peptides presented at the cell surface by major histocompatibility complex (MHC) molecules. The broad clinical relevance of MHC-associated peptides, e.g. in precision medicine, provides a strong rationale for the large-scale generation of immunopeptidomic datasets and recent developments in MS-based peptide analysis technologies now support the generation of the required data. Importantly, the availability of diverse immunopeptidomic datasets has resulted in an increasing need to standardize, store and exchange this type of data to enable better collaborations among researchers, to advance the field more efficiently and to establish quality measures required for the meaningful comparison of datasets. Here we present the SysteMHC Atlas (https://systemhcatlas.org), a public database that aims at collecting, organizing, sharing, visualizing and exploring immunopeptidomic data generated by MS. The Atlas includes raw mass spectrometer output files collected from several laboratories around the globe, a catalog of context-specific datasets of MHC class I and class II peptides, standardized MHC allele-specific peptide spectral libraries consisting of consensus spectra calculated from repeat measurements of the same peptide sequence, and links to other proteomics and immunology databases. The SysteMHC Atlas project was created and will be further expanded using a uniform and open computational pipeline that controls the quality of peptide identifications and peptide annotations. Thus, the SysteMHC Atlas disseminates quality controlled immunopeptidomic information to the public domain and serves as a community resource toward the generation of a high-quality comprehensive map of the human immunopeptidome and the support of consistent measurement of immunopeptidomic sample cohorts. ISSN:1362-4962 ISSN:0301-5610

Funder: Deutschen Konsortium für Translationale Krebsforschung; funder-id: http://dx.doi.org/10.13039/501100012353, Funder: Natural and Medical Sciences Institute (D), Viral diseases pose major threats to humans and other animals, including the billions of chickens that are an important food source as well as a public health concern due to zoonotic pathogens. Unlike humans and other typical mammals, the major histocompatibility complex (MHC) of chickens can confer decisive resistance or susceptibility to many viral diseases. An iconic example is Marek's disease, caused by an oncogenic herpesvirus with over 100 genes. Classical MHC class I and class II molecules present antigenic peptides to T lymphocytes, and it has been hard to understand how such MHC molecules could be involved in susceptibility to Marek's disease, given the potential number of peptides from over 100 genes. We used a new in vitro infection system and immunopeptidomics to determine peptide motifs for the 2 class II molecules expressed by the MHC haplotype B2, which is known to confer resistance to Marek's disease. Surprisingly, we found that the vast majority of viral peptide epitopes presented by chicken class II molecules arise from only 4 viral genes, nearly all having the peptide motif for BL2*02, the dominantly expressed class II molecule in chickens. We expressed BL2*02 linked to several Marek's disease virus (MDV) peptides and determined one X-ray crystal structure, showing how a single small amino acid in the binding site causes a crinkle in the peptide, leading to a core binding peptide of 10 amino acids, compared to the 9 amino acids in all other reported class II molecules. The limited number of potential T cell epitopes from such a complex virus can explain the differential MHC-determined resistance to MDV, but raises questions of mechanism and opportunities for vaccine targets in this important food species, as well as providing a basis for understanding class II molecules in other species including humans.

Mass spectrometry (MS)-based immunopeptidomics investigates the repertoire of peptides presented at the cell surface by major histocompatibility complex (MHC) molecules. The broad clinical relevance of MHC-associated peptides, e.g. in precision medicine, provides a strong rationale for the large-scale generation of immunopeptidomic datasets and recent developments in MS-based peptide analysis technologies now support the generation of the required data. Importantly, the availability of diverse immunopeptidomic datasets has resulted in an increasing need to standardize, store and exchange this type of data to enable better collaborations among researchers, to advance the field more efficiently and to establish quality measures required for the meaningful comparison of datasets. Here we present the SysteMHC Atlas (https://systemhcatlas.org), a public database that aims at collecting, organizing, sharing, visualizing and exploring immunopeptidomic data generated by MS. The Atlas includes raw mass spectrometer output files collected from several laboratories around the globe, a catalog of context-specific datasets of MHC class I and class II peptides, standardized MHC allele-specific peptide spectral libraries consisting of consensus spectra calculated from repeat measurements of the same peptide sequence, and links to other proteomics and immunology databases. The SysteMHC Atlas project was created and will be further expanded using a uniform and open computational pipeline that controls the quality of peptide identifications and peptide annotations. Thus, the SysteMHC Atlas disseminates quality controlled immunopeptidomic information to the public domain and serves as a community resource toward the generation of a high-quality comprehensive map of the human immunopeptidome and the support of consistent measurement of immunopeptidomic sample cohorts., Nucleic Acids Research, 46 (D1), ISSN:1362-4962, ISSN:0301-5610

Viral diseases pose major threats to humans and other animals, including the billions of chickens that are an important food source as well as a public health concern due to zoonotic pathogens. Unlike humans and other typical mammals, the major histocompatibility complex (MHC) of chickens can confer decisive resistance or susceptibility to many viral diseases. An iconic example is Marek’s disease, caused by an oncogenic herpesvirus with over 100 genes. Classical MHC class I and class II molecules present antigenic peptides to T lymphocytes, and it has been hard to understand how such MHC molecules could be involved in susceptibility to Marek’s disease, given the potential number of peptides from over 100 genes. We used a new in vitro infection system and immunopeptidomics to determine peptide motifs for the 2 class II molecules expressed by the MHC haplotype B2, which is known to confer resistance to Marek’s disease. Surprisingly, we found that the vast majority of viral peptide epitopes presented by chicken class II molecules arise from only 4 viral genes, nearly all having the peptide motif for BL2*02, the dominantly expressed class II molecule in chickens. We expressed BL2*02 linked to several Marek’s disease virus (MDV) peptides and determined one X-ray crystal structure, showing how a single small amino acid in the binding site causes a crinkle in the peptide, leading to a core binding peptide of 10 amino acids, compared to the 9 amino acids in all other reported class II molecules. The limited number of potential T cell epitopes from such a complex virus can explain the differential MHC-determined resistance to MDV, but raises questions of mechanism and opportunities for vaccine targets in this important food species, as well as providing a basis for understanding class II molecules in other species including humans.

To understand and treat immunology-related diseases, a comprehensive, unbiased characterization of major histocompatibility complex (MHC) peptide ligands is of key importance. Preceding the analysis by mass spectrometry, MHC class I peptide ligands are typically isolated by MHC immunoaffinity chromatography (MHC-IAC) and less often by mild acid elution (MAE). MAE may provide a cheap alternative to MHC-IAC for suspension cells but has been hampered by the high number of contaminating, MHC-unrelated peptides. Here, we optimized MAE, yielding MHC peptide ligand purities of more than 80%. When compared with MHC-IAC, obtained peptides were similar in numbers, identities, and to a large extent intensities, while the percentage of cysteinylated peptides was 5 times higher in MAE. The latter benefitted the discovery of MHC-allotype-specific, distinct cysteinylation frequencies at individual positions of MHC peptide ligands. MAE revealed many MHC ligands with unmodified, N-terminal cysteine residues which get lost in MHC-IAC workflows. The results support the idea that MAE might be particularly valuable for the high-confidence analysis of post-translational modifications by avoiding the exposure of the investigated peptides to enzymes and reactive molecules in the cell lysate. Our improved and carefully documented MAE workflow represents a high-quality, cost-effective alternative to MHC-IAC for suspension cells., Journal of Proteome Research, 20 (1), ISSN:1535-3893, ISSN:1535-3907

T-Zell-basierte Immuntherapien wie bispezifische Antikörper haben die Behandlung von Tumorerkrankungen revolutioniert. Trotz ihres unbestrittenen Erfolgs bei der Behandlung hämatologischer Erkrankungen ist ihre Wirksamkeit bei soliden Tumoren stark limitiert. B7-H3 wird bei verschiedenen Tumorarten sowohl auf Tumorzellen als auch auf Tumorgefäßen überexprimiert. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung eines optimierten bispezifischen B7 H3xCD3 Antikörpers (CC-3) zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen beschrieben. Es konnte gezeigt werden, dass das Targeting eines membranständigen B7-H3-Epitops eine 100-fache Reduzierung der CD3 Affinität ermöglicht. Funktionelle Analysen zeigten die Überlegenheit unseres finalen Konstruktes CC-3 in Hinblick auf Tumorzelllyse sowie T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Gedächtnisbildung, während die unerwünschte Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen durch die verringerte CD3-Affinität reduziert wurde. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde CC-3 bei Pankreas-, Leber- und Magenkarzinomen präklinisch charakterisiert. Funktionelle Analysen zeigten, dass CC-3 auch in diesen Entitäten eine starke T-Zell-Reaktivität auslöste, was in einer ausgeprägten Tumorzelllyse resultierte. Neben der eingeschränkten Wirksamkeit in soliden Tumoren wird die Effizienz bispezifischer Antikörper generell durch verschiedene Mechanismen der Tumor-Immunevasion beeinträchtigt. Es ist bekannt, dass Thrombozyten die Invasion, Metastasierung und Immunevasion eines Tumors fördern. Der Einfluss von Thrombozyten auf die Wirksamkeit von Immuntherapien insbesondere mit bispezifischen Antikörpern war jedoch weitgehend ungeklärt. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, ob und inwiefern Thrombozyten einen Einfluss auf die Wirksamkeit bispezifischer Antikörpern haben. Im Rahmen einer multizentrischen Phase-I-Studie (NCT04104607) zeigten Prostatakarzinom-Patienten, welche mit unserem bispezifischen PSMAxCD3 Antikörper CC-1 behandelt wurden, eine behandlungsbedingte Thrombozytenaktivierung und vorübergehende Thrombozytopenie. In vitro Analysen zeigten, dass die Antikörper-induzierte T-Zell-Reaktivität durch aktivierte Thrombozyten signifikant reduziert wird. Die Reduktion der durch bispezfische Antikörper vermittelten T-Zell-Reaktivität konnte durch eine pharmakologische Thrombozytenhemmung und insbesondere Blockierung der TGF-β-Achse verhindert werden. Zusammengefasst bilden die präklinischen Untersuchungen mit dem optimierten B7-H3xCD3 Antikörper CC-3 eine wesentlich Grundlage für dessen klinische Entwicklung. Die Ergebnisse des dritten Teils zeigen, dass Thrombozyten die therapeutische Wirksamkeit von bispezifischen Antikörpern beeinträchtigen können, und dass eine Modulation der Thrombozytenfunktion den Behandlungserfolg verbessern könnte.

