Search

[Engineering of Biomaterials 161 (2021) 2-7]

Introduction. Collagen is the main structural protein of the various connective tissues in mammals. Collagen, in the form of elongated fibrils, is mostly found in fibrous tissues such as tendons, ligaments and skin. The amino acid composition of collagen is unusual for proteins, mostly because of its high hydroxyproline content. Elastin is a protein which can be mostly found in connective tissues. It is elastic and allows many tissues in the body to resume their shape after stretching or contracting. The chemical composition of elastin is also unusual for proteins, because of desmosine and isodesmosine content. Cross-linking process of the materials was designed to improve its properties, like mechanical strength, porosity and susceptibility to degradation. Aim of the study. The aim of our study was to investigate the influence of dialdehyde starch (DS) and pectin (P) on the properties of collagen/elastin hydrogels. DS is a polysaccharide derived by chemical modification from natural starch. It is prepared by periodate oxidation of starch. Pectin is a complex polysaccharide consisting mainly of esterified D-galacturonic acid resides in an alpha-(1-4) chain. Materials and methods. Collagen was obtained from rat tail tendons. Elastin hydrolysates were isolated from porcine aorta. 1% solution of collagen in 0.1 M acetic acid and 1% solution of elastin hydrolysates in water were prepared. Mixtures of the proteins were prepared in different volume ratios (Coll 100 %; Coll 95%-El 5%; Coll 90 %-El 10%) and were then cross-linked with DS and P. After that, a dialysis against deionised water was performed. Obtained gels were then analysed. Results and conclusions. The FTIR spectra show that the collagen and elastin structure was not changed by cross-linking with dialdehyde starch or pectin. The mechanical properties of the collagen and elastin material cross-linked by DS were improved, while the use of pectin causes deterioration of these properties. The lyophilized gels exhibit porous structure. The various size is observed. The in vitro study demonstrates that the materials are attractive for cells. The addition of dialdehyde starch and pectin causes formation of cross-linking bonds in the collagen and elastin materials and the transparent, hydrogels are obtained. However, the gels containing DS are much stiffer than materials with P. The results show that DS is better cross-linking agent than P. Dialdehyde starch is a suitable cross-linking agent for protein materials for medicine and tissue engineering applications. Acknowledgments. The authors would like to thank the National Science Centre (NCN, Poland, Grant no: UMO-2011/03/D/ST8/04600) for providing financial support to this project.

Kolagen i elastyna są głównymi białkami strukturalnymi u ssaków. Zapewniają one mechaniczne wsparcie, wytrzymałość oraz elastyczność różnym organom oraz tkankom, m.in. skórze, ścięgnom, tętnicom oraz kościom. Białka te są łatwo dostępne, biodegradowalne, biokompatybilne oraz stymulują wzrost żywych komórek[1]. Materiały białkowe oparte na kolagenie i elastynie mogą być modyfikowane przez proces sieciowania w celu poprawienia ich właściwości, m.in. wytrzymałości mechanicznej, porowatości oraz podatności na degradację[2]. Skrobię dialdehydową uzyskuje się w wyniku selektywnego utleniania skrobi nadjodanem, w wyniku, czego rozszczepia się wiązanie C2-C3 łańcucha polisacharydowego skrobi z wytworzeniem dwóch grup aldehydowych. Skrobia dialdehydowa ulega biodegradacji oraz wykazuje działanie przeciwwirusowe[3][4]. Pektyna jest polisacharydem składającym się głównie z reszt kwasu D-galakturonowego, zestryfikowanych grupami metylowymi[5]. Analiza termogramów ze skaningowej kalorymetrii różnicowej wykazuje, że materiały białkowe ulegają przemianom termicznym w dwóch endotermicznych etapach. Badanie odpowiedzi komórkowej otrzymanych hydrożeli dowodzi, że materiały te są atrakcyjne dla fibroblastów mysich 3T3. Analiza obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej wykazuje, że rozmiar porów jest zróżnicowany, a ich rozmiar zależy zarówno od dodatku hydrolizatów elastyny, jak i ilości i rodzaju czynnika sieciującego. Sieciowanie otrzymanych hydrożeli przy użyciu skrobi dialdehydowej powoduje zwiększenie sztywności żelu. Próbki zawierające pektynę charakteryzują się natomiast mniejszą odpornością na ściskanie. Dodatek polisacharydów wpływa na wartości wyznaczonych składowych polarnych swobodnej energii powierzchniowej dla materiałów kolagenowych i kolagenowo-elastynowych bez i z ich dodatkiem. Efekt ten jest bardziej widoczny w przypadku hydrożeli zawierających pektynę. Autorzy pragną podziękować Narodowemu Centrum Nauki (NCN, Polska, Grant nr: UMO-2011/03/D/ST8/04600) za zapewnienie wsparcia finansowego na realizację tego projektu. [1]. J. Skopinska-Wisniewska, K. Wegrzynowska-Drzymalska, A. Bajek, M. Maj, A. Sionkowska Journal of Materials Science: Materials in Medicine 2016, 27, 1-10; [2]. J. Skopinska-Wiśniewska, J. Kuderko, A. Bajek, M. Maj, A. Sionkowska, M. Ziegler-Borowska Materials Science and Engineering: C 2016, 60, 100-108; [3]. L. Song, C. Cruz, S. R. Farrah, R. H. Baney Electronic Journal of Biotechnology 2009, 12, 1-5; [4]. F. Langmaier, M. Mladek, P. Mokrejs Journal of Thermal Analysis and Calorimetry 2008, 98, 807-812; [5]. A. G. J. Voragen, G.-J. Coenen, R. P. Verhoef, H. A. Schols Structural Chemistry 2009, 20, 263-275.

