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The standard-of-care treatment of T-cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) with chemotherapy usually achieves reasonable rates of initial complete response. However, patients who relapse or do not respond to conventional therapy show dismal outcomes, with cure rates below 10% and limited therapeutic options. To ameliorate the clinical management of these patients, it is urgent to identify biomarkers able to predict their outcomes. In this work, we investigate whether NRF2 activation constitutes a biomarker with prognostic value in T-ALL. Using transcriptomic, genomic, and clinical data, we found that T-ALL patients with high NFE2L2 levels had shorter overall survival. Our results demonstrate that the PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in the oncogenic signalling induced by NRF2 in T-ALL. Furthermore, T-ALL patients with high NFE2L2 levels displayed genetic programs of drug resistance that may be provided by NRF2-induced biosynthesis of glutathione. Altogether, our results indicate that high levels of NFE2L2 may be a predictive biomarker of poor treatment response in T-ALL patients, which would explain the poor prognosis associated with these patients. This enhanced understanding of NRF2 biology in T-ALL may allow a more refined stratification of patients and the proposal of targeted therapies, with the ultimate goal of improving the outcome of relapsed/refractory T-ALL patients.

Sí

Table S5. Complete list of genetic variants for TP53 gene determined by targeted deep sequencing in the T-LBL samples. (PDF 96 kb)

Table S3. Differential expression of mRNA between tumours and controls in the exploratory cohort by RNA-Seq. (PDF 77 kb)

Figure S1. Gaussian Kernel Density plot of miRGate Agreement Score of the miRNAs identified associated with the CDKN1C, E2F1 and TP53 genes. (PDF 283 kb)

Table S7. Validation analysis by qRT-PCR of those miRNA significantly deregulated according with RNA-Seq analysis in the exploratory and extended cohort of T-LBL samples. (PDF 81 kb)

Figure S2. Gaussian Kernel Density Plot of the red counts for the miRNAs deregulated in any sample. (PDF 1208 kb)

Table S1. Characterization of the human sample collection in the exploratory cohort. Lymphomas were diagnosed (see Characterization column) according to World Health Organization Classification of Hematological Malignancies and recommendations from the European. (PDF 205 kb)

Table S4. Relative expression of CDKN1C, E2F1 and TP53 analyzed by qrtRT-PCR. (PDF 88 kb)

Table S2. Description of primers used in qRT-PCR, Targeted gene deep sequencing, Sanger sequencing and Methylation-Specific PCR. (PDF 95 kb)

Table S6. MicroRNA regulation of CDKN1C, E2F1 and TP53 genes in T-TLBLs of the exploratory cohort by RNA-Seq. (PDF 78 kb)

Pharmacological activation of cannabinoid receptors elicits antitumoral responses in different models of cancer. However, the biological role of these receptors in tumor physio-pathology is still unknown. We analyzed CB2 cannabinoid receptor protein expression in two series of 166 and 483 breast tumor samples operated in the University Hospitals of Kiel, Tübingen and Freiburg between 1997 and 2010. CB2 mRNA expression was also analyzed in previously published DNA microarray datasets. The role of CB2 in oncogenesis was studied by generating a mouse line that expresses the HER2 rat ortholog (neu) and lacks CB2, and by a variety of biochemical and cell biology approaches in human breast cancer cells in culture and in vivo, upon modulation of CB2 expression by si/shRNAs and overexpression plasmids. CB2-HER2 molecular interaction was studied by co-localization, coimmunoprecipitation and proximity ligation assays. We show an association between elevated CB2 expression in HER2+ breast tumors and poor patient prognosis. We also demonstrate that genetic inactivation of CB2 impairs tumor generation and progression in MMTV-neu mice. Moreover, we show that HER2 upregulates CB2 expression by activating the transcription factor ELK1 via the ERK cascade, and that an increased CB2 expression activates the HER2 prooncogenic signaling machinery at the level of the tyrosine kinase c-SRC. Finally, HER2 and CB2 form heteromers in cancer cells. Our findings reveal an unprecedented role of CB2 as a pivotal regulator of HER2 pro-oncogenic signaling in breast cancer, and suggest that CB2 may be a biomarker with prognostic value in these tumors.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura 11-01-2007