Die Tumornekrosefaktor (TNF)/TNF-Rezeptor (TNFR)-Familienmitglieder receptor activator of nuclear factor (NF)-κB (RANK) und sein Ligand (RANKL) spielen eine Schlüsselrolle im Knochenmetabolismus. RANK ist auf Progenitoren der Osteoklasten exprimiert und kann RANKL binden, der in membrangebundener Form auf Osteoblasten exprimiert ist und von deren Oberfläche abgespalten wird. Interaktion von RANK und RANKL führt zur Differenzierung der Progenitoren in aktive Osteoklasten, welche folglich Knochensubstanz resorbieren. Neben seiner Bedeutung im Knochenstoffwechsel konnte für das RANK/RANKL-Molekülsystem mittlerweile zudem eine Involvierung bei verschiedenen anderen zellulären Funktionen einschließlich der Pathophysiologie von Tumorerkrankungen nachgewiesen werden. Basierend auf vorliegenden Daten und Erkenntnissen wurde in dieser Arbeit die Rolle von RANK und seinem Liganden bei der Metastasierung von soliden Tumoren am Beispiel des Mamma- und kolorektalen Karzinoms untersucht. Metastasierte Tumore stellen eine große therapeutische Herausforderung dar und sind häufig mit einer schlechten Prognose und einem geringen Überleben der Patienten verbunden. Metastasierende Tumorzellen weisen die Fähigkeit auf, sich aus dem Primärtumorherd kommend über den Blutkreislauf im Körper auszubreiten und so in entfernten Organen Sekundärherde zu bilden. Mittlerweile ist bekannt, dass Thrombozyten eine wichtige Rolle bei der Metastasierung spielen: Sie bilden mit im Blutkreislauf zirkulierenden Tumorzellen Aggregate, werden dabei aktiviert, setzen Wachstumsfaktoren frei, begünstigen die Transmigration und Extravasation von Tumorzellen und induzieren einen mit der Metastasierung assoziierten mesenchymalen Phänotyp. In dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass RANKL auf Thrombozyten von Patienten mit Mamma- und kolorektalem Karzinom exprimiert ist und durch Aktivierung der Thrombozyten hochreguliert wird. Thrombozytärer RANKL wird von RANK gebunden, welcher weiter auf Natürlichen Killer (NK)-Zellen der Patienten nachgewiesen werden konnte. Die Interaktion von aus Thrombozyten stammendem RANKL mit auf NK-Zellen exprimiertem RANK führt schließlich zu einer Inhibition der NK-Zell-vermittelten Immunreaktion gegen die Tumorzellen, und durch Blockade der Interaktion mit dem RANKL-neutralisierenden Antikörper Denosumab kann die NK-Zell-Reaktivität deutlich verstärkt werden. Zu den Herausforderungen bei der Tumortherapie zählt neben metastasierten Erkrankungen auch Therapieresistenz. Letztere resultiert häufig in Rückfällen, was insbesondere bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) häufig zu beobachten ist. Die AML ist die häufigste akute Leukämie bei Erwachsenen. Obwohl sich die Behandlungsmöglichkeiten in den letzten Jahren verbessert haben, bleibt die Prognose von AML-Patienten schlecht. Ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, welche in der AML pathophysiologisch relevant sind, ist daher wichtig, um die Wirksamkeit von Behandlungen vorherzusagen und idealerweise den Therapieerfolg zu verbessern. In dieser Arbeit konnte RANK als Regulator von Resistenzmechanismen von AML-Zellen gegen konventionelle Chemotherapeutika identifiziert werden. Auf der Oberfläche der leukämischen Zellen von AML-Patienten wurde eine substantielle Expression von RANK detektiert. Eine Stimulation von RANK führte zu einer Resistenz der AML-Zellen gegenüber den in der AML-Therapie zentralen Chemotherapeutika Doxorubicin und Cytarabin. Zudem konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen der RANK-Expression und dem Krankheitsverlauf der in diese ex vivo Studie aufgenommenen Patienten festgestellt und somit RANK als potenzieller prognostischer Marker in der AML charakterisiert werden. Zusammenfassend wurde in dieser Dissertation gezeigt, dass das RANK/RANKL-Molekülsystem als Target dienen könnte, um eine Metastasierung bei soliden Tumoren zu verhindern sowie bei der AML eine Sensibilisierung der leukämischen Zellen gegenüber Chemotherapeutika zu erreichen und dadurch das Therapieansprechen und den Erfolg einer Behandlung positiv zu beeinflussen. Basierend auf den Ergebnissen dieser Doktorarbeit erscheinen weitere Untersuchungen gerechtfertigt, um die hier dargestellten Daten zu validieren und letztlich eine breite Basis für eine Modulation von RANK und RANKL für die Tumortherapie zu schaffen. Zukünftige Studien sollten dabei insbesondere auf die Möglichkeit fokussieren, die RANK/RANKL-Interaktion z.B. durch drug repurposing des klinisch verfügbaren neutralisierenden Antikörpers Denosumab zu durchbrechen.

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte in der Therapie des NSCLC erreicht. Es besteht weiterhin bei geringer Gesamtüberlebenszeit und hoher Inzidenz ein dringlicher Bedarf weitere Therapien zu etablieren. Weitere Therapien werden durch Therapieansätze im Rahmen der personalisierten Medizin ermöglicht und Vakzinierungen stellen ein hohes Potenzial für gut verträgliche Therapien dar. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass gerade für die genaue Auswahl von Peptiden beziehungsweise ihren Quellproteinen eine auf die Ligandomanalyse aufbauende Analyse betroffener Signaltransduktionswege ein hohes Selektionspotenzial bietet. So konnten aus den vorher diskutierten tumorspezifischen Quellproteinen durch Ausschluss zugeordneter bekannter Signaltransduktionswege Quellproteine mit hohem Potenzial wie PRAME oder MAGEA3/6 isoliert werden. Zusätzlich konnten weitere Quellproteine mit noch unbekanntem Potenzial wie TMEM39A oder CRISPLD2 für weitere Untersuchungen selektioniert werden. Klare klinische Korrelationen zur Eingrenzung des diagnostischen Aufwandes ließen sich in der aktuellen Kohorte nicht nachweisen, was am ehesten auf die geringe Kohortengröße zurückzuführen ist. Jedoch konnte an verschiedenen Quellproteinen gezeigt werden, dass durch die Überexpression im untersuchten Ligandom eine Repräsentanz bekannter Assoziationen zu Überexpressionen oder diskutierten Biomarkern gegeben ist. Zusätzlich konnte belegt werden, dass die teilweise kritisch betrachtete semiquantitative Analyse hoch- oder herunterregulierter Quellproteine mittels anschließender Analyse der Signaltransduktionswege das Potenzial bietet, neue Ansatzpunkte für Therapien zu finden. In diesem Fall scheint bei deutlicher Überexpression im Falle mehrerer Probanden ein Therapieversuch mit PI3K/Akt-Inhibitoren diskussionswürdig. Da bis dato dies nur bei mutiertem PI3K durchgeführt wird, sollte im Rahmen weitergehender Untersuchungen auch eine Korrelation zu Mutationen oder eine unabhängige PI3K-Überregulierung untersucht werden.

Dissertation ist gesperrt bis zum 18.07.2023 !! Senescence induction is becoming a relevant strategy in tumour treatment. Besides induction with therapeutic compounds (TIS – therapy induced senescence) senescence can be induced in tumor cells in vitro and in vivo via cytokine (IFN-γ & TNF) or TH1 cell treatment (CIS – cytokine induced senescence). Here, vulnerabilities acquired by senescence induction in β-cancer cells were investigated. While most CIS cancer cells remain viable, cease proliferation, and show SA-beta Gal activity, the cells also accumulate features associated with early apoptotic events. The cells lose their original membrane composition indicated by an increased surface localization of negatively charged phospholipids. This is accompanied by reduced mitochondrial membrane potential (Δψm) as well as changes in opening of the mitochondrial permeability transition pore (PTP), without changes in mitochondrial mass. This in turn compromises the retention of cytochrome c, leading to a depletion of overall cytochrome c protein. While caspase 3 activity in CIS cancer cells is enhanced in comparison to non-senescent cancer cells, it was suspected that increased levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 in CIS counteracts death induction in favor of senescence. Indeed, treatment of CIS cancer cells with ABT263 (pan-Bcl-2 inhibitor) induced apoptosis preferentially in senescent cancer cells. Furthermore, the changes in cellular status after senescence induction lifted the resistance of cancer cells to TRAIL induced cell death. This thesis shows that CIS and TIS β-cell tumour cells are susceptible to TRAIL induced cell death in comparison to non-senescent β-cell tumour cells. Further analysis showed that apoptosis induction in senescent cancer cells was a prerequisite to render β-cell cancer cells susceptible to phagocytosis by macrophages. Therefore, type I anti-cancer immune response can act as a relay between inducing a stable growth arrest in cancer cells and senescent cancer cell clearance by macrophages exploiting the acquired sensitivity to TRAIL of senescent cancer cells. Overall, introduction of senescence followed by secondary apoptosis induction may prove to be a relevant therapeutic strategy. The findings may be a first step in understanding new mechanisms in cancer immune therapy with the goal to clear senescent tumour cells.

The epigenetic code is modulated through writers, readers and erasers, which add, interpret and remove post-translational modifications on DNA and histones, respectively. However, while this process is essential to regulate gene expression and adapt to environmental influences, it is also exploited by cancer cells to enhance expression of oncogenes or silence transcription of tumor suppressors. BET proteins are epigenetic readers, which bind to acetylated lysine residues on histones and modulate transcription of target genes including the oncogene MYC. BET-inhibitors displace BET proteins from the chromatin and thereby suppress transcription of target genes. However, the complete catalogue of BET targets is still unknown and the function of BET-inhibitors especially on immune cells is under high debate showing immune suppressive and activating capabilities. In this thesis, the effect of the small molecule BET-inhibitor RG6146 was elucidated by assessing potential resistance mechanisms of Multiple Myeloma cell lines in vitro. Different hypothesis including overexpression of MYC, modulation of proteins of the intrinsic apoptosis pathway and presence of the export transporter ABCB1 were assessed in sensitive and resistant cell lines. While the effect of BET-inhibitors on cancer cells has been the main focus of research studies thus far, only little is known on the function of BET-inhibitors on immune cells. Therefore, one part of this research also focused on discovering the effect of RG6146 on CD4+ and CD8+ T cell activation using various in vitro assays. While T cell proliferation was strongly suppressed at early time points, longer treatment with RG6146 even enhanced cell division. The main part of this thesis describes the effect of BET-inhibitors in the interface between immune and cancer cells. RG6146 and structurally distinct BET-inhibitors were shown to sensitize cancer cells to TNF induced cell death by modulating pro-survival proteins of the NF-kB pathway thereby enhancing cell death in combination with a T cell bispecific antibody in vitro and in vivo. This thesis in collaboration with other research works is the basis for future potential combination strategies of BET-inhibitors with small molecules or immunotherapy.