Głównym zadaniem inżynierii tkankowej jest stworzenie materiału, który mógłby znaleźć zastosowanie, jako zamiennik uszkodzonej tkanki, bądź narządu oraz wspomóc jego regenerację. Materiały te, zwane skafoldami zbudowane są przede wszystkim z naturalnych biopolimerów m.in. z kolagenu i elastyny. W celu poprawienia ich właściwości chemicznych oraz mechanicznych hydrożele mogą być modyfikowane przez proces sieciowania. Mimo, iż do tej pory zostało zastosowanych wiele czynników sieciujących, wciąż poszukiwane są bardziej bezpieczne związki. Zliofilizowane hydrożele wykazują porowatą strukturę. Analiza obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej dowodzi, że ich rozmiar jest zróżnicowany i zależy zarówno od dodatku hydrolizatów elastyny, jak i ilości i rodzaju czynnika sieciującego. Analiza termogramów ze skaningowej kalorymetrii różnicowej wykazuje, że przemiana cieplna badanych materiałów przebiega w dwóch etapach. Sieciowanie skrobią dialdehydową prowadzi do zwiększenia sztywności żeli, natomiast próbki zawierające pektynę są mniej odporne na ściskanie. Badanie odpowiedzi komórkowej dla otrzymanych hydrożeli wykazuje, że materiały te są atrakcyjne zarówno dla fibroblastów mysich 3T3 i mezenchymalnych komórek macierzystych.

