Search

[cat] El Se és un micronutrient essencial que participa en diferents funcions en humans i en animals a través de la seva incorporació en forma de selenocisteïna (Sec) a les selenoproteïnes. Una ingesta inadequada de Se es considera un factor de risc per diverses malalties cròniques associades a l’estrès oxidatiu i a la inflamació. La seva incorporació com a suplement en les dietes d’aviram és una manera efectiva de disminuir els efectes negatius de l’estrès que pateixen els animals degut a l’increment en els paràmetres de producció de la industria avícola. En el present estudi s’investiga el paper de l’anàleg de la hidroxi-selenometionina (àcid 2-hidroxi-4-metilselenobutanoic, HMSeBA), una font orgànica de Se, per donar suport a la síntesi de selenoproteïnes i a la protecció davant l’estrès oxidatiu, en dues línies cel·lulars: cèl·lules intestinals Caco-2 i macròfags (derivats de monòcits humans THP-1). El paper de l’HMSeBA en la resposta inflamatòria dels macròfags també s’ha estudiat. Per estudiar els efectes de la deficiència de Se, es va desenvolupar un model de privació de Se en ambdues línies cel·lulars. L’estudi va prosseguir amb l’avaluació dels efectes de la suplementació amb aquesta font orgànica de Se. En aquests dos models, es va estudiar la capacitat de l’HMSeBA sobre l’expressió de selenoproteïnes com la glutatió peroxidasa (GPX), la tioredoxina reductasa (TXNR) o la selenoproteïna P1 (SELENOP). A més, també es va estudiar la capacitat antioxidant de l’HMSeBA en cèl·lules estimulades amb H2O2, amb Salmonella Enteritidis o amb lipopolisacàrid (LPS), a través de la determinació de les espècies reactives d’oxigen (ROS), la formació de productes secundaris d’oxidació i l’autofluorescència de les cèl·lules. Per tal d’estudiar el paper de l’HMSeBA en la resposta inflamatòria, es va determinar la producció de citocines i la capacitat fagocítica i bactericida. En cèl·lules Caco-2, l’activitat GPX i l’expressió gènica de GPX1 juntament amb l’expressió tant proteica com gènica de SELENOP van disminuir significativament en el model de privació de Se; mentre que l’expressió gènica de GPX2 i la producció de ROS van incrementar. No es van observar canvis en l’activitat TXNRD. Quan les cèl·lules es van suplementar amb HMSeBA, l’activitat GPX i TXNRD, l’expressió gènica de GPX1 i GPX2 i l’expressió tant proteica com gènica de SELENOP van incrementar significativament. De manera similar, després de l’estimulació amb H2O2 o Salmonella Enteritidis, es va observar una disminució en la producció de ROS, en la peroxidació lipídica i en la carbonilació proteica. En macròfags, la privació de Se va induir una reducció de l’activitat GPX, de l’expressió gènica de GPX1 i de l’expressió tant proteica com gènica de SELENOP. La suplementació amb HMSeBA va incrementar l’expressió gènica de GPX1 i de SELENOP i va ser capaç de reduir la producció de ROS després de l’estimulació amb H2O2. En cèl·lules estimulades amb LPS, l’HMSeBA va incrementar l’expressió gènica de GPX1 i va reduir l’estrès oxidatiu així com la producció de citocines. La capacitat fagocítica i bactericida van incrementar també amb aquesta font de Se. Les cèl·lules Caco-2 i els macròfags poden utilitzar HMSeBA com a font de Se per la síntesi de selenoproteïnes, protegint la cèl·lula de l’estrès oxidatiu. A més, l’HMSeBA modula positivament la resposta inflamatòria per tal d’evitar el possible dany produït per macròfags altament activats., [eng] Se is an essential micronutrient which plays a role in different functions in humans and animals through its incorporation into selenoproteins as selenocysteine (Sec). Inadequate dietary Se is considered a risk factor for several chronic diseases associated with oxidative stress and inflammation. Its incorporation as a supplement in poultry diets has become an effective way to diminish the negative effects of the stress caused to animals due to the increase in production parameters in poultry industry. The present study investigates the role of the hydroxy-selenomethionine analogue (2-hydroxy-4-methylselenobutanoic