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With the aim of isolating Leptospira spp., blood serum, kidney, liver and genital tract of 137 female swine (40 sows and 97 gilts) and also urine samples from 22 sows were collected in a slaughterhouse in the State of São Paulo, from April 2003 to August 2004. Four isolates were obtained from animals that presented microagglutination test (MAT) titers > 100 for the serovar Pomona and one was obtained from an animal negative by MAT in which Leptospira was isolated from the liver and reproductive tract. The presence of leptospiral DNA was investigated by PCR, and positive results were found in kidneys of 11 females, liver of two, genital tract of two and urine of one of them. Nephrosis, interstitial multifocal nephritis, moderate to severe changing, hyalines cylinders and hemorrhagic focuses, hepatic and uterine horns congestion were histological lesions observed in higher frequency in animals positive for leptospira. The silver impregnation (Warthin Starry) confirmed the presence of spirochetes in renal tubules of four females with positive leptospira cultures from kidneys. The serogroup of the five isolates was identified as Pomona by cross agglutination with reference polyclonal antibodies. Molecular characterization of the isolates was carried out by variable-number tandem-repeats analysis. All the isolates revealed a pattern distinct from the L. interrogans Pomona type strain, but identical to a previously identified pattern from strains isolated in Argentina belonging to serovar Pomona.Amostras de soro sanguíneo, rim, fígado e trato genital de 137 fêmeas suínas (40 matrizes e 97 marrãs) e de urina de 22 matrizes foram colhidas em abatedouro no Estado de São Paulo, no período de abril de 2003 a agosto de 2004 tendo como objetivo o isolamento de Leptospira spp. Quatro estirpes foram isoladas de animais que apresentaram títulos, no teste de soroaglutinação microscópica (SAM) > 100, para o sorovar Pomona e de um animal, não reagente na SAM, em que houve isolamento de leptospiras do fígado e aparelho reprodutor. A presença do DNA de leptospira foi investigada pela técnica da PCR e foram observados resultados positivos nos rins de 11 fêmeas, no fígado de duas, no aparelho reprodutor de duas e na urina de uma delas. Nefrose, nefrite intersticial multifocal variando de moderada a severa, cilindros hialinos e focos hemorrágicos, congestão hepática e de cornos uterinos foram lesões histológicas evidenciadas com freqüência mais alta em animais positivos para leptospira. A impregnação argêntica (Warthin Starry) confirmou a presença de espiroquetas nos túbulos renais das quatro fêmeas onde houve cultura positiva para leptospiras dos rins. O sorogrupo dos cinco isolados foi identificado como Pomona pela técnica de aglutinação cruzada com anticorpos policlonais de referência. A caracterização molecular dos isolados foi realizada pela análise do número variável de repetições em tandem (VNTR). Os mesmos revelaram um padrão distinto da estirpe padrão de L. interrogans sorovar Pomona, porém idêntico a um padrão previamente identificado em estirpes isoladas na Argentina, pertencentes ao sorovar Pomona.

Two hybridomas secreting monoclonal antibodies (MAbs) that react with a lipoprotein (LipL32) of the outer membrane of pathogenic Leptospira were obtained. For hybridoma production, spleen cells from BALB/c mice imunized with recombinant LipL32 (rLipL32) were fused to SP2/O-Ag14 cells, selected in HAT medium and screened in an indirect ELISA. One MAb produced was of the IgG2b isotype and the other was an IgM. MAbs specificity was confirmed by indirect ELISA and immunoblotting using purified rLipL32 and whole-cell antigen preparations from Escherichia coli (E. coli) expressing LipL32 and from pathogenic and non-pathogenic serovars. Both Mabs reacted with most of the pathogenic serovars tested and none reacted with non-pathogenic Leptospira. The MAbs described have potential for use in diagnostic tests for leptospirosis.Foram obtidos dois hibridomas secretores de anticorpos monoclonais (MAbs) que reagem com uma lipoproteína (LipL32) da membrana externa de leptospiras patogênicas. Para a produção dos hibridomas, células do baço de camundongos BALB/c, imunizados com LipL32 recombinante (rLipL32), foram fusionadas com células SP2/O-Ag14, selecionadas em meio HAT e testadas em ELISA indireto. Um dos MAbs secretados pelos hibridomas é do isotipo IgG2b e o outro do isotipo IgM. A especificidade dos MAbs foi confirmada em ELISA indireto e immunoblotting usando rLipL32 purificada, Escherichia coli (E. coli) expressando LipL32 e sorovares patogênicos e saprófitas. Os dois MAbs reagiram com a maioria dos sorovares patogênicos e não reagiram com sorovares saprófitas. Os MAbs possuem potencial para uso em testes de diagnóstico de leptospirose.

