Search

Durant el període de formació del Sistema Nerviós Central (SNC) una multitud de factors participen en el desenvolupament de les diferents estructures cerebrals. Aquests factors controlen tant la migració cel·lular com el correcte posicionament de les diferents cèl·lules dins el SNC. La Reelina és un proteïna soluble de matriu extracel·lular expressada al llarg del desenvolupament i de l'edat adulta, encara que la seva funció principal s'hipotetitza durant el desenvolupment. La present tesi abarca tres funcions diferents de la Reelina en el control de la migració cel·lular durant el desenvolupament i l'edat adulta.En el primer apartat d'aquesta Tesi, hem demostrat que la Reelina pot controlar el nivell de fosforilació en mode I de la proteïna MAP1B durant la migració de les neurones que formen l'escorça cerebral. Aquesta fosforilació en mode I s'ha associat al control de l'estabilitat dels microtúbuls durant la migració cel·lular. L'estudi morfològic que hem desenvolupat en l'animal deficient per la proteïna MAP1B ens ha corraborat que existeix una relació entre la cascada de senyalització desencadenada per la Reelina i l'activitat de la proteïna MAP1B. Finalment també hem descrit que en resposta a la Reelina la quinasa GSK3-beta fosforila principalment MAP1B en mode I, encara que la participació, en menor grau, de la quinasa Cdk5/p35 no pot ser descartada.En el següent punt del nostre estudi, hem relacionat la via de senyalització MAPK/ERK amb la cascada activada per la Reelina. Hem comprovat que la Reelina pot induir la fosforilació d'mDab1 i la subseqüent activació de la proteïna PI3K, que a la seva vegada pot fosforilar a la proteïna Akt1/PKB. A partir d'aquest resultats, hem demostrat que l'activació de PI3K en reposta a la Reelina indueix l'activació de MEK1/2 i que aquesta activació desenvoca en la fosforilació de les proteïnes Erk1 i Erk2. També hem descrit que les formes fosforilades d'Erk1/2 en resposta a Reelina es transloquen a nucli en neurones corticals on indueixen l'expressió del factor de transcripció Egr-1. Un punt important d'aquest estudi es basa en el fet que hem pogut relacionar la cascada Reelin-MAPK/ERK en el procés de desadhesió de les cèl·lules de la zona subventricular (o SVZ) que participen en la via de la migració rostral (o RMS). A partir del fet que en presència de la Reelina, les cèl·lules que surten d'explants de SVZ no migren homofílicament sino que pateixen un proces de desadhesió migrant de forma individualitzada, hem descrit que si bloquegem farmacològicament o genèticament la via d'activació MAPK/ERK l'efecte de desadhesió induït per la Reelina queda inhibit. Amb aquest resultat podem concloure que en resposta a la Reelina les proteïnes Erk1/2 es fosforilen i que aquesta fosforilació és necessària per que la Reelina desenvolupi els seu paper en desadhesió dels neuroblasts que participen en la RMS.El tercer i darrer punt d'aquesta Tesi es basa en el control per part de la Reelina de la migració radial de les cèl·lules granulars del cerebel. En resposta a Reelina les cèl·lules granulars del cerebel inhibeixen la seva migració i aquesta resposta es induïda mitjançant l'activació de la via de les MAPK/ERK. El bloqueig farmacològic d'aquesta via inhibeix l'efecte de la Reelina. Amb aquestes dades podem concloure que l'activació, induïda per la Reelina, de la via de les MAPK/ERK no només és important en el control de la migració en el cerbell anterior sino que també és important en el cerebel, y que aquesta pot ser una cascada de senyalització que participa àmplimant en les funcions on s'hipotetitza la funcionalitat de la Reelina., "Role of Reelin signalling during neuronal migration in the Central Nervous System"During the development of the Central Nervous System (CNS) a multitude of factors work together to generate the different brain structures. Some of these factors control both cellular migration and cellular positioning inside the CNS. Reelin is a soluble protein of the extracellular matrix expressed during both development and adulthood, however its principal function is