FBXW7 is a driver gene in T-cell lymphoblastic neoplasia acting through proteasome degradation of key proto-oncogenes. FBXW7 encodes three isoforms, α, β and γ, which differ only in the N-terminus. In this work, massive sequencing revealed significant downregulation of FBXW7 in a panel of primary T-cell lymphoblastic lymphomas characterised by the absence of mutations in its sequence. We observed that decreased expression mainly affected the FBXW7β isoform and to a lesser extent FBXW7α and may be attributed to the combined effect of epigenetic changes, alteration of upstream factors and upregulation of miRNAs. Transient transfections with miRNA mimics in selected cell lines resulted in a significant decrease of total FBXW7 expression and its different isoforms separately, with the consequent increment of critical substrates and the stimulation of cell proliferation. Transient inhibition of endogenous miRNAs in a T-cell lymphoblastic-derived cell line (SUP-T1) was capable of reversing these proliferative effects. Finally, we show how FBXW7 isoforms display different roles within the cell. Simultaneous downregulation of the α and γ isoforms modulates the amount of CCNE1, whilst the β-isoform alone was found to have a prominent role in modulating the amount of c-MYC. Our data also revealed that downregulation of all isoforms is a sine qua non condition to induce a proliferative pattern in our cell model system. Taking these data into account, potential new treatments to reverse downregulation of all or a specific FBXW7 isoform may be an effective strategy to counteract the proliferative capacity of these tumour cells., Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (SAF2015-70561-R; MINECO/FEDER, EU; BES-2013-065740); the Autonomous Community of Madrid, Spain (B2017/BMD-3778; LINFOMAS-CM); the Spanish Association against Cancer (AECC, 2018; PROYE18054PIRI) and the Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (ACCI-CIBERER-17). Institutional grants from the Fundación Ramón Areces and Banco de Santander to the CBMSO are also acknowledged.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 22-09-2022, Las neoplasias linfoblásticas de células T son enfermedades hematológicas agresivas que derivan de linfoblastos comprometidos con el linaje de células T que se desarrollan principalmente en niños. Esta enfermedad afecta a la médula ósea y a la sangre (T-ALL) aunque también puede aparecer como una masa tumoral en el timo/mediastino o en los nódulos linfáticos (T-LBL). La toxicidad asociada a los tratamientos actuales y el mal pronóstico en caso de recaída, con tasas de supervivencia inferiores al 10%, ponen de manifiesto la necesidad de nuevas terapias personalizadas que resulten más eficaces y generen menos efectos adversos. La vía de STAT5 es la segunda vía de señalización más frecuentemente desregulada en las TALL/LBL solamente por detrás de la vía de NOTCH. En este sentido, un alto número de pacientes muestra la fosforilación sostenida y consiguiente activación constitutiva de STAT5, que se transloca al núcleo, donde actúa como un factor de transcripción y promueve el desarrollo tumoral. Lamentablemente, todavía no existe un tratamiento específico para aquellos pacientes diagnosticados con T-ALL/LBL que presentan desregulada la vía de STAT5. Por un lado, porque la inhibición de STAT5 resulta complicada en términos de eficacia y especificidad. Por otro lado, porque las alteraciones que promueven la fosforilación sostenida de STAT5 afectan a múltiples genes, pueden aparecer de forma simultánea y no han sido caracterizadas en su totalidad, complicando la implementación de nuevas terapias. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral es la caracterización de las bases moleculares subyacentes a las neoplasias linfoblásticas de células T, para identificar potenciales dianas terapéuticas que permitan el desarrollo de nuevos tratamientos personalizados dirigidos a aquellos pacientes diagnosticados con T-ALL/LBL que presenten una activación constitutiva de STAT5. La primera parte del trabajo ha consistido en la identificación y caracterización funcional de alteraciones susceptibles de contribuir a la fosforilación sostenida de STAT5 en los pacientes con neoplasias linfoblásticas de células T, entre las que se encuentran: la fusión SEPTIN6-ABL2, la hipermetilación de la isla CpG asociada con el inicio de la transcripción de SOCS3 y diferentes mutaciones puntuales que afectan a los genes JAK1, JAK3 y el propio STAT5. En base a los resultados obtenidos, la segunda parte del trabajo se ha enfocado en el estudio de los mecanismos moleculares por los que una fosforilación sostenida de STAT5 promueve el desarrollo tumoral en los pacientes con T-ALL/LBL. En este sentido, nuestros resultados demuestran que la activación constitutiva de STAT5 induce un perfil de expresión génica alterado con niveles de tránscritos aberrantes para múltiples genes. Entre ellos, la sobreexpresión de PIM1 tiene un efecto directo en la señalización relativa a c-MYC y mTOR, resultando fundamental para la proliferación y viabilidad de aquellas células que presentan mutaciones oncogénicas en la vía de STAT5. Por lo tanto, PIM1 se postula como una diana terapéutica para la implementación de nuevos tratamientos dirigidos a aquellos pacientes diagnosticados con T-ALL/LBL que muestren una activación constitutiva de STAT5 causada por la presencia de diferentes alteraciones en su vía de señalización, Para el desarrollo de la tesis se ha contado con financiación procedente de los siguientes proyectos:SAF2015-70561-R. Proyecto de investigación del Ministerio de Economía y Competitividad. IPs: Prof. José Fernández-Piqueras y Dra. María Villa Morales. RTI2018093330-B-I00. Proyecto de investigación del Ministerio de Ciencia e Innovación. IPs: Prof. José Fernández-Piqueras y Prof. Javier Santos Hernández. AECC-PROYECT18054PIRI. Proyecto de investigación de la Asociación Española Contra el Cáncer. IP: Prof. José Fernández-Piqueras

