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Extracellular vesicles (EV) and the microRNAs that they contain are increasingly recognised as a rich source of informative biomarkers, reflecting pathological processes and fundamental biological pathways and responses. Their presence in biofluids makes them particularly attractive for biomarker identification. However, a frequent caveat in relation to clinical studies is low abundance of EV RNA content. In this study, we used NanoString nCounter technology to assess the microRNA profiles of n = 64 EV low concentration RNA samples (180–49125 pg), isolated from serum and cell culture media using precipitation reagent or sequential ultracentrifugation. Data was subjected to robust quality control parameters based on three levels of limit of detection stringency, and differential microRNA expression analysis was performed between biological subgroups. We report that RNA concentrations > 100 times lower than the current NanoString recommendations can be successfully profiled using nCounter microRNA assays, demonstrating acceptable output ranges for imaging parameters, binding density, positive/negative controls, ligation controls and normalisation quality control. Furthermore, despite low levels of input RNA, high‐level differential expression analysis between biological subgroups identified microRNAs of biological relevance. Our results demonstrate that NanoString nCounter technology offers a sensitive approach for the detection and profiling of low abundance EV‐derived microRNA, and may provide a solution for research studies that focus on limited sample material.

[Abstract] Aims. After a few passages of in vitro culture, primary human articular chondrocytes undergo senescence and loss of their phenotype. Most of the available chondrocyte cell lines have been obtained from cartilage tissues different from diarthrodial joints, and their utility for osteoarthritis (OA) research is reduced. Thus, the goal of this research was the development of immortalized chondrocyte cell lines proceeded from the articular cartilage of patients with and without OA. Methods. Using telomerase reverse transcriptase (hTERT) and SV40 large T antigen (SV40LT), we transduced primary OA articular chondrocytes. Proliferative capacity, degree of senescence, and chondrocyte surface antigen expression in transduced chondrocytes were evaluated. In addition, the capacity of transduced chondrocytes to synthesize a tissue similar to cartilage and to respond to interleukin (IL)-1β was assessed. Results. Coexpression of both transgenes (SV40 and hTERT) were observed in the nuclei of transduced chondrocytes. Generated chondrocyte cell lines showed a high proliferation capacity and less than 2% of senescent cells. These cell lines were able to form 3D aggregates analogous to those generated by primary articular chondrocytes, but were unsuccessful in synthesizing cartilage-like tissue when seeded on type I collagen sponges. However, generated chondrocyte cell lines maintained the potential to respond to IL-1β stimulation. Conclusion. Through SV40LT and hTERT transduction, we successfully immortalized chondrocytes. These immortalized chondrocytes were able to overcome senescence in vitro, but were incapable of synthesizing cartilage-like tissue under the experimental conditions. Nonetheless, these chondrocyte cell lines could be advantageous for OA investigation since, similarly to primary articular chondrocytes, they showed capacity to upregulate inflammatory mediators in response to the IL-1β cytokine. Xunta de Galicia; ED431B 2020/55 Xunta de Galicia; IN607A2021/07 Instituto de Salud Carlos III; PI20/00933 Instituto de Salud Carlos III; PI17/02197 Instituto de Salud Carlos III; PI19/01206

Resumen Instituto de Salud Carlos III; PI17/02197

Resumen Xunta de Galicia; R2016/036 Xunta de Galicia; R2014/050 Xunta de Galicia; CN2012/142 Xunta de Gaicia; GPC2014/048 Instituto de salud Carlos III; PI17/02197

Resumen

y. Aim: The aim of this study was to evaluate proliferation and chondrogenic differentiation of human bone-marrow mesenchymal stromal cells (hBMSCs) cultured on collagen biomaterials. Materials and Methods: hBMSCs were seeded on five different collagen (Col) sponges: C1C2 (types I and II Col), C1C2HS (types I and II Col plus heparan sulphate (HS)), C1C2CHS (types I and II Col plus chondroitin sulphate (CHS)), C1-OLH3 (type I Col plus low molecular weight heparin) and C1CHS (type I Col plus CHS). The resulting constructs were analyzed by histological and immunohistochemical staining, molecular biology and electron microscopy. Col released into culture media was measured by a dye-binding method. Results: hBMSCs on biomaterials C1C2, C1C2HS and C1C2CHS had more capacity to attach, proliferate and synthesize Col II and proteoglycans in the extracellular matrix (ECM) than on C1-OLH3 and C1CHS. The presence of aggrecan was detected only at the gene level. Total Col liberated by the cells in the supernatants in all scaffold cultures was detected. The level of Col I in the ECM was lower in C1-OLH3 and that of Col II was highest in C1C2 and C1C2HS. Electron microscopy showed differently shaped cells, from rounded to flattened, in all constructs. Col fibers in bundles were observed in C1C2CHS by transmission electron microscopy. Conclusions: The results show that Col I and Col II (C1C2, C1C2HS and C1C2CHS) biomaterials allowed cell proliferation and chondrogenic-like differentiation of hBMSCs at an early stage. Constructs cultured on C1C2HS and C1C2CHS showed better cartilage-like phenotype than the other ones.