acid, HMSeBA), an organic form of Se, in supporting selenoprotein synthesis and protecting against oxidative stress in two cell lines: intestinal Caco-2 cells and macrophages (derived THP-1 human monocytes). HMSeBA role in inflammatory response has also been studied in macrophages. To study the effects of Se deficiency in cells, a model of Se deprivation was developed in both cell lines. The study was then moved forward to evaluate the effects of this organic Se source in a model of Se supplementation. In these two models, HMSeBA capacity to support selenoprotein synthesis, such as glutathione peroxidase (GPX), thioredoxin reductase (TXNRD) or selenoprotein P1 (SELENOP), was studied. Moreover, HMSeBA antioxidant capacity was also studied in cells stimulated with H2O2, Salmonella Enteritidis or lipopolysaccharide (LPS), by determining reactive oxygen species (ROS) production, secondary oxidation products and cell autofluorescence. To study the role of HMSeBA in inflammatory response, cytokine production as well as phagocytic and killing capacity were also studied. In Caco-2 cells, GPX activity and GPX1 gene expression together with both protein and gene expression of SELENOP in the Se-deprived model were significantly decreased; while GPX2 gene expression and ROS production were significantly increased. There were no effects in TXNRD activity. When cells were supplemented with HMSeBA, GPX and TXNRD activity, GPX1 and GPX2 gene expression and both SELENOP gene and protein expression were significantly increased. Similarly, a decrease in ROS, lipid peroxidation and protein carbonylation after H2O2 or Salmonella Enteritidis treatment were observed. In macrophages, Se deprivation induced a reduction in GPX activity, GPX1 gene expression and both SELENOP protein and gene expression. HMSeBA supplementation upregulated gene expression of GPX1 and SELENOP and was capable of decreasing ROS production after H2O2 treatment. In LPS-stimulated macrophages, HMSeBA upregulated GPX1 gene expression and reduced oxidative stress and cytokine production. Phagocytic and killing capacity were enhanced by this Se source. Caco-2 cells and macrophages can use HMSeBA as a Se source for selenoprotein synthesis, resulting in protection against oxidative stress. Moreover, HMSeBA positively modulates the inflammatory response to avoid the potential toxic insult produced by highly activated macrophages.

El cos humà està colonitzat per bacteris comensals que habiten superfícies i fluids de l'organisme, una comunitat coneguda com a microbiota, amb implicacions en la salut humana. La presència o absència de determinades espècies bacterianes altera el funcionament fisiològic, fet que ha impulsat estudis dirigits a conèixer el seu paper en algunes malalties, com per exemple la infertilitat. Sota la hipòtesi que la microbiota pot alterar paràmetres seminals i espermàtics associats a la infertilitat masculina, s'han proposat un seguit d'objectius per a estudiar-ho. S'han valorat paràmetres relacionats amb la integritat de l'ADN espermàtic com l'estat de compactació de la cromatina, la fragmentació de l'ADN o l'estrès oxidatiu, juntament amb els paràmetres clínics d'un seminograma. En primer lloc, s'ha valorat la relació entre aquests paràmetres per, a continuació, caracteritzar la microbiota seminal a través de la seqüenciació del gen ribosomal 16S complet mitjançant les plataformes MiSeq d'Illumina i MinION d'Oxford Nanopore Technologies, i buscar-hi associacions amb els paràmetres valorats. S'han pogut establir relacions entre un biomarcador recentment descrit, el potencial oxidant-reductor, i altres paràmetres més coneguts com el pH, l'estat de compactació de la cromatina o la fragmentació d'ADN. S'ha descrit la composició bacteriana seminal, integrada principalment per Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria i Actinobacteria, i s'han establert relacions entre alguns gèneres i famílies amb els paràmetres de qualitat seminal. El cuerpo humano está colonizado por bacterias comensales que habitan superficies