In dieser Arbeit wurde der Einfluss der zytokininduzierten Seneszenz (CIS) auf die genetische Integrität untersucht und wie die Signalübertragung der CIS auf molekularer Ebene erfolgt. Im ersten Teil der Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die Einleitung der CIS zu Veränderungen in den Chromosomenaberrationen führt, welche die Malignität der Tumorzellen verstärken könnte. Dazu wurden verschiedene murine RT2 und RT2xStat1-/- Krebszelllinien mit den Th1 Zytokinen (IFNγ und TNF) behandelt und untersucht, ob die Chromosomenaberrationen der Tumorzelllinien durch diese Behandlung verändert werden. Zu diesem Zweck wurde das genetische Material der Zellen vor Beginn des Experiments und nach 96 h Behandlung mit Medium oder Th1 Zytokinen unter Verwendung der CGH untersucht. Die Ergebnisse der Experimente zeigen, dass es sich bei den primären RT2 Krebszelllinien um eine heterogene Population handelt. Wenn zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits ein Gleichgewicht zwischen den Subpopulationen vorliegt, führt eine Th1-Zytokinbehandlung nicht zu einer Veränderung der Chromosomenaberrationen. Dies gilt sowohl für RT2 als auch für RT2xStat1-/- Krebszelllinien. Wenn das Gleichgewicht zum Zeitpunkt des Experiments jedoch noch nicht hergestellt ist, können nach der CIS Induktion Veränderungen der Chromosomenaberrationen auftreten. Dies führte zu einer spezifischen Selektion von einer Chromosom 4 bzw. Cdkn2a deletierten Subpopulation der RT2 Krebszelllinie 3. Ein in vivo Transfer dieser Zelllinie (nachfolgend als mSc bezeichnet) mit anschließender Immuncheckpointtherapie (ICB) zeigte, dass das Wachstum dieser Zellen nicht mehr durch die ICB gestoppt werden konnte. Eine nachfolgende CGH Analyse der verschiedenen mSc ergab, dass die Zellen einen punktuellen Verlust des Cdkn2a Genes aufweisen. Eine anschließende in vitro Th1-Zytokinbehandlung bewies, dass die Zellen nicht mehr auf die CIS ansprechen konnten. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit den Th1 Zytokinen die Selektion von Chromosomenaberrationen innerhalb einer heterogenen Zellpopulation beeinflussen kann. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass das Fehlen von Cdkn2a die Induktion von CIS verhindert. Die Induktion der CIS ist als mögliche Behandlungsoption für unzugängliche oder metastasierte Krebsarten besonders interessant, weil sie zu einem p16INK4a-abhängigen Wachstumsstopp fuhrt. Da TNF aufgrund seiner zytotoxischen Wirkung nicht systemisch verabreicht werden kann, ist die Identifizierung des Signalweges entscheidend, um eine TNF-unabhängige Aktivierung des TNF-Signalweges zu induzieren. Deshalb wurde untersucht, wie die p16INK4a Expression nach IFNγ- und TNF-Stimulation eingeleitet wird. Ein möglicher Kandidat für die Signaltransduktion ist der AP-1 Transkriptionsfaktor JunB. Wie in den Experimenten gezeigt wurde, wird die JunB Expression in der CIS induziert. Diese JunB Expression ist TNF abhängig. Weitere Untersuchungen zeigten, dass die TNF-abhängige Induktion von JunB durch NF-κB vermittelt wird. Es wurden verschiedene Techniken zur Herunterregulierung bzw. zum knockout von JunB eingesetzt. Dies wurde, so die Hypothese, zu einer reduzierten p16INK4a Expression führen, welche die Induktion von CIS verhindert. Trotz einer reduzierten JunB Expression konnte in keinem der Ansätze die Einleitung der CIS verhindern werden. Es bleibt unklar, ob die verbleibende Menge an JunB ausreicht, um eine p16INK4a Expression zu induzieren, oder ob andere Transkriptionsfaktoren an der p16INK4a Induktion in der CIS beteiligt sind. In this work, the effect of cytokine-induced senescence (CIS) on genetic integrity and the way signal transduction of CIS occurs at the molecular level was studied. In the first part, the question was addressed whether the initiation of CIS leads to changes in chromosomal aberrations which might increase the malignancy of tumor cells. Therefore, different murine RIP1-Tag2 (RT2) and RIP1-Tag2 x signal transducer and activator of transcription 1-/- (RT2xStat1-/-) cancer cell lines were treated with the CD4+ T-helper cell 1 (Th1) cytokines interferon gamma (IFNγ) and tumor necrosis factor (TNF) and it was investigated whether the chromosomal aberrations of the tumor cell lines were changed by this treatment. For this purpose, the genetic material of these cells was examined before starting the experiment, and after 96 h treatment with medium or Th1 cytokines using array comparative genomic hybridization (CGH). The results of the experiments show that primary RT2 cancer cell lines are a heterogeneous population. If an equilibrium between the subpopulations has already been established at the time of the investigation, Th1 cytokine treatment does not alter chromosomal aberrations. This applies to both RT2 and RT2xStat1-/- cancer cell lines. However, if the equilibrium has not been established at the time of the experiment, changes in chromosomal aberrations may occur after CIS induction. This phenomenon appeared in RT2 cancer cell line 3, which resulted in a specific selection of chromosome 4 and, respectively, cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (Cdkn2a) loss subpopulation. An in vivo transfer of this cell line (referred to as mouse subcutaneous cell line (mSc)) with subsequent immune checkpoint blockade (ICB) treatment showed that these cells can no longer respond to ICB. A subsequent CGH analysis of the different mSc revealed that the cells have a selective Cdkn2a loss. A subsequent in vitro Th1 cytokine treatment proved that the cells could no longer respond to CIS. In summary, it was demonstrated that the treatment with the Th1 cytokines could alter the selection of chromosomal aberrations within a heterogeneous cell population. Moreover, it was shown that the absence of Cdkn2a prevents CIS induction. The induction of CIS is particularly interesting as a potential treatment option for inaccessible or metastasized cancers, as it leads to cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16INK4a)-dependent growth arrest. Since TNF cannot be administered systemically due to its cytotoxic effect, identification of the signaling pathway is crucial to induce TNF-independent activation of the TNF signaling pathway. Therefore, it was investigated how p16INK4a expression is induced after IFNγ and TNF stimulation. A possible candidate for signal transduction is the activator protein 1 (AP-1) transcription factor JunB proto-oncogene (JunB). As shown in the experiments, JunB expression is induced in CIS. This JunB expression is TNF-dependent. Further investigations showed that the TNF-dependent induction of JunB expression is mediated by nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B-cells (NF-κB). Different techniques were used to downregulate or knockout JunB. According to the hypothesis, this would lead to a reduced p16INK4a expression, which prevents the induction of CIS. Despite a reduced JunB expression, none of the approaches could prevent the induction of CIS. It remains unclear whether the remaining quantity of JunB is sufficient to induce a p16INK4a expression or whether other transcription factors are involved in the p16INK4a induction.

Die Vakzinierung mit Peptiden, die von tumorassoziierten oder -spezifischen Antigenen entstammen, welche eine Art der Immuntherapie darstellt, verfolgt das Ziel, eine spezifische, gegen den Tumor gerichtete Immunantwort zu induzieren, oder eine vorhandene Immunantwort zu verstärken. Das Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob solch eine Aktivierung des Immunsystems im Rahmen einer klinischen Phase I/II Peptid-Vakzinierungs-Studie bei Prostatakarzinom (PCa)- Patienten vorliegt. Die Patienten wurden wiederholt mit einem der RhoC Zielstruktur entstammenden synthetischen langen Peptid (SLP, 20 Aminosäuren), welches potentiell CD8 und CD4 Zellen aktivieren kann, zusammen mit Montanide ISA-51 vakziniert. Eine Vakzine-spezifische Immunantwort konnte in 86% der Patienten nachgewiesen werden, welche mindestens noch zehn Monate nach der letzten Vakzinierung nachweisbar war. Die Vakzin-spezifischen Zellen waren überwiegend multifunktionale CD4 Zellen, die einen Effektor-Gedächtnis-T-Zellen Phänotypen aufwiesen. Insgesamt konnten drei promiskuitiv präsentierte humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse II Peptide nachgewiesen werden. Die aktivierten CD4 Zellen zeigten auch nach wiederholten Vakzinierungen keinen Phänotypen der Exhaustion. Eine zusätzliche Vakzin-spezifische CD8 Zell Antwort, die durch HLA-B*27:05 restringiert war, konnte bei einem Patienten nachgewiesen werden. Die Untersuchung zeigt, dass das RhoC-entstammende Vakzin-Peptid immunogen ist und eine langanhaltende Immunantwort in einer Vielzahl von Patienten hervorruft. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit den technischen Aspekten die zur Durchführung der hier präsentierten klinischen Studie wichtig sind. Zuerst werden in einem Review die gebräuchlichsten Methoden zum Nachweis von Antigen-spezifischen T Zellen in der experimentellen Immuntherapie, neben einer neu etablierten Methode zur Identifizierung von Antigen-spezifischen CD8 Zellen, erläutert. Methoden, die mitunter beschrieben werden, werden in der Folge für den Nachweis von Antigen-spezifischen CD8 und CD4 Zellen mit Hilfe von SLPs eingesetzt, dessen Protokolloptimierung danach beschrieben wird. Wir zeigen, dass der Einsatz von Poly-ICLC (Hiltonol®), ein Toll-ähnlicher Rezeptor 3 Agonist, sowie eine erhöhte SLP Konzentration führte zu einem verbesserten Nachweis von Peptid-spezifischen Zellen. Das optimierte Protokoll findet sein Einsatzgebiet nicht nur im Monitoring von klinischen Studien, sondern zum Beispiel auch in der Identifizierung von Epitopen. Vaccination with peptides derived from tumor-associated or -specific antigens is a form of immunotherapy that specifically induces or reactivates T cell immune response to fight cancer. The aim of the present work was to assess the immune responses in prostate cancer (PCa) patients upon peptide vaccination in a clinical phase I/II study. PCa patients were repeatedly vaccinated with a RhoC-derived synthetic long peptide (SLP, 20 amino acids), which potentially activates CD8 and CD4 cells, emulsified in Montanide ISA-51. An immune response was detected in 86% of the patients after vaccination, which lasts at least ten months after the last vaccination. Vaccine-specific T cells were mainly poly-functional CD4 cells of the effector memory T cell phenotype. In total, three promiscuously presented human leucocyte antigen (HLA)-class II peptides were identified. No exhausted T cell phenotype was observed after multiple vaccinations. For one patient, a vaccine-directed CD8 cell response restricted by HLA-B*27:05 was detected in addition to the CD4 cell response. In conclusion, the RhoC-derived peptide is immunogenic and induces a long-lasting immune response in the majority of patients. The second part of the thesis deals with technical aspects that are important for the presented clinical study. First, the common methods for the monitoring of clinical studies are described in a review, besides a newly established method for the identification of antigen-specific CD8 T cells. Methods that are described in this review are used for the identification of antigen-specific CD8 and CD4 cells using SLPs, which protocol optimization is described afterwards. We showed that the addition of Poly-ICLC (Hiltonol®), a toll-like receptor 3 agonist, together with an increased SLP concentration, lead to an optimized identification of peptide-specific cells. The optimized protocol could be used for the monitoring of clinical studies, as well as for the identification of epitopes, for example.