Programa Oficial de Doutoramento en Ciencias da Saúde. 5007V01, [Resumo]A artrose (OA) é a patoloxía reumática máis prevalente e, na actualidade, non existe un tratamento efectivo. Unha das causas deste trastorno é o desenvolvemento secundario tras unha lesión na cartilaxe hialina articular ou no óso subcondral. A Enxeñería Tisular (IT) osteocondral, utilizando células e soportes, xurdiu como unha terapia prometedora. O obxectivo deste estudo foi determinar o potencial de reparación das células mesenquimais estromais (CMEs), en combinación con diferentes tipos de soportes, para o seu uso na IT osteocondral. En primeiro lugar, illáronse e caracterizáronse CMEs, obtidas de medula ósea humana e ovina, e de células similares a CMEs (CSMEs), diferenciadas a partir de células pluripotentes inducidas (iPS). En segundo lugar, estudouse a capacidade de diferenciación condroxénica das CMEs humanas, cultivadas en diferentes soportes de coláxeno (Col). Tamén, testouse a capacidade de diferenciación osteoxénica das CMEs ovinas, cultivadas sobre soportes de Col I e β fosfato tricálcico (β-FTC). Por último, analizouse a capacidade de reparación das CMEs, cultivadas en soportes de Col, nun modelo de lesión de cartilaxe in vitro. Os resultados confirman a identidade das CMEs e a súa capacidade de formar neotecidos condroxénicos e osteoxénicos sobre biomateriais de Col. A presenza de proteoglicans (PGs) na composición dos soportes mellora o fenotipo condroxénico do tecido cartilaxinoso neoformado e a reparación de lesións na cartilaxe hialina, nun modelo in vitro. O uso dos constructos, formados polas CMEs e biomateriais de Col, resulta prometedor para a reparación de lesións osteocondrais., [Resumen]La artrosis (OA) es la patología reumática más prevalente y, actualmente, no existe un tratamiento efectivo. Una de las causas de la enfermedad es su desarrollo secundario tras una lesión en el cartílago hialino articular o en el hueso subcondral. La Ingeniería Tisular (IT) osteocondral, utilizando células y soportes, ha surgido como una terapia prometedora. El objetivo de este estudio fue determinar el potencial de reparación de las células mesenquimales estromales (CMEs), en combinación con diferentes tipos de soportes, para su uso en la IT osteocondral. En primer lugar, se aislaron y caracterizaron CMEs, obtenidas de médula ósea humana y ovina, y de células similares a CMEs (CSMEs), diferenciadas a partir de células pluripotentes inducidas (iPS). En segundo lugar, se estudió la capacidad de diferenciación condrogénica de las CMEs humanas, cultivadas en diferentes soportes de colágeno (Col). También, se testó la capacidad de diferenciación osteogénica de las CMEs ovinas, cultivadas sobre soportes de Col I y β fosfato tricálcico (β-FTC). Por último, se analizó la capacidad de reparación de las CMEs, cultivadas en soportes de Col, en un modelo de lesión de cartílago in vitro. Los resultados confirman la identidad de las CMEs y su capacidad de formar neotejidos condrogénicos y osteogénicos sobre biomateriales de Col. La presencia de proteoglicanos (PGs) en la composición de los soportes mejora el fenotipo del tejido cartilaginoso neoformado y la reparación de lesiones en el cartílago hialino, en un modelo in vitro. El uso de los constructos, formados por las CMEs y biomateriales de Col, resulta prometedor para la reparación de lesiones osteocondrales., [Abstract]Osteoarthritis (OA) is the most prevalent rheumatic disorder and currently, there is no effective treatment to treat it. Lesions in the articular hyaline cartilage or in the subchondral bone may lead secondarily to OA. Osteochondral Tissue Engineering (IT) using cells and scaffolds has emerged as a promising therapy. The aim of this study was to determine the repair potential of mesenchymal stromal cells (CMEs) combined with different types of scaffolds, and their usefulness in osteochondral IT. First, CMEs from human and ovine bone marrow and, from induced plutipotent stem cells (iPS) were isolated and characterized. Secondly, chondrogenic differentiation capacity of human CMEs on collagen (Col) scaffolds was studied. Also, osteogenic differentiation capacity of ovine CMEs on Col I and β tricalcium phosphate (β-FTC) was tested. Finally, the repair capacity of CMEs cultured on Col scaffolds in an in vitro cartilage lesion model was assessed. Results confirmed the CMEs identity and their capacity to form chondrogenic and osteogenic neotissues, when cultured on Col scaffolds. The addition of proteoglycans (PGs) to the scaffold composition improves the phenotype of neoformed cartilaginous tissue and the repair capacity in the in vitro hyaline cartilage lesion model. The use of CMEs and Col scaffolds for engineered tissue constructs is a promising approach for osteochondral lesions repair.