hypothesized to occur during development. This current Thesis addresses three different functions of Reelin on neuronal migration during embryonic and postnatal development.In the first chapter, we have shown that Reelin controls mode I phosphorylation of MAP1B protein during neuronal migration in the neocortex. Mode I phosphorylation has been related to the microtubule stability during cell migration. We developed morphological studies on map1b-deficient mice that corroborated the relationship between Reelin signalling cascade and MAP1B activity. Furthermore, we also described that this relation is done through the Reelin-dependent GSK3 activation, which phosphorylates MAP1B in mode I.In the second chapter, we addressed the relationship of Reelin signalling and the MAPK/ERK pathway. We showed that Reelin induces the phosphorylation of Dab1 and subsequent PI3K/Akt1 activation. Based on these results, we first described that Reelin-dependent PI3K activation induces MEK activation, which triggers Erk1 and Erk2 (Erk1/2) phosphorylation. We also showed that these active phospho-Erk1/2 proteins translocate into the nucleus inducing the expression of the Egr-1 transcription factor. Furthermore, we have demonstrated that this Reelin-induced pathway is activated during rostral migratory stream migration when neuroblasts face Reelin expressed in the olfactory bulb. The activation of ERK pathway in response to Reelin is crucial to change neuroblast migration from tangential chain migration to radial individual migration into the olfactory bulb.In the last chapter, we studied the role of Reelin in the control of radial migration of granule cells during the postnatal development of the mouse cerebellum. We shared that cerebellar granule cell migration is blocked by Reelin stimulation through MAPK/ERK activation. Furthermore, when ERK activation was pharmacologically block the Reelin effect on granule cells migration was inhibit.

La tasa de proliferación celular resulta de un balance entre varios procesos celulares: mitosis, diferenciación celular y la muerte celular apoptótica. La regulación de este balance es fundamental durante el desarrollo embrionario, la regeneración celular y el envejecimiento, así como en distintos procesos degenerativos y patológicos. Recientemente se ha clonado un gen, designado Zac1, el cuál codifica un factor de transcripción que regula la apoptosis y el paro del ciclo celular, mediante vías independientes. Se ha determinado que en ratones adultos Zac1 se expresa en la glándula pituitaria, en el cerebro, y en distintos tejidos periféricos, así como en el tubo neural de embriones de ratón con 9 días. Distintos estudios han demostrado que Zac1 está implicado en el desarrollo tumoral, en la diabetes mellitus neonatal transitoria, en la activación y/o represión de receptores nucleares, en la coactivación de la vía apoptótica p53/Apaf-1, etc. Sin embargo, su función en el sistema nervioso central es aún desconocida.La presente tesis tiene como objetivo general, determinar el papel de Zac1 en el sistema nervioso central del ratón. En este sentido, se determinó el patrón de expresión de Zac1 durante el desarrollo embrionario del neuroectodermo y mesodermo, así como, durante la maduración del sistema nervioso central (mediante técnicas de hibridación in situ e inmunohistoquímicas). Además, se caracterizó el fenotipo de las poblaciones celulares que expresan Zac1 durante el desarrollo. En el desarroollo del neuroectodermo, los resultados obtenidos muestran que Zac1 se expresa en las células madre/progenitoras del sistema nervioso central, tanto en desarrollo como en el animal adulto (zonas germinativas). Su expresión en células diferenciadas se restringe a subpoblaciones neuronales de naturaleza GABAérgica y catecolinérgica. En el desarrollo del mesodermo, los resultados revelaron que Zac1 se expresa durante todas las fases del ciclo de vida de los condrocitos (condrogénesis) y del desarrollo de las células musculares (miogénesis), sugiriendo que Zac1 puede jugar un papel importante en el desarrollo del esqueleto y del