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) stellt die häufigste Leukämie in der westlichen Hemisphäre dar. In den vergangen Jahren gelang zwar die kontinuierliche Verbesserung der Therapie, indem die herkömmliche Chemotherapie durch neue Ansätze (wie monoklonale Antikörper und verschiedene Inhibitoren) ergänzt wurde. Allerdings ist durch hohe Rezidiv Raten noch immer meist keine vollständige Heilung möglich. Um nun Mechanismen der CLL-Pathogenese und mögliche Grundlagen für weitere Therapieoptionen zu evaluieren, fokussiert sich diese Arbeit auf die Untersuchung der Rolle der beiden Proteine NFAT2 und LCK in der CLL. Ein entscheidender Faktor hierbei ist eine bestimmte Unempfindlichkeit gegenüber B-Zell-Rezeptor-Stimulation, genannt Anergie. Die Untersuchungen wurden dabei hauptsächlich im TCL1-Mausmodell der CLL durchgeführt. Mittels des TCL1-Modells konnten wir eine Anergie-Gen-Signatur bestehend aus Cbl-b, Egr2, Grail und Lck identifizieren, welche abhängig vom B-Zell-Rezeptor- und NFAT-Signaling ist. Durch den Knockout von NFAT2 im TCL1-Modell konnten wir außerdem demonstrieren, dass die Expression einiger regulatorischer Gene (Cdkn2a und Trp53) durch den Verlust von NFAT2 reduziert ist. Ebenso ist die Expression von Chemokin-Rezeptoren, die eine wichtige Rolle in der CLL spielen, verändert. Des Weiteren gelang der Nachweis von LCK als direktem NFAT2-Zielgen in primären Patientenproben. Außerdem konnten wir zeigen, dass LCK in anergen CLL-Zellen mit dem B-Zell-Rezeptor interagiert. Um daraufhin die Bedeutung von NFAT2 und LCK in der CLL weiter zu untersuchen, wurden diese Gene im TCL1-Modell ausgeknockt. Dabei zeigte sich durch den Verlust von NFAT2 und LCK ein verringertes Überleben. Allerdings kann im Falle des Verlusts von LCK die CLL nicht als alleinige Todesursache in Betracht gezogen werden. Des Weiteren zeigten sich im Falle der Deletion von LCK zwar Hinweise, aber keine eindeutigen Belege für eine Transformation der CLL. Durch die Deletion von LCK zeigten sich zudem zwar veränderte Zellzyklus- und Apoptoseraten, welche sich aber nicht als signifikant darstellten. Abschließende Untersuchungen der Expression wichtiger Anergie-Marker (Prdm1 und IgM) sowie der Ca2+ Mobilisation belegten jedoch den Verlust der Anergie durch den Verlust von NFAT2 und LCK. Durch diese Ergebnisse wurden NFAT2 und LCK als entscheidende Faktoren in der Anergie von CLL-Zellen identifiziert. Die Modulation der NFAT2-LCK-Achse könnte daher neue Therapieoptionen eröffnen.

Cancer immunotherapy has presented itself as a promising approach in the treatment of cancers. Actively incorporating the immune system in cancer treatment has proven to be successful in many different therapeutic approaches, ranging from CAR-T therapy or adoptive cellular transfer to peptide or RNA-based vaccines or biologics. One particularly attractive target for modifications in adoptive cellular transfer or adoptive cell therapy is the T cell receptor. This molecule expressed by T cells can bind to major histocompatibility complex molecules on target cells where they present peptide ligands derived from extra- or intracellular proteins by degradation. Successful recognition can lead to activation of the T cell and an immune response. Thus, introducing TCRs with optimal binding affinity for activation that are specific for a particular peptide-MHC known to be expressed on cancer cells has emerged as an attractive strategy. In anti-cancer biologics, TCR variable domains have also been used in place of antibodies in bispecific constructs that combine a tumor targeting moiety with a T cell engager like an anti-CD3 antibody. Here, the goal is to specifically bind to tumor cells and broadly activate T cells within the tumor microenvironment. In both approaches, reaching the optimal affinity may require increasing candidate TCRs affinity through maturation. Since the TCR repertoire seems to have evolutionally evolved to cover the very large number of possible peptide-MHC complexes by cross-reactivity of individual TCRs, these maturations may entail unwanted affinity changes towards peptide-MHCs that are not the intended target and express on healthy tissues as well for example, severely compromising the clinical safety of these approaches. To counteract these tendencies during development of these approaches, strategies were evaluated to determine the binding motif and potential cross-reactivity of either cellularly expressed or soluble TCRs with affinities which can be encountered in the natural TCR repertoire, as well as highly affinity maturated TCRs in soluble bispecific constructs. The different screening strategies were evaluated both with well-established cell biological approaches to determine T cell activation and more recent biochemical methods like bio-layer interferometry to directly measure binding kinetics between TCRs and peptide-HLA molecules. To facilitate screenings with the latter platform, a newly developed empty HLA-A*02:01 mutant stabilized by a disulfide bridge is introduced that greatly facilitates the generation of large peptide-HLA libraries for screenings. The different combinations of screening strategies and measurement method were compared within each TCR group with respect to sensitivity and usefulness. In addition, an approach is demonstrated to convert a determined binding motif into a search motif and used to identify off-target binders for high-affinity bispecific TCR constructs. Krebsimmuntherapien haben sich als vielversprechender Ansatz in der Behandlung von Krebserkrankungen herausgestellt. Ein besonders attraktives Ziel für Modifikationen im Rahmen von adoptiver Zelltherapie ist der T-Zell-Rezeptor (TCR), da dieser über die Erkennung spezifischer Peptid-HLA Komplexe, die Abbauprodukte interner- oder extrazellulärer Proteine präsentieren, Immunantworten unter anderem gegen Tumorzellen auslösen kann. In einer weiteren Anwendung dieses Konzeptes kann der T-Zell-Rezeptor auch in Form eines löslichen bisepzifischen Antikörpers bereitgestellt werden, der eine Tumorzell-bindende Domäne mit einer T-Zell-aktivierenden Domäne wie einem anti-CD3 Antikörper verbindet. In beiden Anwendungsfällen kann es notwendig sein, die Affinität des TCRs durch Maturierung zu erhöhen, um eine optimale Immunantwort auszulösen. Aufgrund der inhärent kreuzreaktiven Natur des TCR Repertoires können solche Eingriffe aber gleichzeitig unerwünschte Affinitätsänderungen gegenüber Peptid-HLA Komplexen hervorrufen, die auf gesunden Zellen exprimiert werden. Um solchen Tendenzen entgegen zu wirken wurden Strategien zur Bestimmung von TCR Bindemotifen und damit Kreuzreaktivitäten für zelluläre exprimierte oder in bispezifischen Konstrukten befindlichen TCRs, sowohl mit zellbiologischen Ansätzen zur Bestimmung der T-Zell Aktivierung als auch mit biochemischen Methoden zur direkten Messung der Bindung zwischen TCR und Peptid-HLA Komplex, untersucht und im Vortrag präsentiert. Um letztere Untersuchungen zu vereinfach wird eine neue entwickelte leere Disulfid-stabilisierte Mutante von HLA-A*02:01 vorgestellt, die die Erstellung großer Peptid-MHC Bibliotheken stark vereinfacht.

Viral vector-based vaccines are promising to elicit strong cellular and humoral immune responses. Within the genus Parapoxvirus of the Poxviridae, the Orf Virus (ORFV) strain D1701-V comprises various properties particularly favorable for the development of a vector platform technology and was shown to facilitate various vaccination approaches. To enhance viral vectors’ immunogenicity, current strategies implement the use of immunomodulatory elements and the elimination of viral immunomodulatory genes still present in the viral genome. To allow the insertion of multiple transgenes into a single vector, the present work examines the suitability of novel insertion sites for transgene expression by simultaneous deletion of ORFV D1701-V encoded genes non-essential for viral replication. Novel D1701-V deletion mutants were subjected to detailed characterization of the genetic stability of inserted transgenes, their growth behavior and capability to induce transgene expression in different target cells in vitro. Additionally, the D1701-V mutants’ immunogenicity was analyzed by their ability to activate pro-inflammatory pathways, peripheral blood mononuclear and antigen presenting cells, or to induce antigen-specific immune responses in vitro and in vivo. Additionally, proof-of-concept studies were performed to evaluate the suitability of ORFV D1701-V recombinants for the expression of immune checkpoint inhibitors (ICIs).

