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Resumo Objetivo Investigar as evidências de validade da Depression, Anxiety and Stress Scale (DASS-21) para análise da prevalência de sintomas de depressão, ansiedade e estresse em uma amostra de trabalhadores de enfermagem brasileiros. Métodos Estudo transversal, com amostragem não-probabilística. Participaram do estudo 4053 trabalhadores de enfermagem brasileiros. As propriedades psicométricas da DASS-21 foram avaliadas por meio de análise da validade baseada na estrutura interna (validade de construto fatorial, convergente e discriminante; invariância do modelo fatorial; confiabilidade); validade baseada nas relações com medidas externas (validade convergente positiva e negativa dos fatores depressão, ansiedade e estresse com os construtos prejuízo emocional, satisfação no trabalho e variáveis individuais e ocupacionais); validade baseada no padrão de resposta aos itens do instrumento (análise da função diferencial dos itens em subgrupos distintos). A confiabilidade dos dados foi atestada por meio da estimação do coeficiente alfa ordinal e da confiabilidade composta. A prevalência de sintomas de depressão, ansiedade e estresse foi estimada a partir das recomendações dos autores originais da DASS-21. Resultados Durante a validação da estrutura interna, a análise fatorial confirmatória revelou que o modelo original da DASS-21 apresentou ajustamento adequado para a amostra e foi atestada a invariância de medida forte do modelo entre grupos distintos. A análise baseada em medidas externas mostrou que os fatores depressão, ansiedade e estresse apresentaram correlações positivas e moderadas-fortes com o domínio prejuízo emocional e correlações negativas e moderadas com o construto satisfação no trabalho. A análise do padrão de repostas aos itens comprovou a uniformidade e a estabilidade do instrumento para a amostra. Quanto aos sintomas, destaca-se a alta prevalência de níveis extremamente graves de depressão, ansiedade e estresse entre os participantes. Conclusão A DASS-21 apresentou adequada validade e confiabilidade para a avaliação de sintomas de depressão, ansiedade e estresse entre trabalhadores de enfermagem brasileiros.