músculo esquelético.Por otra parte, se estudió el papel de Zac1 en el sistema nervioso central, analizando el fenotipo neural de los ratones mutantes para Zac1, y estudiando el papel de Zac1 en los procesos neurodegenerativos asociados con la muerte celular apoptótica. Los animales mutantes para Zac1 presentan tasas de proliferación neural superiores a la de los animales salvajes, reforzando el papel de Zac1 en el control de la tasa de proliferación celular (ciclo celular y apoptosis). Además, los resultados obtenidos muestran que la expresión regional de Zac1 es imprescindible para la selección y/o diferenciación de distintos progenitores neurales (tales como en los oligodendrocitos, las neuronas, los astrocitos, etc). En los modelos neurodegenerativos, los resultados obtenidos muestran que Zac1 es imprescindible para activar los procesos apoptóticos que conducen a la fragmentación del DNA, apuntando a su implicación en las fases tempranas de la activación de las cascadas apoptóticas.Por tanto, los novedosos resultados obtenidos en este trabajo de tesis abren distintas líneas de enfoque sobre el papel de zac1 en el sistema nervioso central, concretamente en los procesos de proliferación y diferenciación celular, en los procesos apoptóticos y en los mecanismos de plasticidad neural que ocurren durante el desarrollo temprano del organismo, así como, tras la activación neural que se desarrolla en los procesos de neurodegeneración., The proliferative rate results from a balance between cell division (mitosis), cell differentiation, and programmed cell death (apoptosis). Controlling this balance is fundamental during embryonic development, tissue regeneration, and aging, as well as in neurodegenerative process. In 1997, Spengler and collaborators cloned Zac1, a new zinc-finger transcription factor induces the cellular cycle arrest and the apoptosis, by means of independent routes, like p53. Zac1 is high expressed in the pituitary gland and in some brain areas. However, their role in the central nervous system had not been studied. In this way, this work, we study the pattern of expression of Zac1 during the maturation of the central nervous system (Valente and Auladell, 2001), as well as during the early development of neuroectoderm and mesoderm (Valente et al., 2005), in mice. In addition, we characterized these neural populations that express Zac1 during the development, demonstrating that initially (embryonic and postnatal mice) its expression is strong in neural cells with high mitotic activity (progenitors and stem cells) and later (adult mice) in interneurons of the GABAergic system. These results took to us to analyze if the strong expression of Zac1 in the central nervous system would be related to its apoptotic function. In this way, our results in neurodegenerative processes, as much in normal mice (Valente et al., 2004) as in mutant mice for Zac1 (Valente et al., 2005; results in preparation), show that although the expression of Zac1 is important in the induction of the apoptosis, is not their main function in the development and maturation of central nervous system, suggesting that Zac1 more would be implied in controlling the cellular cycle that in inducing the apoptosis. Moreover, a detail immunohistological study of the Zac1 mutant mice brain shows that the expression of Zac1 is important for the differentiation of the oligodendrocytes, interneurons and astrocytes, and suggest an important role of Zac1 in the differentiation and/or selection process of the progenitors/stem cells of the nervous system.

[cat] L'objectiu general d'aquesta tesi ha estat el d'aprofundir en la funció de les molècules que fan possible que la migració neuronal es dugui a terme, permetent així un correcte desenvolupament del sistema nerviós central. Per assolir aquesta fita, ens hem centrar en les molècules de guia Reelina i Netrina-1, la proteïna adaptadora Dab1, i l'hormona tiroïdea, els mutants de les quals presenten greus alteraciones en el cervell degudes a migraciones neuronals aberrants en les primeres etapes de desenvolupament.