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Therapie und Prognose einiger Krebsformen durch die Anwendung von chimärisierten und humanisierten Antikörpern deutlich verbessert. Allerdings ist der therapeutische Erfolg solcher Substanzen, vor allem bei soliden Tumoren, bis heute begrenzt. Um die Antikörpertherapie von Tumoren zu optimieren, können verschiedene Strategien angewendet werden. Eine Möglichkeit ist die Entwicklung von bispezifischen Antikörperkonstrukten. Diese Konstrukte können simultan an zwei unterschiedliche Antigene binden, wobei das eine auf der Oberfläche von Tumorzellen und das andere auf Immunzellen exprimiert wird. Der Vorteil solcher Antikörper ist, dass über die Bindung an Oberflächenantigene auch Effektorzellen aktiviert werden, die keine Fc Rezeptoren tragen und deshalb von monospezifischen Antikörpern nicht rekrutiert werden können. An erster Stelle sind hier T-Zellen zu nennen, welche die Fähigkeit haben nach Aktivierung in vivo stark zu proliferieren und effektiv Tumorzellen bekämpfen zu können. Jedoch kann eine überschießende Reaktion des T-Zellsystems auch zu schweren Nebenwirkungen führen, was durch Auswahl optimierter Konstrukte vermieden werden kann. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Generierung und Charakterisierung von neuen Antikörpern zur Optimierung sowohl der Effektor- als auch der Zielzellseite von bispezifischen Antikörperkonstrukten. Um die Zielzellseite zu verbessern, wurden neue Antikörper gegen die tumorassoziierten Antigene PSMA und CDCP1 generiert, wobei die α-CDCP1 Antikörper nur initial charakterisiert wurden, da die Rolle des Moleküls (CDCP1) bei der Metastasierung in neuen Arbeiten zwar bestätigt wurde, seine Spezifität für Tumorzellen aber limitiert ist. Die gleichzeitig stromale und neovaskuläre Expression von PSMA sollte zu einer gezielten Lyse des Tumorendothels führen und verbessert dadurch den Einstrom von Immunzellen, wodurch die anti-tumorale Wirkung des bispezifischen Konstrukts zusätzlich verstärkt wird. Der mittels konventioneller Hybridomatechnologie neu generierte α-PSMA Antikörper 10B3 wurde näher charakterisiert und ist dem „benchmark“ Antikörper J591 insofern überlegen als er einen verminderten Antigenshift, stärkere Färbung der tumorassoziierten Gefäße und eine erweiterte Reaktivität mit Plattenepithelkarzinomen aufweist. Mit der humanisierten Form des 10B3-Antikörpers wurden bispezifische Antikörperkonstrukte zur Rekrutierung von T-Zellen (via CD3) in unterschiedlichen Formaten (IgGsc und Fabsc) generiert. Dabei konnte festgestellt werden, dass das tetravalente IgGsc-Format dem bivalenten Fabsc-Format, hinsichtlich einer verringerten off-target Aktivierung und verlängerter Serumhalbwertszeit, überlegen war. Mit diesem Molekül wurde deshalb ein humanisiertes bispezifisches Antikörperkonstrukt generiert (IgGsc PSMAxCD3), welches für eine GMP-konforme Produktion und eine klinische Phase I Studie vorgesehen ist. Darüber hinaus wurden in dieser Arbeit Antikörper gegen den γδ-T-Zellrezeptor generiert und in vitro charakterisiert. Ziel war es durch bispezifische Antikörper γδ-T-Zellen, eine effiziente T-Zellsubpopulation, zu rekrutieren und so eine überschießende T-Zellaktivierung zu verhindern. Die generierten bispezifischen Konstrukte waren in der Lage γδ-T-Zellen effizient gegen Tumorzellen zu rekrutieren.

Die Tendenz im zunehmenden Alter an Osteoporose zu erkranken steigt jährlich in den entwickelten Ländern und führt zu enormen Kosten im Gesundheitswesen. Deshalb ist es notwendig den Auslöser einer solchen Erkrankung ausfindig zu machen und ein neues Verständnis auf zellbiologischer Ebene zu bekommen um pharmakologisch entgegen zu wirken. Im Knochenmark können mesenchymale Stromazellen (MSC) sowohl zu Adipozyten als auch zu Osteoblasten differenzieren. Beim Altern ist die Verminderung der Knochendichte mit einer Reduzierung der Osteoblasten und einer Zunahme der Adipozyten im Knochenmark assoziiert. Dabei kontrollieren Integrine die Interaktion der Zellen mit der Matrix. Dies wird durch eine Reihe weiterer Moleküle, wie die beiden RhoGTPasen Cdc42 und Rac1, moduliert. Ziel dieser Arbeit ist, die Integrin-Matrix-Interaktion bei der Differenzierung der MSCs zu Adipozyten oder Osteoblasten im Knochenmark zu charakterisieren und die Rolle der beiden RhoGTPasen Cdc42 und Rac1 hierbei zu untersuchen.

One percent of the world population suffers from the neurodevelopmental disorder schizophrenia. During the last years, above hundreds of risk genes and functional changes in glutamatergic, GABAergic and dopaminergic signalling have been identified. Furthermore, prenatal complications increase the risk to develop schizophrenia. First symptoms occur between puberty and early adolescence and are divided into positive, negative and cognitive symptoms. Until today no suitable cellular test system has been developed to study the disease background and treatment opportunities. The development of iPSC technology enables the investigation of schizophrenia related changes based on patient-derived cells. In this thesis, fibroblast derived from healthy and disease individuals were reprogrammed into iPSC and further differentiated into cortical neurons. Each developmental step starting as iPSC and resulting as neurons showed the same morphological properties independent from the donor. Despite these similarities changes in early neurodevelopmental processes were observed in iPSC-derived neurons from patients with schizophrenia. The neurite outgrowth, the PSD95 cluster density and the calcium flux were reduced in case of schizophrenia. Transcriptome analysis revealed changes in gene expression related to gene of neuronal development, synapse, calcium signalling and immune response. In increased expression of MHCII related genes was measured via transcriptome analysis and immunocytochemical staining in cells from patients witch schizophrenia. Additionally, the effect of the antipsychotics clozapine, haloperidol and olanzapine as well as the mimetic peptides narpin, neurexide and FN4-NF3 on neurite outgrowth were investigated. A significantly reduced neurite outgrowth was observed in iPSC-derived neurons from CTR 1 after treatment with haloperidol or olanzapine. Above mentioned characteristics of cortical neurons cells exhibited similarities to previously described primary cells from patients with schizophrenia. Based on these findings iPSC-derived neurons could be used as test system for basic research and for the development of new therapeutical approaches for neurodevelopmental diseases like schizophrenia.

Bispezifische T-Zell-rekrutierende Antikörper-Konstrukte, auch BiTE Antikörper-Konstrukte (BiTE AKs) genannt (von bispecific T cell engaging antibody constructs), konnten in klinischen Studien bereits erfolgreich zur Behandlung verschiedener Formen von Krebs eingesetzt wer-den. Sie besitzen zwei Bindungsstellen mit unterschiedlichen Spezifitäten und binden so zum einen spezifisch an ein bestimmtes Protein auf der Oberfläche von Zielzellen, zum anderen an CD3ε, welches auf der Oberfläche aller T-Zellen vorkommt. Durch die so zustande kom-mende enge Bindung von T-Zellen an Zielzellen kommt es zur Ausbildung immunologischer Synapsen und zur Lyse der Zielzellen. In dieser Arbeit wurden auf der Grundlage muriner Antikörper-Spezifitäten BiTE AKs generiert, deren Zielprotein-bindende Anteile die Extrazel-lulär-Domäne des Influenza A-Matrixproteins 2 (M2e) oder das Cytomegalovirus Glykopro-tein B (gB) binden. Es konnte gezeigt werden, dass diese BiTE AKs in der Lage sind, die spezi-fische Lyse von Zellen zu vermitteln, die diese Proteine auf der Oberfläche tragen. Um BiTE AKs zu erhalten, deren M2e- bzw. gB-bindende Anteile eine Aminosäuresequenz aufweisen, die eine hohe Ähnlichkeit zur humanen Keimbahnsequenz, und dadurch ein geringeres im-munogenes Potential, besitzt, wurden die sich unterscheidenden Aminosäuren in den Framework-Regionen der murinen Sequenz, wenn möglich, gegen die Aminosäuren ausge-tauscht, die in der humanen Keimbahnsequenz an diesen Positionen vorkommen. Die resul-tierenden human-ähnlichen (human-like) M2e- und gB-bindenden einzelkettigen variablen Fragmente (scFvs) mit den besten Eigenschaften wurden als komplette BiTE AKs exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die so generierten human-like M2e BiTE AKs besaßen M2e-bindende Anteile, die bis zu 87,3 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz wa-ren (muriner Binder: 78,2 %). Der Großteil der human-like M2e BiTE AKs wies eine höhere Affinität zu M2e, sowie eine höhere zytotoxische Aktivität im Vergleich zum murinen M2e BiTE auf, obwohl die Sequenzen der CDRs (complementarity determining regions) nicht ver-ändert wurden. Mit unterschiedlichen Influenza A-Virusstämmen infizierte Zellen wurden in einem in vitro Zytotoxizitäts-Assay durch einen human-like M2e BiTE mindestens 5-fach besser lysiert, als durch das murine Molekül. Im Maus-Modell konnte außerdem gezeigt werden, dass die Tiere durch eine Behandlung mit human-like M2e BiTE vor dem tödlichen Verlauf einer Influenza A-Infektion geschützt waren, während die Behandlung mit dem gleich dosierten murinen M2e BiTE nur zum Teil schützend wirkte. Die generierten human-like CMV-gB BiTE AKs besaßen gB-bindende scFv-Anteile, die bis zu 85,9 % identisch mit der humanen Keimbahnsequenz waren (muriner Binder: 66,8 %). Die human-like CMV-gB BiTE AKs hatten eine vergleichbar hohe Aktivität in in vitro Zytotoxizitäts-Assays, wie der murine CMV-gB BiTE. Da CMV-gB und Influenza A-M2 sowohl hoch spezifisch für infizierte Zellen, als auch hoch konserviert zwischen verschiedenen Virusstämmen sind, könnten die unter-suchten BiTE AKs ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung dieser viralen Erkran-kungen sein. Die in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse zeigen zudem, dass BiTE AKs nicht nur in der Onkologie erfolgreich eingesetzt werden können, sondern ein Einsatz auch in dem breiten Feld der Infektionserkrankungen erfolgversprechend erscheint., Bispecific T cell engaging (BiTE) antibody constructs (ACs) have already been used to suc-cessfully treat different types of cancer in clinical trials. They possess two different binding sites. One binding site is specific for a certain target protein expressed on a diseased cell and the other is specific for CD3ε, which is expressed on all T cells. The resulting binding of T cells to target cells leads to the formation of immunological synapses and target cell lysis. In this thesis, different BiTE ACs were generated with target protein binding moieties based on the amino acid sequences of the variable fragments of murine antibodies specific for the extracellular domain of the Influenza A matrix-protein 2 (M2e) or the Cytomegalovirus gly-coprotein B (gB). It could be shown that these BiTE ACs are able to redirect T cells to bind and lyse cells carrying these proteins on the cell surface. To obtain BiTE ACs with M2e- or gB-binding moieties with a high similarity to the human germline amino acid sequence, resulting in a lower immunogenic potential of the antibody, the differing amino acids in the framework regions of the murine sequence were replaced by the respective human amino acids, if possible. The resulting human-like M2e- or gB-binding single-chain variable frag-ments (scFvs) with the best properties were converted into complete BiTE ACs which were expressed, purified and characterized. The generated human-like M2e BiTE ACs had M2e-binding moieties which displayed up to 87.3% identity to the human germline sequence (original murine binder: 78.2%). Most of the human-like M2e BiTE ACs showed higher affini-ties for M2e and higher cytotoxic activities, compared to the murine M2e BiTE, although the amino acid sequences of the complementarity determining regions (CDRs) had not been changed. Cells infected with different strains of Influenza A virus were lysed at least 5 times more potently by a human-like M2e BiTE, compared to the murine molecule. Moreover, a human-like M2e BiTE was able to protect mice infected with a potentially lethal dose of a mouse-adapted Influenza A strain from death, while mice treated with the same dose of the murine M2e BiTE were only partly protected. The human-like CMV-gB BiTE ACs had gB-specific moieties which exhibited up to 85.9% identity to the human germline sequence (murine gB-binding moiety: 66.8%). Compared to the murine CMV-gB BiTE, human-like CMV-gB BiTE ACs proved to be similarly effective in in vitro cytotoxicity assays. With Influ-enza A-M2 and CMV-gB being highly specific for virus-infected cells as well as highly con-served among different viral strains, the examined BiTE ACs could be a promising approach for the treatment of these two viral diseases. Moreover, the results presented in this thesis indicate a therapeutic potential of BiTE ACs beyond oncology, e.g. in the broad field of infec-tious diseases.