y fluidos del organismo, una comunidad conocida como microbiota, con implicaciones en la salud humana. La presencia o ausencia de determinadas especies bacterianas altera el funcionamiento fisiológico, lo que ha impulsado estudios dirigidos a conocer su papel en algunas enfermedades, como por ejemplo la infertilidad. Bajo la hipótesis de que la microbiota puede alterar parámetros seminales y espermáticos asociados a la infertilidad masculina, se han propuesto una serie de objetivos para estudiarlo. Se han valorado parámetros relacionados con la integridad de l'ADN espermático como el estado de compactación de la cromatina, la fragmentación de l'ADN o el estrés oxidativo, junto con los parámetros clínicos de un seminograma. En primer lugar, se ha valorado la relación entre estos parámetros para, a continuación, caracterizar la microbiota seminal a través de la secuenciación del gen ribosomal 16S completo mediante las plataformas MiSeq de Illumina y MinION de Oxford Nanopore Technologies, buscando asociaciones con los parámetros valorados. Se han podido establecer relaciones entre un biomarcador recientemente descrito, el potencial oxidante-reductor, y otros parámetros más conocidos como el pH, el estado de compactación de la cromatina o la fragmentación d'ADN. Se ha descrito la composición bacteriana seminal, integrada principalmente por Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria y Actinobacteria, y se han establecido relaciones entre algunos géneros y familias con los parámetros de calidad seminal. The human body is colonized by commensal bacteria that inhabit the body's surfaces and fluids, a community known as microbiota, with implications for human health. The presence or absence of certain bacterial species alters physiological functioning, which has led to studies aimed at understanding their role in some diseases, such as infertility. Under the hypothesis that the microbiota may alter seminal and sperm parameters associated with male infertility, some objectives have been proposed. Parameters related to sperm DNA integrity such as chromatin compaction, DNA fragmentation, or oxidative stress have been assessed, along with the clinical parameters of a seminogram. The relationship between these parameters was first assessed, and then seminal microbiota was characterized through full-length 16S ribosomal gene sequencing using Illumina MiSeq and Oxford Nanopore Technologies MinION platforms, and relationship was assessed with the rated parameters. Relationships have been established between a recently described biomarker, oxidation-reduction potential, and other better-known parameters such as pH, chromatin compaction, or DNA fragmentation. The seminal bacterial composition, composed mainly of Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria and Actinobacteria, has been described, and relationships have been established between some genus and families with the seminal quality parameters.

Nowadays, cancer is one of the leading causes of death in developed countries. Therefore, there is great interest of developing new therapeutic strategies to improve the efficiency of current cancer treatments. The vulnerability of cancer cells to oxidative stress may be a therapeutic target for new anti-cancer agents design. Differential redox homeostasis in normal and malignant cells suggests that promoting upregulation of cellular reactive oxygen species (ROS) by pro-oxidant treatment could selectively target cancer cells without compromising the viability of healthy cells. The complexes generated in the cells showed a high capacity to induce DNA double-strand breaks through oxidative mechanisms, suggesting oxidative dependent mechanisms as its major biological targets. This activity has been demonstrated at both molecular (DNA plasmid) and cellular levels. In summary, the present work has characterized the mechanism by which the complexes exhibit anti-tumor activity against a large number of cell lines. This mechanism includes intracellular iron chelation and subsequent pro-oxidant