En el sistema nerviós central (SNC) la dopamina es comporta com la catecolamina prototip controlant el moviment i l’estat de motivació de l’individu, així com l’alliberació de prolactina. L’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat estudiar la utilitat de tres biomarcadors relacionats amb el metabolisme de la dopamina (àcid homovaníl•lic, les pterines i el piridoxal fosfat) com a eines pel diagnòstic i la investigació de malalties neurològiques en la infància. La tesi ha estat estructurada en tres objectius, i per tant en tres treballs. En el primer treball, es va avaluar la utilitat de l’àcid homovaníl•lic, el metabòlit principal i més estable de la dopamina, per estudiar l’estat dopaminèrgic. El seu ús com a biomarcador en el líquid cefaloraquidi (LCR) ens ha permès diagnosticar varis errors congènits del metabolisme en els últims anys. No obstant això, la necessitat d’aquest estudi va originar-se pel fet que hi ha molts pacients amb simptomatologia de deficiència dopaminèrgica que romanen sense un diagnòstic definitiu confirmat. La descripció d’aquests pacients des d’un punt de vista bioquímic, buscant associacions amb les característiques clíniques, radiològiques i electrofisiològiques ens ha permès millorar el coneixement científic respecte aquest marcador bioquímic en l’àmbit neuropediàtric. Seguint en l’avaluació del metabolisme de la dopamina, cal remarcar el paper essencial que tenen els cofactors tetrahidrobiopterina i vitamina B6 en el metabolisme dopaminèrgic. Les alteracions quantitatives d’aquests cofactors també poden provocar deficiències en la via dopaminèrgica i, per tant, també tenen un important valor a la hora d’estudiar aquests pacients. D’altra banda, s’ha demostrat el paper que té la neopterina (metabòlit de la tetrahidrobiopterina) com a marcador bioquímic en LCR en el diagnòstic de processos immuno-inflamatoris del SNC. D’aquí neix el plantejament del segon treball, la finalitat del qual és estudiar les pterines (neopterina i biopterina) com a eina d’ajut en pacients neurològics sense un diagnòstic confirmat però que presenten alteracions en el valor de pterines en LCR. Alteracions que poden estar associades a malalties genètiques d’aquest cofactor o bé causades per processos immuno-inflamatoris. Finalment l’últim treball es basa en la utilitat de quantificar els valors del cofactor que participa en l´últim pas de la síntesi dopaminèrgica, el piridoxal fosfat (la forma activa de la vitamina B6). Les seves deficiències poden provocar trastorns marcats de la síntesis de dopamina, però també d’altres metabòlits, com aminoàcids o l’àcid gamma-aminobutíric. Clínicament, aquests pacients presenten greus alteracions neurològiques sent l’epilèpsia refractària als anticonvulsivants habituals, la simptomatologia més freqüent. La necessitat d’aquest treball esdevé en què hi ha varis pacients que presenten deficiències de piridoxal fosfat els quals han respòs favorablement a suplements de vitamina B6. Els diferents estudis que s’han presentat en aquesta tesi s’han realitzat en pacients procedents del Hospital Sant Joan de Déu, però també d’altres hospitals nacionals i internacionals, entre els quals n’hi ha de Portugal, Argentina, Grècia, Turquia i la Índia. La col•laboració amb altres serveis del nostre hospital ha donat un component traslacional als tres treballs presentats en aquesta tesi, que inclouen dades clíniques, bioquímiques i moleculars, aportant un aspecte més holístic i tenint una aplicació pràctica i valuosa per l’estudi de pacients amb malalties neuropediàtriques greus., Our objective was to study the utility of three biomarkers related to dopamine metabolism (homovanillic acid (HVA), pterins and pyridoxal phosphate (PLP)) as a diagnostic and investigation tool of neurologic disorders in infancy. In the first study our objective was to determine and assess the HVA concentrations in cerebrospinal fluid (CSF) in a large neuropediatric cohort as a biochemical tool to identify dopaminergic abnormalities. To achieve this aim, we studied biogenic amines in 1388 CSF samples from children with neurological disorders analysed by high pressure liquid chromatography with electrochemical detector. This study allowed us to determine the prevalence of dopaminergic abnormalities, as well as we defined several neurologic diseases with CSF HVA abnormalities, besides from 21 primary dopaminergic defects. In the second study, our objective was to analyse the CSF pterins (neopterin and biopterin) concentrations in children with neurologic disorders to identify primary or secondary diseases about these coenzymes. We also evaluated the CSF neopterin utility as a biomarker in inflammatory-immune mediated processes establishing a new cut-off for it. After that, the next step was to assess data from 606 neuropediatric patients presenting CSF neopterin values above or below the new established cut-off value. Finally, our last study was to analyse the CSF PLP concentrations in neuropediatric patients without an aetiological diagnosis in order to identify primary or secondary diseases related to PLP metabolism. After the analyses of PLP in CSF of 147 patients, we detected our first PNPO gene defect. Moreover, we recruited a series of 10 patients who disclosed low-normal CSF PLP values, that the main clinical feature was epilepsy. Additionally we also assessed the response to PLP treatment in all of them. These different studies have been performed in patients from Hospital Sant Joan de Déu, as well as from other national and international hospitals, such as Portugal, Argentina, Greece, Turkey and India. Moreover, the collaboration with other services of our hospital has allowed this thesis to have a holistic component including clinical, radiological, biochemical and molecular data.