Growth characteristics and plasmid yields of Escherichia coli JM109 transformed with pCB01, a plasmid that encodes genes for the fimbrial adhesin of E. coli K88ab and for ampicillin resistance, grown in two culture media in agitated flasks and in fermentor, are reported. The rate of plasmid loss during growth was estimated by the differential counts in media with and without ampicillin. Plasmid yields of cultures grown in flasks varied from 0.9 to 67 µg/ml of medium, while those grown in fermentor attained 62 µg/ml of medium after 8 hours of culture. Plasmid bearing cells were outgrown by plasmid free cells in proportions varying from 5 to 1.2 non-transformed for each transformed cell during growth. Generation times of total population and plasmid bearing cells were 33 and 61 minutes, and 36 and 121 minutes, for fermentor and flask grown cultures, respectively. The same culture grown in fermentor and in flasks produced 62 and 33 µg of plasmid DNA per ml of medium, respectively. Bacterial concentrations and plasmid yields were higher in BHI than in LB medium. Yields of plasmid DNA obtained from the same batch were 1,7 times higher with cesium chloride-ethidium bromide gradients than with commercial columns.Comunicam-se algumas características de cultivo e a produção de plasmídios por Escherichia coli JM109 transformada com pCB01, um plasmídio que codifica os genes da adesina fimbrial de E. coli K88ab e de resistência à ampicilina. A cepa foi cultivada em Infuso de Cérebro e Coração (BHI) e em caldo de Luria (LB), em Erlenmeyers agitados e em fermentador de bancada. A taxa de perda de plasmídios foi estimada pela diferença de contagens em meio com e sem ampicilina. Os rendimentos de plasmídios das culturas em Erlenmeyer variaram de 0,9 a 67 µg/ml de meio, entanto as cultivadas em fermentador alcançaram 62 µg/ml após 8 horas de cultivo. Células sem plasmídio superaram às transformadas de 5 a 1,2 vezes durante o cultivo. Os tempos de geração da população total e das células transformadas foram 33 e 61 minutos no fermentador, e 36 e 121 minutos em Erlenmeyers, respectivamente. O mesmo inoculo produziu 62 e 33 µg de plasmídio por ml de meio no fermentador e em Erlenmeyers, respectivamente. As concentrações de bactérias e o rendimento de plasmídios foram superiores em BHI que em LB. O rendimento de plasmídios obtidos do mesmo cultivo foram 1,7 vezes maiores quando a purificação foi feita pelo método de ultracentrifugação em gradientes de césio-brometo de etídio do que com colunas comerciais.

Mycoplasmal pneumoniae is the main respiratory disease in swine. The most efficient way to control it is through the use of vaccines (bacterins), whose production cost is high. The objective of this work was to develop a new alternative for controlling Swine Mycoplasmal Pneumoniae, based on a recombinant subunit vaccine containing the R1 region of P97 adhesin of Mycoplasma hyopneumoniae fused to the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (rLTB-R1). In this work we report the amplification of the genes, genetic fusion between LTB and R1 coding sequences, cloning, construction of the expression vector, as well as expression and purification of rLTB-R1 in E. coli.A Pneumonia Micoplásmica é a doença respiratória mais importante dos suínos. A forma mais eficaz de controlá-la é mediante a utilização de vacinas (bacterinas), cujo custo de produção é elevado. Uma nova alternativa para o controle desta doença, baseada em uma vacina de subunidade recombinante contendo a região R1 da adesina P97 de Mycoplasma hyopneumoniae fusionada a subunidade B da enterotoxina termolábel de Escherichia coli (rLTB-R1), foi o alvo deste trabalho. Nele abordou-se a amplificação dos genes, a fusão genética entre as seqüências codificadoras para LTB e R1, a clonagem, a construção do vetor de expressão, assim como a expressão em E. coli e purificação da rLTBR1.

The neonatal diarrhea in swine caused by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is responsible for high mortality and low growth rate in pigs and it is mainly dependent on the capacity of E. coli to attach to the surface of the small intestine, a property mediated by fimbria. In this study the faeC gene, which codes for the minor fimbrial subunit of E. coli K88ab, was cloned in the eukaryotic expression vector pcDNA3, associated or not to the Kozak sequence. Plasmid DNA of the two versions of the vaccine candidate was inoculated in mice by the intramuscular route, in two doses, at 0 and 21 days. The animals that received the DNA vaccine containing faeC associated to the Kozak sequence presented seroconversion significantly higher (PA diarréia neonatal em suínos causada por Escherichia coli produtora de enterotoxinas (ETEC) é responsável por alta mortalidade e baixa taxa de crescimento de leitões. A habilidade de tais cepas causar doença é dependente principalmente da capacidade de E. coli aderir-se a mucosa do intestino delgado, que é mediada por fímbrias. Neste estudo o gene faeC, que codifica a subunidade menor da fímbria de E. coli K88ab, foi clonado no vetor de expressão em eucariotos pcDNA3, associado ou não à seqüência de KozaK. DNA plasmidial das duas versões da vacina foi inoculado em camundongos via intra-muscular, em duas doses, nos dias 0 e 21. Os animais que receberam a vacina de DNA contendo o faeC associado a seqüência de Kozak apresentaram soroconversões significativamente maiores (p