activity by intracellular generated iron complexes. These complexes display a potent cytotoxic activity both in tumor cells and metastatic tumor stem cell-like. Therefore, altogether the results shown throughout the project provide functional evidences of a new family of metallodrugs with efficient anti-tumor activity aimed to disrupt tumor cell redox balance triggering cell death by oxidative-dependent mechanisms, En l’actualitat el càncer és una de les principals causes de mort en els països desenvolupats i per tant, hi ha un enorme interès en desenvolupar noves estratègies terapèutiques que millorin l’efectivitat dels actuals tractaments antitumorals. S’ha descrit que les alteracions metabòliques de les cèl·lules tumorals fan que estiguin sotmeses a un major estrès oxidatiu que les cèl·lules sanes i per tant són més vulnerables a agents pro-oxidants que puguin alterar el seu equilibri redox. Darrerament, aquesta diferència en l’estat redox s’està explorant com a diana pel desenvolupament de nous tractaments pel càncer. En aquest context, ens vam proposar analitzar l’activitat antitumoral de diferents famílies de complexes amb metalls de transició amb base aminopiridina que actuen com a eficients i robusts catalitzadors d'oxidació de substrats orgànics. Hem vist que aquests complexes presenten una elevada capacitat per induir talls en la doble cadena de DNA mitjançant mecanismes oxidatius, el que indica que aquest és una de les seves principals dianes biològiques. Aquesta activitat s’ha demostrat tant directament a nivell de DNA plasmídic com a nivell cel·lular. En resum, aquest estudi ha permès caracteritzar el mecanisme pel qual els compostos presenten una activitat antitumoral contra un elevat nombre de tipus cel·lulars. Aquest mecanisme inclou la quelació del ferro intracel·lular i la posterior activitat pro-oxidant dels complexes de ferro generats intracel·lularment, els quals exerceixen una potent activitat citotòxica tant en cèl·lules tumorals com en cèl·lules mare tumorals, causants de la metàstasi. Per tant, els resultats obtinguts en l’estudi proporcionen evidències funcionals d’una nova família de metal·lodrogues amb una eficient activitat antitumoral dirigida a alterar l’estat redox de les cèl·lules tumorals i a generar la seva mort per mecanismes oxidatius

L'arsènic inorgànic és un carcinogen en humans, és a dir, provoca o afavoreix l'aparició de càncer, i ho fa mitjançant múltiples mecanismes d'acció. Aquesta tesi doctoral ha estudiat concretament la relació entre la generació de dany oxidatiu en el DNA i la carcinogènesi associada a l'exposició d'arsènic. S'ha comprovat la importància d'un gen relacionat amb la reparació del dany oxidatiu en el DNA i per tant, s'ha posat de manifest el risc associat a les persones amb alteracions en aquest gen, fet que les fa més susceptibles a patir càncers relacionats a l'exposició a l'arsènic. El arsénico inorgánico es un carcinógeno en humanos, es decir, provoca o favorece la aparición de cáncer, y lo hace mediante múltiples mecanismos de acción. Esta tesis doctoral ha estudiado concretamente la relación entre la generación de daño oxidativo en el DNA y la carcinogénesis asociada a la exposición de arsénico. Se ha comprobado la importancia de un gen relacionado con la reparación del daño oxidativo en el DNA y por tanto, se ha puesto de manifiesto el riesgo asociado a las personas con alteraciones en este gen, lo que las hace más susceptibles a sufrir cánceres relacionados a la exposición al arsénico. Inorganic arsenic is a carcinogen in humans, that is, it causes or favours the development of cancer, and it does so though multiple mechanisms of action. This doctoral thesishas studied specifically the relationship between the generation of oxidative DNA damage and carcinogenesis associated with arsenic exposure. It determines the importance of a gene related to the repair of oxidative DNA damage and therefore reveals the associated risk in people with changes in this gene, which makes them more susceptible to cancers related to exposure to arsenic.