Treatment of oncological and autoimmune diseases still remains a considerable challenge to modern medicine. Current therapy options such as chemotherapy and radiotherapy in oncology and glucocorticoids or other conventional immunosuppressive drugs for autoimmune diseases are often of limited efficacy. They suffer from a lack of specificity, with respect to the eradication of tumour and immune cells, respectively. The use of monoclonal antibodies in oncology allowed in some instances specific targeting of tumour cells and thus, improved this situation in the last decades. Some antibodies, such as anti-CD20 antibody Rituximab, targeting normal and malignant B-cells, are meanwhile firmly established in oncological treatment regimes. Interestingly, over the last years the anti B-cell activity of Rituximab was used in addition in numerous studies for the treatment of autoimmune diseases. Many strategies have been developed to further improve therapeutic activity of monoclonal antibodies. One of them is the development of bispecific antibodies recognising target cell antigens and effector cells or effector molecules at the same time. The “bispecific concept” used in this work is the target cell restricted stimulation of the death receptor CD95 (APO-1/Fas) with bispecific antibodies as described by Jung et al. in 2000. Whereas initial experiments were performed using chemically hybridised bispecific antibodies with CD20×CD95 specificity, the goal of this thesis was the generation of recombinant antibodies within a suitable format. To this end, a recombinant CD20×CD95 molecule in the so called FabSc format, designated BS9520 was developed and characterised in various in vitro and in vivo assays. It was found that the capability of this antibody to suppress the growth of malignant B-cells in vitro and in vivo and to specifically deplete normal, activated B-cells from PBMC cultures was superior to that achieved with monospecific clinically established anti-CD20 antibodies including a newly developed third generation Fc-optimized CD20 antibody. Moreover, the bispecific antibody was the only reagent capable of significantly suppressing IgG production by activated B-cells in vitro. These findings imply that the bispecific CD95×CD20 antibody might become an attractive reagent for the treatment of B-cell malignancies as well as B-cell mediated autoimmune diseases. In the second part of this work a completely new approach for the stimulation of the CD95 death receptor on antigen specific B-cells was evaluated. For proof of principle, the CD20 part in the BS9520 antibody was replaced by antigen fragments (tetanus or diphtheria toxoid derivatives). We named these fusion proteins BS95TT and BS95DT, respectively. Such protein should bind to B-cell receptor via their toxoid part and with the CD95 antibody part to CD95 receptor on activated TTspecific B-cells. Thereby, apoptosis is induced only in an antigen-specific fashion. This approach could be used for the treatment of autoimmune diseases if the antigen inducing auto-antibody production is known (such as Myasthenia gravis, multiple sclerosis and others).

Das Orf Virus (ORFV) gehört zur Gattung Parapoxvirus der Poxviridae. ORFV zeichnet sich durch äußerst vorteilhafte immunstimulierende und protektive Eigenschaften aus, die es für den Nutzen als vielversprechende rekombinante Vektor-Vakzine interessant machen. Die vorliegende Arbeit umfasst die Neu- und Weiterentwicklung von ORFV-Rekombinanten und die Charakterisierung deren protektiven Eigenschaften sowie die Beschreibung von potentiellen neuen Evasionsmechanismen und immunrelevanten Eigenschaften von ORFV. Zur Herstellung und Selektion von ORFV-Rekombinanten wurden verschiedene Methoden der Transfektion optimiert, um in ORFV infizierten Zellen eine höchst mögliche Transfektionseffizienz zu erreichen. Die Etablierung der PCR für den Selektionsprozess neuer Rekombinanten löste das Problem der Abhängigkeit von Antikörpern, die gegen das inserierte Antigen gerichtet sind. Zudem ermöglichte der Einsatz von Fluoreszenz-Markergenen eine Reduktion der Arbeitsschritte, die zum Erhalt homogener Virus-Rekombinanten führen. Des Weiteren wurden verschiedene ORFV-Rekombinanten hergestellt, in deren Genom Fremdgene verschiedener Viren (BRV, BTV, AHSV, FMDV, RHDV und Influenzavirus) eingefügt wurden. Die korrekte Insertion und Expression dieser Gene wurden durch verschiedene molekularbiologische Methoden bestimmt und die protektiven Eigenschaften einiger Rekombinanten wurden in vivo charakterisiert. Die ORFV-Rekombinante D1701-V-VP1 konnte einen effektiven Schutz gegen RHDV im natürlichen Wirt, dem Kaninchen, induzieren. RHDV verursacht eine hochansteckende Erkrankung mit einer hohen Mortalitätsrate in Kaninchen. Da in vitro Zellkultursysteme fehlen, stammen kommerzielle Impfstoffe aus der Leber von RHDV infizierten Kaninchen. Bereits eine singuläre Immunisierung mit der Rekombinanten D1701-V-VP1 war ausreichend, um eine vollständige Immunität gegen eine letale RHDV Infektion in Kaninchen zu induzieren. Der induzierte Schutz beruhte neben der spezifischen Antikörperantwort gegen RHDV vermutlich auch auf einer Beteiligung von T-Zellen. Die generierte ORFV-Rekombinante stellt eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Vakzinen dar. Eine weitere neu hergestellte Rekombinante (D1701-V-HAh5n) exprimiert das Hemagglutinin (H5 HA), welches das Hauptimmunogen des hochpathogenen aviären Influenzavirus (HPAIV) Stamm H5N1 darstellt und virus-neutralisierende Antikörper induziert. Die Immunogenität dieser ORFV-Rekombinante wurde nach Immunisierungen von Mäusen mit anschließenden Belastungsinfektionen verschiedener Stämme des HPAIV H5N1 charakterisiert. Die immunisierten Tiere zeigten nach Infektion weder eine klinische Symptomatik noch einen Verlust an Körpergewicht. Zudem waren vakzinierte Mäuse auch vollständig gegen das heterologe humane Influenzavirus A Stamm H1N1 geschützt. Depletionsversuche in vivo von CD4-positiven und/oder CD8-positiven T-Zellen wiesen darauf hin, dass insbesondere CD4-positve T-Zellen für die Ausbildung der protektiven Immunität notwendig waren. Die in vivo Untersuchungen der protektiven immunologischen Charakteristika von ORFV-Rekombinanten, welche die Glykoproteine des Pseudorabiesvirus (PRV) exprimieren, zeigten eine ausgeglichene spezifische TH-1 und TH-2 Immunantwort. Bis zu 24 Stunden nach ORFV Immunisierung konnte eine gesteigerte Aktivität von Natürlichen Killerzellen und die Expression pro-inflammatorischer Zytokine (IL-1β, IL- 6, TNFα und G-CSF) nachgewiesen werden. Zu späteren Zeitpunkten und nach einer zweiten ORFV Immunisierung war vermehrt die Sekretion von TH-2 spezifischen Zytokinen (IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13) im Serum der Tiere nachweisbar. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Interferon-α/β und γ Rezeptoren essentiell für den Schutz vor einer PRV Infektion waren. Pockenviren besitzen ein breites Genspektrum, das eine Umgehung der Immunantwort des Wirts ermöglicht. So wurden die immunmodulatorischen Eigenschaften von ORFV und dessen Einfluss auf den Prozess der Antigenpräsentation über MHC I in infizierten Vero Zellen untersucht. Abhängig von der Infektionsdauer war die MHC I Expression auf der Zelloberfläche bis zu 50% reduziert. Zudem konnte bei infizierten Zellen eine verlängerte Halbwertszeit von vorhandenen MHC I Molekülen an der Zelloberfläche nachgewiesen werden. ORFV scheint die MHC I Oberflächenexpression herab zu regulieren, indem es direkt die Struktur der Golgi Kompartimente und das vesikuläre Transportsystem angreift. Dies wiederum hat Einfluss auf die Präsentation viraler Antigene und die Aktivierung von T-Zellen. Zudem zeigten Analysen eine Ko-Lokalisierung zwischen MHC I und COP-I Vesikeln sowie einen gestörten Glykosylierungszustand von post-ER MHC I Molekülen. Die beschriebenen Arbeiten demonstrieren eindrücklich die bemerkenswerten Eigenschaften des ORFV Stamm D1701-V und dessen großes Potential als Vektor- Impfstoff gegen virale pathogene Erreger.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Immunstatus von 21 Patienten während der Radiotherapie ihres Prostatakarzinoms untersucht. Längerfristig soll der optimale Zeitpunkt für die Applikation einer Immuntherapie in Kombination mit der Bestrahlung festgelegt werden. Hierzu wurde vor, während und nach der Bestrahlungstherapie Blut abgenommen, die Lymphozyten isoliert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Es wurden die Verläufe der Zellanteile über die Therapie hinweg untersucht, darüber hinaus wurden Vergleiche zwischen unterschiedlichen Therapiegruppen (Hormon-ablative Therapie, Vorliegen einer erweiterten Bestrahlung des pelvinen Lymphabflusswegs, Applikation einer lokalen Steroidtherapie) und mit sechs gesunden Probanden vorgenommen. Nach Sichtung der Ergebnisse konnten einige Veränderungen im Immunstatus der untersuchten Patienten erkannt werden: Die absoluten Zahlen der Leukozyten und Lymphozyten nahmen während der Bestrahlungstherapie ab. Davon besonders betroffen waren B- und T-Zellen, während der relative Anteil der NK-Zellen zunahm. Außerdem stieg der Anteil der regulatorischen T-Zellen unter der Bestrahlung an. Bei fast allen untersuchten Zellpopulationen konnte gegen Bestrahlungsende eine deutlich erhöhte Proliferationsrate detektiert werden. Im Vergleich mit den Ergebnissen der gesunden Probanden konnten vor allem die erniedrigte Immunzellzahl und die erhöhte Proliferationsrate nachgewiesen werden. Als Simulation für Tumorantigen-spezifische CD8+-T-Zellen wurden in der Studie Virusantigen-spezifische Zellen der Patienten untersucht (für CMV, EBV und Influenza). Bei diesen Zellen konnten unter der Radiotherapie keine einschränkenden Veränderungen nachgewiesen werden, sodass es naheliegt, dass eventuell vorhandene anti-Tumor-Immunzellen ebenfalls keinen Schaden nehmen würden. Dies sollte durch speziell dafür konzipierte Studien bestätigt werden. Die Ergebnisse der durchgeführten Arbeit zeigen, dass einer Kombination von immuntherapeutischen Verfahren, zum Beispiel eine Peptidvakzinierung, mit der Radiotherapie möglich ist. Ein Beginn der Immuntherapie ist entweder mindestens drei Monate nach Ende der Bestrahlung denkbar, wenn das Immunsystem sich bereits wieder teilweise erholt hat. Alternativ scheint ein überlappendes Therapieprotokoll sinnvoll, das die erhöhte Proliferationsrate der Immunzellen unter der Radiotherapie ausnutzen würde. Diese Ansätze sollten in einer vergleichenden Studie gegeneinander getestet werden.

