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Zielsetzung: Die bakterielle CRISPR-associated protein 9 Nuklease (Cas9) aus Streptococcus pyogenes ist eine Caspase, welche zielgerichtet genomische DNA-Strange schneiden kann. Sie wird eingesetzt, um DNA-Abschnitte zu modifizieren. Die Nuklease wird durch die Expression einer guidedRNA (gRNA) zur Ziel-DNA Sequenz gefuhrt und induziert dort Einzel- oder Doppelstrangbruche. Ziel dieses Projektes war ein Knockout des humanen endogenen Retrovirus Erv3 mittels CRISPR-Cas9 induzierter Deletion in der Chorionkarzinomzelllinie Jeg-3. Materialien und Methoden: Fur die Klonierung der CRISPR-Cas9 Vektoren wurde die entsprechende gRNA unter Verwendung des CRISPR Design Tools entworfen. Die gRNA wurde in den pSpCas9(BB)-2A-GFP Vektor kloniert. Nach der Transfektion des Konstrukts in die Chorionkarzinomzelllinie Jeg-3 wurden anschliesend Einzelzellklone uber Fluoreszenz-activated-Cellsorting isoliert. Induzierte Mutationen im Erv3 Gen wurden mittels Sequenzierung detektiert. Western Blot Analysen wurden zum Protein-Nachweis genutzt. Ergebnisse: Mittels CRISPR-Cas9 induzierter Mutation konnten in insgesamt sieben Jeg-3 Klonen unterschiedliche Mutationen im Erv3 Genom erzeugt werden. Wir konnten Deletionen von 1 – 186 Nukleotiden, sowie eine heterozygote Punktmutation induzieren. In zwei Klonen wurde durch die Deletion ein Frameshift erzeugt, welcher zum Verlust des Erv3 Proteins fuhrte. Zusammenfassung: CRISPR-Cas9 ist eine Methode, welche eine zielgerichtete Mutation der DNA ermoglicht. Wir konnten in diesem Projekt mittels induzierter Deletion erfolgreich die Expression des humanen endogenen Retrovirus Erv3 ausschalten.

Ein klinischer Aspekt der Praeklampsie/Eklampsie ist die periphere Vasokonstriktion, deren Ursache in einer Storung der Endothelfunktion liegt. Die Praeklampsie ist eine komplexe, multifaktorielle, nahezu alle Organsysteme betreffende Erkrankung, die nur in der Schwangerschaft auftritt. Bei manifester Praeklampsie stellt die Substitution von Magnesium und Kalzium eine therapeutische Option besonders zur Pravention der Eklampsie dar. Das Ziel dieser Studie war eine qualitative und quantitative Analyse von Magnesium und Kalzium in humanen Zellen wahrend des Zellzyklus sowie die Folgen einer Depletion dieser Kationen fur die Zelle. Humane Lymphozyten und Fibroblasten in verschiedenen Zellzyklusstadien wurden auf reinen Silicium-Chips kultiviert und im Sandwichverfahren aufgebrochen. Ein „Scanning“-Ionenmikroskop mit sekundarem Ionenmassenspektrometer analysierte dann gebundene und ungebundene Kationen, wie Magnesium und Kalzium, in den Zellen. Diese Studie zeigte eine spezifische zellzyklusabhangige Verteilung der beiden bivalenten Kationen Magnesium und Kalzium in humanen Zellen. Beide Kationen wurden hauptsachlich im Zytoplasma wahrend der Interphase und chromosomenassoziiert wahrend der Mitose vorgefunden. Eine Depletion dieser Kationen resultierte in einen Zellzyklusstopp, in dekondensierten und destabilisierten Chromosomen und Zelltod. Magnesium und Kalzium sind fur die Zell- und Chromosomenfunktion und -struktur essenziell. Ein Mangel dieser Kationen kann zu zellzyklusarretierten, hydrophischen und/oder apoptotischen Zellen mit konsekutiver Storung der Endothelzellfunktion, wie sie bei der schweren Praeklampsie gefunden wird, fuhren. Die ausreichende Kationensubstitution, vor allem von Magnesium, restauriert die Zellfunktion und -struktur und konnte so die positive therapeutische Wirkung bei der schweren Praeklampsie/Eklampsie erklaren. Preeclampsia is a complex and multifactorial disease during pregnancy, which can target almost all organ systems. One clinical finding of preeclampsia/eclampsia is peripheral vasoconstriction, where dysfunctional endothelial cells have been implicated. One treatment for severe preeclampsia/eclampsia is the intravenous substitution of magnesium and calcium. The purpose of this study was to perform a qualitative and quantitative analysis of magnesium and calcium in normal human cells during the cell cycle as well as determining the impact of cation depletion in the cell. Human lymphocytes and fibroblasts from different cell cycle stages were cultivated on pure silicon chips and cryofractured. Bound and unbound magnesium and calcium in cells were analysed using a scanning ion microprobe with secondary ion mass spectrometry at 50 nm resolution. Our study showed that the two main cellular divalent cations, magnesium and calcium, show a specific cell cycle distribution, which is mainly cytosolic during interphase but which becomes chromosomal bound during mitosis. A depletion of magnesium or calcium resulted in cell cycle arrest, decondensed and destabilized chromosomes leading to cell death. Magnesium and calcium are pivotal for normal cell growth and chromosome structure and function. Disturbed or failed endothelial cell function during preeclampsia, resulting in e.g. vasoconstriction due to arrested or dying cells can be associated with a depletion of cations. Cation substitution of magnesium in particular restores the endothelial cell function and structure and could explain the positive preventive effect and therapy during preeclampsia.