Tesis doctoral inédita leida en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-02-2019, Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 15-08-2021, T-cell lymphoblastic neoplasms are aggressive haematological malignancies which mainly develop in children but can also affect adults. The molecular basis of T-cell lymphoblastic lymphoma is not fully understood. In consequence, there is a lack of robust and reliable prognostic markers, thus hindering the achievement of better results in the clinic. The role of FADD in cancer is controversial, probably due to its dual role in apoptosis and other non-apoptotic functions such as proliferation and cell cycle control. Moreover, it seems that these non-canonical functions depend on FADD phosphorylation and subcellular location. Despite FADD having a relevant role in T cells, alterations affecting its expression and phosphorylation are not completely unveiled in haematological cancers. In the present work, we show that T-cell lymphoblastic lymphoma cells exhibit a significant reduction of FADD, both in mouse and human. The proteomic approach indicates that FADD reduction in tumour T cells impacts on mitochondrial processes as well as in the regulation of messenger RNA processing and maturation. However, apoptosis impairment due to FADD reduction is probably the main FADD-mediated oncogenic event in T-LBL tumour cells. Nevertheless, the phosphorylation status of the remaining FADD protein is capable of shaping its non-apoptotic functions. Phosphorylated FADD is significantly reduced as well in T-cell lymphoblastic lymphoma. Even though, phosphorylated FADD is more stable and more prone to be nuclear. There, it would be prevented from participating in death receptorsmediated apoptosis and it would favour tumour cell proliferation. Interestingly, we have determined that the level of FADD phosphorylation can provide the basis for patient stratification. Higher levels of phosphorylated FADD in the tumour significantly correlate with shorter survival times in mice and with worse clinical prognosis in human patients. This supports that FADD phosphorylation status may serve as a predictor for aggressiveness and tumour outcome. In summary, we propose FADD phosphorylation as a new biomarker with prognostic value in T-cell lymphoblastic lymphoma., Las neoplasias linfoblásticas de células T son neoplasias hematológicas agresivas que se desarrollan principalmente en niños pero también pueden afectar a adultos. La base molecular del linfoma linfoblástico de células T no es del todo conocida. Por ello, carecemos de marcadores de pronóstico robustos y fiables, lo cual impide alcanzar mejores resultados en la clínica. El papel de FADD en cáncer es controvertido, probablemente debido a su función dual en la apoptosis y en funciones no apoptóticas como la proliferación o el control del ciclo celular. Además, parece que estas funciones no canónicas dependen de la fosforilación y la localización subcelular de FADD. Aunque FADD tiene un papel importante en las células T, las alteraciones que afectan a su expresión y su fosforilación no se han desvelado completamente en los tumores hematológicos. En este trabajo, mostramos que los linfomas linfoblásticos de células T presentan una reducción significativa de FADD, tanto en tumores humanos como de ratón. Nuestra aproximación proteómica indica que la reducción de FADD en células T tumorales tiene impacto sobre procesos mitocondriales, así como sobre la regulación del procesamiento y la maduración del ARN mensajero. Sin embargo, la disfunción de la apoptosis es probablemente el principal evento oncogénico mediado por FADD en la célula tumoral. Por otro lado, el estatus de fosforilación de la proteína FADD que queda en la célula tumoral es capaz de modular sus funciones no apoptóticas. Encontramos que la forma fosforilada de FADD también está significativamente reducida en el linfoma linfoblástico de células T. Aunque, la forma fosforilada es más estable y con mayor tendencia a localizarse en el núcleo, donde quedaría apartada de su participación en la apoptosis mediada por receptores de muerte y además favorecería la proliferación de la célula tumoral. Observamos con gran interés que el nivel de fosforilación de FADD sirve de base para la estratificación de los pacientes de linfoma linfoblástico de células T. Los niveles más altos de FADD fosforilado en el tumor se relacionan con tiempos de supervivencia significativamente más cortos en ratones y con peor pronóstico clínico en el ser humano. Estos hechos apoyan que el estatus de fosforilación de FADD puede servir para predecir la agresividad y la resolución del tumor. En resumen, proponemos la fosforilación de FADD como un nuevo biomarcador con valor pronóstico en el linfoma linfoblástico de células T., This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (SAF2012-36566 and SAF2015-70561 MINECO/FEDER, UE; BES-2013- 065740), the Autonomous Community of Madrid, Spain (Oncocycle S2011/BMD-2470 and B2017/BMD-3778; LINFOMAS-CM), the Spanish Association Against Cancer (AECC, 2018; PROYE1805PIRI) and the Carlos III Health Instutite (ISCIII) (ACCI-CIBERER-17). Institutional grants from the Fundación Ramón Areces and Banco de Santander to the CBMSO are also acknowledged.

Tesis doctoral inédita de la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 1-07-2011