Over the last two decades, monoclonal antibodies improved the treatment options for various cancers significantly. However, the production process for these proteinbased therapeutics is considerably more demanding than that for small molecule drugs. This is particularly true for complex proteins such as bispecific antibodies. The purpose of this thesis was to develop a production process and a preliminary formulation buffer for the bispecific FLT3ˆCD3 antibody NF-CUN297Q, which was developed for the treatment of acute myeloid leukemia (AML) and is intended to be applied in a clinical phase I/IIa trial. Thus, the main challenges for the production- and formulation development are to produce a sufficient amount of the active pharmaceutical ingredient (API) with very high quality and to ensure long-term stability of the product. Good manufacturing practice (GMP)-compliant production processes are usually developed and performed by the pharmaceutical industry. The special aspect of this thesis is the realization of GMP-compliant late-stage development of a protein-based pharmaceutical drug at a small spin-off company operating at an university campus. As a first step, specifications for critical quality attributes (CQA) were established and justified. If mandatory requirements from regulatory authorities existed for certain CQAs, these specifications were adopted for the development process. If no specific requirements were demanded, commonly applied specifications were adopted from similar production processes. If commonly applied specifications were not feasible, specifications were deducted from experimental characterizations. One example for this approach is the determination of the tolerable amount of product-related impurities such as aggregates, light chain dimers and light chains in the final product formulation. The required amount of the API for a clinical phase I/IIa trial including all necessary validations was discussed and determined theoretically. The second task was to find an economic approach for the development of a production process which fulfills the previously developed specifications and complies with GMP requirements. At the beginning of process development, a suitable Chinese hamster ovary (CHO)-based expression cell line, a so-called primary seed bank (PSB), was generated and a scalable standard fermentation protocol was successfully adopted. A variety of purification applications was tested for their suitability to fulfill the previously determined specifications. In conclusion, a production process consisting of affinity chromatography using KappaSelect followed by anion exchangeand hydrophobic interaction chromatography and nanofiltration was developed. The small-scale model (scale 1:100) of the process fulfills the requirements for product quality and quantity and complies with GMP requirements. A preliminary protein formulation buffer for the purified bispecific antibody was selected using thermodynamic and kinetic stability studies in carefully chosen test formulations. The evaluation of the melting temperature and the extent of aggregation of the API after a distinct time period of thermal stress resulted in a formulation buffer consisting of Histidine, Trehalose and Tween® 20. This buffer indicates stability and a long shelf-life of bispecific antibody NF-CUN297Q. The performed process- and preliminary formulation development are central prerequisites for GMP-compliant production. Bispecific antibody NF-CUN297Q produced with this GMP-process and formulated in the developed buffer will be suitable for application in a clinical phase I/IIa trial for the treatment of AML. This is an important prerequisite for the successful proof of safety and efficacy of this pharmaceutical drug.

Natürliche Killer (NK)-Zellen sind zytotoxische Lymphozyten der angeborenen Immunität, die eine wichtige Rolle bei der Immunüberwachung von Tumoren, insbesondere von malignen hämatopoetischen Neoplasien, spielen. Aufgrund ihrer Fähigkeit nach Fc-Rezeptorstimulation antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) zu vermitteln, tragen sie maßgeblich zum therapeutischen Erfolg von anti-Tumor Antikörpern, wie z.B. Rituximab, bei. Letzterer ist mittlerweile ein essentieller Bestandteil der meisten Behandlungsstrategien von B-Zell Malignomen. Während der letzten Jahre berichteten jedoch zahlreiche Studien darüber, dass in Patienten mit Chronisch Lymphatischer Leukämie (CLL) die Fähigkeit von NK-Zellen, maligne Zellen direkt zu lysieren oder Rituximab-induzierte ADCC zu vermitteln, beeinträchtigt ist. Die Mechanismen, die diesen Beobachtungen zu Grunde liegen, sind bis heute weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit konnte nun das TNF-Familienmitglied B cell activating factor (BAFF) als Faktor identifiziert werden, welcher zur Resistenz der CLL-Zellen gegenüber einer NK-Zellattacke beiträgt. BAFF wird hauptsächlich von Zellen myeloischen Ursprungs exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Proliferation, Funktion und dem Überleben von B-Zellen. Neben seiner bedeutenden Rolle in Autoimmunerkrankungen, trägt BAFF durch seine anti-apoptotische und überlebensfördernde Wirkung auch zur Pathophysiologie von B-Zell Malignomen bei. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass NK-Zellen BAFF ohne detektierbare Oberflächenexpression löslich freisetzen. Die BAFF-Freisetzung wurde durch NK-Aktivierung noch gesteigert, und dies war neben aktivierenden Zytokinen auch nach Fc-Rezeptorstimulation mittels CD20-Antikörper zu beobachten. BAFF wiederum steigerte die metabolische Aktivität primärer CLL-Zellen und verringerte die direkte und Rituximab-induzierte Lyse der CLL-Zellen, ohne die NK-Reaktivität per se zu beeinflussen. Darüber hinaus vermittelte BAFF eine Resistenz von CLL-Zellen gegenüber einer Behandlung mit den Systemtherapeutika Fludarabin und Cyclophosphamid (FC). Der für die Behandlung des Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) zugelassene neutralisierende BAFF-Antikörper Belimumab verhinderte die Effekte von BAFF auf die metabolische Aktivität der CLL-Zellen und stellte die Suszeptibilität für die direkte und Rituximab-induzierte NK-Lyse in allogenen und autologen experimentellen Ansätzen wieder her. Des Weiteren sensitivierte Belimumab die CLL-Zellen für eine systemtherapeutische Behandlung mit FC. Diese Ergebnisse identifizieren BAFF nicht nur als Faktor, der zur beobachteten Resistenz von CLL-Zellen gegenüber der direkten und Rituximab-induzierten NK-Antitumorimmunität beiträgt, sie decken darüber hinaus das Potential BAFF-neutralisierender Reagenzien zur Verstärkung der NK-Zell-Reaktivität für Immuntherapie und konventionelle Systemtherapeutika auf.

Die pädiatrische B-Linien akute lymphoblastische Leukämie („pediatric B-precursor acute lymphoblastic leukemia“, BCP-ALL) ist die häufigste Krebserkrankung im Kindesalter. Obwohl die Erkrankung heutzutage bei 80 % der Patienten erfolgreich behandelt wird, ist die Prognose für primär refraktäre oder rezidivierte BCP-ALLs schlecht. Selbst nach einer erfolgreichen Stammzelltransplantation (SZT) bleibt das Rezidivrisiko beträchtlich und korreliert signifikant mit der minimalen Resterkrankung („minimal residual disease“, MRD) vor oder nach SZT. Aufgrund der vorteilhaften Effektor-zu-Zielzellverhältnisse erscheinen MRD-Konstellationen allerdings besonders geeignet für eine immuntherapeutische Intervention mit therapeutischen Antikörpern. Für den Einsatz in individuellen Heilversuchen wurde ein Fc-optimierter CD19-Antikörper (4G7SDIE) in pharmazeutischer Qualität hergestellt. Im Rahmen der vorgestellten Arbeit wurde zunächst CD19 als Zielantigen für die BCP-ALL evaluiert und 4G7SDIE präklinisch charakterisiert. Nachdem eine Eignung des CD19 Antigens zur Antikörpertherapie der BCP-ALL gezeigt wurde sowie eine biologische Aktivität von 4G7SDIE in vitro nachgewiesen wurde, wurden MRD-positive BCP-ALL mit 4G7SDIE behandelt. Es wurde die biologische Aktivität von 4G7SDIE bezüglich der Lyse von autologen Blasten behandelter Patienten sowie die Effektorzellaktivität der behandelten Patienten in vitro und in vivo nachgewiesen. Zudem wurde das klinische Ansprechen der behandelten Patienten in Bezug auf die in vitro Daten betrachtet und versucht prognostische Faktoren zu identifizieren. Die in der Arbeit gezeigten vielversprechenden anti-leukämische Effekte von 4G7SDIE dienten als Vorarbeiten und zur Vorbereitung einer klinischen Phase I/II Studie. Die Ergebnisse und etablierten Methoden werden in der Studie zu dem Patientenmonitoring, der Patientenstratifizierung sowie der optimalen Wahl der Therapiezyklen und verabreichten Dosen beitragen. Zudem wurden potentielle Limitationen von 4G7SDIE aufgezeigt, die im Rahmen einer Studie genauer betrachtet werden sollten.