Sequenzierungen des humanen und murinen Genoms haben ergeben, dass 50 Protein-kodierende Sequenzen von retroviralen gag-Genen abstammen. Die Familie der Mammalian retrotransposon-derived (MART)-Gene umfasst 9 dieser Gene, welche intakte ORFs besitzen und somit neue Funktionen als sogenannte Neogene erlangt haben. Die Literatur zeigt, dass einige dieser Gene eine Rolle in der humanen Karzinogenese spielen. Knockout Modelle fur murine Mart-Gene zeigten eine essentielle Rolle wahrend der Plazentogenese. Fragestellung: Es sollte geklart werden, ob die humanen MART eine funktionelle Rolle in der humanen Plazentogenese haben. Des Weiteren sollte ein Vergleich zwischen Kontroll- und pathologischen Plazenten gezogen werden. Methodik: Zur quantitativen Analyse der Expression der MART-Gene wurde die Methode der SYBR-green basierenden real time PCR fur Kontroll- (n = 24) und pathologische Plazenten (PE: n = 12; IUGR: n = 13; HELLP: n = 8) des dritten Trimesters durchgefuhrt. Um die Lokalisation der Gene zu untersuchen, wurden In-situ Hybridisierungen und immunhistochemische Farbungen mit MART-spezifischen Antikorpern verwendet. Western Blot-Analysen gaben Aufschluss auf die Grose der Proteine in den Plazenten. Ergebnis: Die Ergebnisse zeigen, dass MART1, MART2, MART7 und MART8 am hochsten in der humanen Kontroll-Plazenta exprimiert werden. Im Vergleich zu Kontrollen wurde vor allem MART1 in den PE, IUGR und HELLP Plazenten signifikant herunterreguliert. Die Lokalisation der MART Gene zeigte sich hauptsachlich in den verschiedenen Trophoblasten-Subtypen, aber auch in den Endothelzellen der Blutgefase. Schlussfolgerung: Die Gene der MART-Familie werden in Kontroll- und pathologischen Plazenten unterschiedlich exprimiert. Dies und der Nachweis der Proteine lassen eine funktionelle Rolle wahrend der Plazentogenese vermuten.

Die RNA der einzelnen Kompartimente (SCT, innnerer Villi und GC) konnte in guter Quantitat und Qualitat isoliert und analysiert werden. Die unterschiedliche Expression, der mit IHC gezeigten Markerproteine, konnte mit den Chip Daten bestatigt werden. Auserdem gab es viele andere hochsignifikante Unterschiede in der Genexpression zwischen den drei Zellkompartimenten. In der Abbildung unten sind die Anzahl der unterschiedlich exprimierten Gene im Vergleich zueinander dargestellt (mind. 2-fach hohere Expr.). 2. Laser micro-dissection Mikroskopie und Microarray Plazentares Gewebe von drei Patientinnen wurde direkt nach Sectio caesarea in Stickstoff gefroren und anschliesend in 12μm dicke Schnitte auf Rnase-free membrane-covered slides (Zeiss) gezogen. Diese wurden in 70% Ethanol fixiert und die Kerne mit 0,1% Cresyl Violet gefarbt. Mit einem PALM laser micro-dissection and catapulting system (Zeiss) wurden die einzelnen Kopartimente ausgeschnitten und in einem collection tube (Zeiss) mit Lysepuffer (Agilent) gesammelt. Die Abbildung zeigt Beispiele der mit der PALM Robo software (Zeiss) markierten Regionen vor und nach dem Ausschneiden und Katapultieren.

Zielsetzung: In diesem Projekt soll auf der Ebene genomischer DNA von bis zu 30 Patientinnen mit MRKHS die Hypothese bewiesen werden, ob Genvariationen im Anti Mullerisches Hormon (AMH) oder seinen Rezeptoren eine Induktion des AMH-Signalweges bewirkte. Zusatzlich soll der essentielle Transkriptionsfaktor SOX9 des AMH-Gens auf Sequenzvariationen hin untersucht werden. Eine konstitutive Aktivierung des AMH bei den Patientinnen mit MRKHS soll mittels ELISA belegt werden. Materialien und Methoden: Bis heute (April 2003) wurde die DNA und das Blutplasma von 22 MRKHS und uber 50 Kontrollpersonen isoliert und gelagert. An der DNA von MRKHS-Patientinnen wurden mittels spezifischer, neu etablierter Oligosonden und PCR die komplette AMH-Promotorregion amplifiziert und sequenziert. Zusatzlich wurde der essentielle Transkriptionsfaktor SOX9 bei allen MRKHS-Patientinnen amplifiziert und sequenziert. Ergebnisse: Das DANN-Fragment der gesamten AMH-Promoterregion umfasst 1086 bp. Im Plus- und im Minus-Strang der DANN-Sequenzen wurden drei Polymorphismen detektiert, wovon einer an der SF1-Bindungsstelle lokalisiert ist. Des weiteren wurde das letzte Exon von SAP62 (Upstream des AMH-Gens) sequenziert. Dabei wurden 3 Polymorphismen identifiziert, welche im Austausch von Aminosauren resultieren. Zusammenfassung: Das MRKHS ist eine Fehlbildung der weiblichen Genitalien (1:4,000 weiblichen Geburten) infolge eines embryonalen Entwicklungsstorung der Muller-Gange aus unbekannter Ursache. Die Detektion von Genpolymorphismen oder Mutationen in den fur die Regression der Mullerischen Gange essentiellen Gene AMH und SOX9 konnte fur die Atiologie des MRKHS eine Schlusselrolle darstellen.