Zadaniem inżynierii tkankowej jest stworzenie optymalnego materiału o odpowiednich właściwościach, który mógłby służyć jako zamiennik uszkodzonej tkanki, bądź narządu i wspomóc jej regenerację. Skafoldy opierają się przede wszystkim na naturalnych polimerach, w szczególności na kolagenie i elastynie, które występują w strukturze macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [1]. Włókna kolagenowe oraz ich sieci tworzą ECM dla większości tkanek miękkich i twardych tj. kości, chrząstek, ścięgien oraz skóry w organizmie człowieka [2]. Kolagen występuje w odmiennych strukturach morfologicznych w różnych tkankach [3,4]. Wszystkie typy kolagenów wykazują charakterystyczną strukturę potrójnej helisy. Wyróżnić wśród nich możemy kolageny fibrylarne i niefibrylarne [5,6]. Sekwencja aminokwasowa kolagenu układa się w charakterystyczny tryplet -Gly-X-Y- . Obecność glicyny w każdej trzeciej pozycji aminokwasowej jest niezbędna w celu umożliwienia szczelnego upakowanie trzech α łańcuchów w cząsteczce tropokolagenu, natomiast pozycje X i Y są w większości zajęte przez prolinę i 4-hydroksyprolinę [5]. Elastyna jest wysoce usieciowanym, nierozpuszczalnym biopolimerem, składającym się z kowalencyjnie związanych cząsteczek tropoelastyny. Posiada niezwykły skład aminokwasowy, bo aż 75% jej zawartości stanowią aminokwasy hydrofobowe: glicyna, walina i alanina [7,8]. W procesie tworzenia wiązania sieciującego w elastynie uczestniczą dwa łańcuchy tropoelastyny, między którymi z reszt lizyny pod wpływem działania oksydazy lizylowej powstaną wiązania desmozyny, bądź izodesmozyny [9]. Materiały białkowe sieciuje się, w celu poprawienia ich właściwości fizycznych, chemicznych, mechanicznych oraz odporności na degradację [10]. Skrobia dialdehydowa stanowi polimeryczny dialdehyd wytwarzany na skutek selektywnego utleniania skrobi nadjodanem, który rozszczepia wiązanie C2-C3 łańcucha polisacharydowego skrobi z wytworzeniem dwóch grup aldehydowych [11]. Pektyna jest polisacharydem składającym się głównie z reszt kwasu D-galakturonowego, zestryfikowanych grupami metylowymi [12]. Celem pracy było określenie efektywności sieciowania materiałów kolagenowych oraz kolagenowo-elastynowych przy użyciu skrobi dialdehydowej oraz pektyny, porównanie otrzymanych wyników sieciowania materiału białkowego skrobią dialdehydową z wynikami uzyskanymi dla materiałów sieciowanych pektyną oraz uzyskanie materiałów dla zastosowań w inżynierii tkankowej. Kolagen został otrzymany ze ścięgien szczurzych ogonów. Hydrolizaty elastyny zostały otrzymane poprzez izolację ze świńskich aort. Otrzymany liofilizat kolagenu rozpuszczono w 0,1M kwasie octowym i otrzymano 1% roztwór kolagenu, natomiast sproszkowany liofilizat hydrolizatów elastyny rozpuszczono w wodzie destylowanej i otrzymano 1% roztwór elastyny. Mieszaniny kolagenowo-elastynowe składały się objętościowo z 95% kolagenu i 5% elastyny oraz 90% kolagenu i 10% elastyny. Tak otrzymane mieszaniny sieciowano przy użyciu skrobi dialdehydowej oraz pektyny przez dodatek odpowiedniej ilości danego czynnika sieciującego (5% oraz 10% dodatek objętościowy). Dializa otrzymanych układów była przeprowadzona względem wody dejonizowanej i trwała 7 dni. Otrzymane żele zostały poddane odpowiednim analizom. Zliofilizowane hydrożele wykazują porowatą strukturę, co potwierdzają obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego. Wielkość porów jest niejednorodna. Analiza obrazów SEM dowodzi, że ich rozmiar jest zróżnicowany i zależy zarówno od dodatku hydrolizatów elastyny, jak i ilości i rodzaju czynnika sieciującego. Wyższa zawartość hydrolizatów elastyny powoduje spadek wartości modułu sprężystości otrzymanych żeli. Sieciowania skrobią dialdehydową prowadzi do zwiększenia sztywności żeli, podczas gdy próbki zawierające pektynę są mniej odporne na ściskanie. Badanie odpowiedzi komórkowej dla otrzymanych hydrożeli dowodzi, iż materiał ten jest atrakcyjny dla fibroblastów mysich 3T3. W przypadku serii próbek z 5% i 10% dodatkiem hydrolizatów elastyny, sieciowanie tego materiału skrobią dialdehydową korzystnie wpływa na wzrost przeżywalności komórek 3T3. Dodatek skrobi dialdehydowej i pektyny powoduje tworzenie się wiązań sieciujących w otrzymanym materiale. Jednakże żele zawierające skrobię dialdehydową są znacznie bardziej sztywne niż materiały sieciowane pektyną. Wyniki te ukazują, że skrobia dialdehydowa jest lepszym środkiem sieciującym niż pektyna. Skrobia dialdehydowa może znaleźć zastosowanie, jako środek sieciujący dla materiałów białkowych stosowanych w medycynie i inżynierii tkankowej. Autorzy pragną podziękować Narodowemu Centrum Nauki (NCN, Polska, Grant nr: UMO-2011/03/D/ST8/04600) za zapewnienie wsparcia finansowego na realizację tego projektu. Literatura: [1] M. Martowicz, J. Laska (2010) Biomateriały polimerowe w regeneracji ubytków skóry, Inżynieria Biomateriałów 13 (95):2-6, [2] A. Kuzan, A. Chwiłkowska (2011) Różnorodność i funkcje kolagenu w tętnicach, Polski Merkuriusz Lekarski 31(182):111-112, [3] S. A. Sell, P. S. Wolfe, K. Garg, J. M. McCool, I. A. Rodriguez, G. L. Bowlin (2010) The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues, Polymers 2:524, 527, [4] R. Parenteau-Bareil, R. Gauvin, F. Berthod (2010) Collagen – Based Biomaterials for Tissue Engineering Applications, Materials 3:1864-1869, [5] K. A. Czubak, H. M. Żbikowska (2014) Structure, function and biomedical significance of collagens, Annales Academiae Medicae Silesiensis 68(4):246-253, [6] W. Friess (1998) Collagen – biomaterial for drug delivery, European Journal of Pharmaceutices and Biopharmaceutics 45(2):114-116, [7] W. F. Daamen, J. H. Veerkamp, J. C. M. van Hest, T. H. van Kuppevelt (2007) Elastin as a biomaterial for tissue engineering, Biomaterials 28(30):4379-4386, [8] S. M. Mithieux, J. E. J. Rasko, A. S. Weiss (2004) Synthetic elastin hydrogels derived from massive elastic assemblies of self-organized human protein monomers, Biomaterials 25(20):4921-4922, [9] N. Annabi, S. M. Mithieux, G. Camci-Unal, M. R. Dokmeci, A. S. Weiss, A. Khademhosseini (2013) Elastomeric recombinant protein-based biomaterials, Biochemical Engineering Journal 77:111-114, [10] W. Dzierża, T. Czerniawski (2000) Właściwości mechaniczne i termiczne polimerów. Skrypt dla studentów chemii, wyd. Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń, [11] L. Song, C. Cruz, S. R. Farrah, R. H. Baney (2009) Novel antiviral activity of dialdehyde starch, Electronic Journal of Biotechnology 12(2):1-2, [12] A. G. J. Voragen, G.-J. Coenen, R. P. Verhoef, H. A. Schols (2009) Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls, Structural Chemistry 20(2):263, 264, 267.

The influence of UV-light with the wavelength 254 nm on the hair properties was detected. Hair was also treated by the Polyquaternium-7 which is commonly used in cosmetic preparations as conditioning agent. Mechanical properties were measured and the surface of hair was examined by atomic force microscope.