Die Chronische Lymphatische Leukämie (CLL) ist mit über 4000 Neuerkrankungen pro Jahr die häufigste hämatologische Erkrankung in Deutschland. In den allermeisten Fällen ist die CLL nicht vollständig heilbar. Durch konventionelle Chemotherapeutika und Antikörper-basierte Immuntherapien gelingt es zwar oft die Patienten möglichst lange in Remission zu halten, trotzdem steigt das Bedürfnis nach neuen Therapieansätzen stetig. In dieser Arbeit wurde zum einen der Einfluss des Transkriptionsfaktors NFAT2 auf die Entwicklung physiologischer B-Zellen untersucht und zum anderen seine Rolle in der Pathogenese der CLL detailliert charakterisiert. Diese Analysen wurden in einem konditionellen NFAT2-Knockout Mausmodell in Kombination mit dem transgenen Eµ-TCL1-Modell der CLL durchgeführt. Während im physiologischen B-Zell-Modell der Verlust von NFAT2 zu einer Hemmung der B-Zell-Entwicklung und einer Reduktion der B1 B-Zell-Subpopulation führt, ergaben die Analysen im CLL-Modell ein differentes Ergebnis. Hier führte der Verlust von NFAT2 zu einer Akzeleration der CLL-Erkrankung. Dies führte zu einem drastisch reduzierten Überleben dieser Tiere und einer verstärkten Akkumulation der CLL-Zellen in der Peripherie. Als Ursache konnte eine gesteigerte Proliferation in der Leukämie-Kohorte mit NFAT2-Knockout beobachtet werden. Da die Proliferation der B-Zellen stark B-Zell-Rezeptor-abhängig reguliert wird, wurde die Funktionalität des BCRs untersucht. In der normalen TCL1-Kohorte zeigte sich ein anerger Phänotyp, wodurch die CLL-Zellen unfähig waren, auf αIgM-Stimulation durch Ca2+-Mobilisation zu reagieren. Ferner konnte eine konstitutive Aktivierung des AKT- und ERK-Signalwegs und eine starke Expression der in dieser Arbeit vorgeschlagenen Anergie-Gene Cbl, Grail, Pacsin1 und Lck beobachtet werden. Diese Beobachtungen entsprechen den bekannten Daten aus einer Subpopulation der CLL-Patienten, die einen sehr milden Verlauf der Erkrankung mit guter Langzeitprognose zeigen. Der Verlust von NFAT2 in den CLL-Zellen führte hingegen zu einer Aufhebung der Anergie und damit zu einem hochresponsiven Phänotyp. Die molekulare Analyse der proximalen BCR-Signalkaskaden zeigten im Vergleich zu der meist konstitutiven Aktivierung in der TCL1-Kohorte eine induzierte Aktivierung der Kinasen SYK, LYN, ERK und AKT. Interessanterweise zeigte die Tyrosinkinase LCK als einzige eine Aktivierung nach BCR-Stimulation in der anergen TCL1-Kohorte. Aufgrund dieser Tatsache werden NFAT2 und die LCK-Kinase, welche vermutlich auch durch NFAT2 aktiviert wird, als maßgebliche Regulatoren der Anergie bei der CLL postuliert.

Zusammenfassend konnten die in dieser Arbeit durchgeführten in vitro Studien einen grundlegenden Mechanismus zur Ausbalancierung aktivierender und inhibierenden Signale in humanen moDZ aufdecken. Je nach Aktivierung oder Inhibierung des PI3K/Akt/GSK3-β-Signalwegs, entwickeln sich moDZ zu immunstimulierenden oder tolerogenen DZ. Hierbei wird ein Großteil der immuninhibierenden Eigenschaften der tolerogenen moDZ durch die Expressionssteigerung des immuninhibitorischen Transmembranprotein Osteoactivin (OA) hervorgerufen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition des PI3K/Akt-Signalwegs durch Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder Interleukin (IL)-10 zur Aktivierung der „Glycogen synthase kinase 3 beta“ (GSK3-β) und der darauf folgenden Aktivierung des „Microphthalmia-associated Transcription Factor“ (MITF) führt. Nachdem MITF aktiviert wurde, transloziert der Transkriptionsfaktor (TF) in den Zellkern und sorgt hier für eine Steigerung der OA Transkription. Dies führt schließlich zu einer stark reduzierten T-Zell-Stimulationsfähigkeit der moDZ, die jedoch durch OA-blockierende Antikörper (AK) oder rekombinantes Syndecan (SD)-4 wieder hergestellt werden konnte. Umgekehrt führt die Aktivierung des PI3K/Akt-Signalweges durch „Toll-like Receptor“ (TLR)-Liganden wie Lipopolysaccharid (LPS) und „Polyinosinic:polycytidylic acid“ (Poly(I:C)) oder inflammatorische Zytokine wie „Tumor Necrose Factor“ (TNF) und „Interferon gamma“ (IFN-γ) zur Inhibition von GSK3-β durch Akt. Dadurch wird MITF nicht mehr aktiviert wodurch auch keine Transkription von OA mehr erfolgen kann. Gleichzeitig kommt es zur Ausreifung der moDZ, was wiederum zu einer sehr guten T-Zell-Stimulationsfähigkeit der moDZ führt. Diese Ergebnisse stehen in Einklang mit der physiologischen Funktion dendritischer Zellen, welche je nach Bedarf eine T-Zell-Antwort auslösen oder inhibieren sollen. Die hier Erzielten Ergebnisse könnten gleich in mehreren Bereichen klinisch signifikant sein. Zum einen könnte die Aufdeckung eines grundlegenden Mechanismus zur Induzierung tolerogener moDZ in der Behandlung von Transplant-Wirt-Reaktionen oder Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoider Arthritis eingesetzt werden. Zum Anderen sollte auf Grund unserer Ergebnisse bei zukünftigen Kombinationstherapien aus TKI Behandlung und DZ-basierter Immuntherapie, eine Inhibition der OA-Expression oder -Funktion zur Wirksamkeitssteigerung der Behandlung in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus ist mit Hilfe unserer Studien nun eine relativ gezielte Kontrolle der OA-Expression möglich wodurch der „Immunescape“ OA-exprimierender Tumoren verhindert werden kann oder die Wirksamkeit von auf OA ausgerichteter Immuntherapien verbessert werden könnte.

Die Therapie viraler Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) stellt aufgrund der Toxizität und limitierten Wirksamkeit der zur Verfügung stehenden Virostatika nach wie vor eine große Herausforderung dar. Als attraktive Behandlungsoption bietet sich hier die Immuntherapie in Form eines adoptiven T-Zelltransfers an. Die bislang für eine klinische Anwendung zur Verfügung stehenden Protokolle dienen jedoch entweder nur der Isolation Antigen-spezifischer T-Zellen gegen einzelne Viren oder sind sehr zeitaufwendig. Der Fokus der aktuellen Forschung liegt daher auf der Entwicklung zeitsparender Protokolle und der simultanen Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen gegen mehrere Viren für einen prophylaktischen Einsatz sowie zur Therapie multipler Infektionen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein für den klinischen Einsatz geeignetes, GMP-konformes und zeitsparendes Protokoll zur simultanen Isolierung und anschließenden Charakterisierung Antigen-spezifischer polyklonaler CD4+ und CD8+ T-Zellen gegen die nach allogener HSZT häufig auftretenden Viren Adenovirus (AdV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalievirus (CMV) evaluiert. Als Isolationsmethode wurde der Cytokine Sekretion Assay (CSA) in Kombination mit magnetischer Anreicherung nach Antigenstimulation gewählt. Dabei war es möglich, selbst aus sehr geringen Ausgangsfrequenzen und unterschiedlicher Dominanz einzelner Spezifitäten eine simultane Isolation von Antigen-spezifischen T-Zellen gegen AdV, EBV und CMV durchzuführen. Mit der Entwicklung eines geeigneten Expansionsprotokolls wurden die angereicherten T-Zellen nach einer 14-tägigen Expansion hinsichtlich ihrer Virus-Spezifität, Polyfunktionalität und Epitopspezifität untersucht. Von sieben nach GMP-Richtlinien durchgeführten Isolationen Virus-spezifischer T-Zellen war die Anreicherung aller im Screening gefundener Spezifitäten in sechs Fällen (86%) erfolgreich. Je nach Antigen waren 3-33% der CD4+ und 7-35% der CD8+ T-Zellen polyfunktional im Sinne einer simultanen Sekretion von IFNg, TNFα und IL-2. Ebenso war es möglich, unter den isolierten Virus-spezifischen T-Zellen für alle untersuchten Spender epitopspezifische T-Zellen gegen HLA-gematchte Peptide nachzuweisen. In der Praxis hat sich die gewählte Screening-Methode – ein direkt ex vivo durchgeführtes intrazelluläres FACS auf IFNg-Produktion – leider als nicht ausreichend prädikativ erwiesen, da die geringen Frequenzen Virus-spezifischer T-Zellen zu nahe an der Nachweisgrenze liegen. Eine Isolation Virus-spezifischer T-Zellen gegen die im Screening als positiv eingestuften Spezifitäten war unter den CD4+ T-Zellen nur zu 91% (20/22) und unter den CD8+ T-Zellen nur zu 85% (22/26) möglich. Hier könnte für die Zukunft über eine dem Screening vorangehende Antigen-spezifische Expansion nachgedacht werden. In einigen Fällen war es bereits möglich, die klinische Wirksamkeit der so isolierten „Multivirus-spezifischen“ T-Zellen im Rahmen von sogenannten „individuellen Heilversuchen“ nachzuweisen. Das hier entwickelte GMP-konforme Protokoll zur simultanen Isolierung Antigen-spezifischer T-Zellen gegen AdV, EBV und CMV bietet somit eine attraktive Behandlungsoption bei viralen Infektionen nach allogener HSZT. Für einen Wirksamkeitsnachweis sollten jedoch GCP-konforme, kontrollierte klinische Studien durchgeführt werden.