Objetivos. El objetivo de este estudio ha sido evaluar la idoneidad de diferentes biomateriales de colágeno como posibles soportes de ingeniería tisular, para el tratamiento de lesiones cartilaginosas. Metodología. Se aislaron células madre mesenquimales de la médula ósea humana (CMMs-MOh), de varios donantes, y se expandieron in vitro. Tras obtener un número suficiente de células, se formó un conjunto celular y se sembró sobre los biomateriales, con un medio de estimulación de la diferenciación condrogénica. Tras 30 días de estimulación se testó el crecimiento y diferenciación mediante microscopía electrónica, técnicas histológicas, técnicas inmunohistoquímicas y biología celular. Resultados. Todos los biomateriales presentaron crecimiento y proliferación celular. En todos los biomateriales tuvo lugar diferenciación condrogénica de las CMM-MOh, en mayor o menor medida. Conclusiones. Todos los biomateriales permitieron el crecimiento y proliferación de las CMMs-MOh, pero sólo en el biomaterial C1C2HS se observó formación de tejido con características similares a cartílago. Futuros estudios permitirán determinar si éste biomaterial es adecuado para la reparación de cartílago articular. Traballo fin de mestrado (UDC.FCS). Asistencia e investigación sanitaria. Especialidade en fundamentos de investigación biomédica. Curso 2011/2012

Programa Oficial de Doutoramento en Ciencias da Saúde. 5007V01 [Resumo] A rexeneración do óso e da cartilaxe tras sufrir un traumatismo ou unha enfermidade dexenerativa segue sendo un gran desafío clínico. Debido á súa capacidade de auto-renovación e multi-diferenciación, as células mesenquimais estromais (MSC) son unha fonte celular moi prometedora para a rexeneración destes tecidos, pero a investigación neste campo está limitada pola tendencia das MSC á senescencia ao seren expandidas en cultivo. A inmortalización das MSC permítelles superar a senescencia, o que supón un impulso para os avances na investigación. Neste estudo desenvolveuse un método para inmortalizar MSC derivadas de doantes de idade avanzada mediante inoculación centrífuga de dous xenes de inmortalización: o antíxeno T grande do virus de simio 40 (SV40LT) e a transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT). As MSC inmortalizadas son fenotipicamente similares ás MSC primarias e son capaces de diferenciarse cara ás tres liñaxes esqueléticas, aínda que se inclinan cara á ruta de diferenciación osteoxénica. Os condrocitos articulares e os sinoviocitos pódense inmortalizar empregando o mesmo método, pero os condrocitos inmortalizados son metabolicamente diferentes dos condrocitos articulares primarios. Estas células poden ser útiles como parte de modelos in vitro de rexeneración dos tecidos articulares ou de enfermidade osteocondral. [Resumen] La regeneración del hueso y el cartílago tras sufrir un traumatismo o una enfermedad degenerativa continúa siendo un gran desafío clínico. Debido a su capacidad de auto-renovación y multi-diferenciación, las células mesenquimales estromales (MSC) son una fuente celular prometedora para la regeneración de estos tejidos, pero la investigación en este campo se ve limitada por la tendencia de las MSC a la senescencia en cultivo. La inmortalización de las MSC les permite superar la senescencia, impulsando así los avances en la investigación. En este estudio, se ha desarrollado un método para inmortalizar MSC derivadas de donantes de edad avanzada mediante inoculación centrífuga de dos genes de inmortalización: el antígeno T grande del virus de simio 40 (SV40LT) y la transcriptasa reversa de la telomerasa humana (hTERT). Las MSC inmortalizadas son fenotípicamente similares a las MSC primarias y son capaces de diferenciarse hacia los tres linajes esqueléticos, aunque tienen tendencia a seguir la ruta de diferenciación osteogénica. Los condrocitos articulares y los sinoviocitos se pueden inmortalizar utilizando el mismo método, pero los condrocitos inmortalizados son metabólicamente diferentes de los condrocitos articulares primarios. Estas células pueden ser útiles como parte de modelos in vitro de regeneración de los tejidos articulares o de enfermedad osteocondral. [Abstract] Regeneration of bone and cartilage after trauma or age-related degenerative diseases remains a major clinical challenge. Due to their self-renewal and multi-differentiation potential, mesenchymal stromal cells (MSCs) are a promising cell source for bone and cartilage regeneration, but research on this field is impaired by MSCs’ predisposition to senescence when culture-expanded. Immortalization of MSCs allows them to bypass senescence, thus boosting the advances in MSC research. In this study, a method has been developed to immortalize MSCs derived from elderly donors by spinoculation of two immortalization genes: simian virus 40 large T antigen (SV40LT) and human telomerase reverse transcriptase (hTERT). Immortalized MSCs are phenotypically similar to primary MSCs and are able to differentiate to the three skeletal lineages, although their multi-differentiation potential is unbalanced towards the osteogenic pathway. Articular chondrocytes and synoviocytes can also be immortalized by the same method, but immortalized chondrocytes are metabolically different from primary articular chondrocytes. These immortalized cells can be useful as part of in vitro models of osteochondral regeneration and disease.