Recently, the hydrological demand has increased while the supply has stayed the same or even, in some places, it has diminished. One possible solution to this problem is the use of recycled wastewater, mostly in places with scarcity of water. The main use of this water is in the agriculture and landscape restoration. However, the wastewaters treatment plants used for the water reclamation are not able to eliminate the presence of xenobiotics and, among them, the presence of emergent organic contaminants. In order to reduce the accumulation of these contaminants in the soil or in the crops, when watered with these waters, it can be reduced applying biochars in the soil. The aim of this project is to study whether the incorporation of biochar in a soil is able to reduce the possible effects of toxicity generated by the presence of emergent organic contaminants applied together with the irrigation water. This will be tested by determining the produced biomass, the concentration of chlorophylls and the oxidative stress in different samples. In this study we incorporated different quantities of biochar (0, 2,5% and 5%) in some columns (inverted glass bottles with its base cut) which contained soil from an agricultural land in Viladecans. The crop was Marvel lettuce. This material was submitted to 8 irrigations with emergent organic contaminants (Triclosan, Bisphenol A, Ibuprofen, Caffeine, Carbamazepine, Tonalide, Clofibric acid, Furosemide, Dihydrojasmonate methyl, sulfamethazine, Propranolol hydrochloride, Tris (2-chloroethyl) phosphate and 17 α- Ethinylestradiol in a final irrigation concentration of 15 ng of each analyte per millilitre.) The plants were watered by drip irrigation every day with a dose of 100 mL with water added with nutritive solution. The addition of emergent organic contaminants affected negatively the biomass and chlorophylls production. The incorporation of biochar in the soil did not help to counteract the effect of the presence of emergent contaminants. Regarding the oxidative stress, the storage of vegetal material at -20ºC during 5 months did not helped stopping the activity of catalase enzyme and, for this reason, we have not detected any stress. The evaluation of this method shows that when the concentration of hydrogen peroxide is low the method losses accuracy. The minimum quantity we could accurately detect is 2,5 ppm and the minimum quantity we could measure with precision and exactitude is 8,84 ppm. En els darrers anys hi ha hagut un increment de la demanda hídrica mentre que l'oferta s'ha mantingut igual o fins i tot, en alguns llocs, ha disminuït. Una possible solució a aquest problema és la utilització d'aigües residuals regenerades, sobretot a regions amb escassetat d'aigua. La principal utilització d'aquesta aigua es dóna en agricultura i espais verds. No obstant, les plantes de tractament de regeneració d'aigua convencionals no aconsegueixen eliminar la presència de xenobiòtics, entre ells la presència de contaminants orgànics emergents. Per reduir l'acumulació d'aquests contaminants en el sòl o en el cultiu, quan es rega amb aquestes aigües, s'ha vist que pot ser disminuïda amb l'aplicació de biochars en el sòl. L'objectiu principal del treball és estudiar si la incorporació de biochar en un sòl permet reduir els possibles efectes de toxicitat, generats per la presència d'un conjunt de contaminants orgànics emergent aplicats amb l'aigua de reg. Això es comprovarà determinant la biomassa produïda, la concentració de clorofil·les i l'estrès oxidatiu que presentin les diferents mostres. En aquest estudi es van incorporar diferents quantitats de biochar (0, 2,5% i 5%) en unes columnes (botelles de vidre invertides amb la base tallada) que contenien sòl procedent d'un camp agrícola de Viladecans. El cultiu era enciam de tipus Meravella. Aquest material es va sotmetre a 8 regs amb contaminants orgànics emergents (Triclosan, Bisfenol A, Ibuprofè, Cafeïna, Carbamazepina, Tonalida, Àcid clofíbric, Furosemida, Metil dihidrojasmonat, Sulfametazina, Hidroclorur de propranolol, Tris(2-cloroetil)fosfat i 17 α-Etinilestradiol a una concentració final de reg de 15 ng de cada analit per mil·lilitre). Les plantes eren regades diàriament per degoteig amb una dosi de 100 mL amb una aigua addicionada amb solució nutritiva. L'addició de contaminants orgànics emergents afectà negativament la producció de biomassa i clorofil·les. La incorporació de biochar en el sòl no va contribuir a contrarestar l'efecte de la presència de contaminants emergents. Pel que fa a l'estrès oxidatiu, l'emmagatzematge del material vegetal a -20ºC durant 5 mesos no va resultar idoni per a frenar l'activitat de l'enzim catalasa, i per tant, no s'ha detectat estrès. L'avaluació d'aquest mètode indica que quan la concentració de peròxid d'hidrogen es baixa el mètode perd exactitud. La mínima quantitat que es va poder detectar amb certesa raonable és de 2,5 ppm i la mínima quantitat que va poder ser mesurada amb precisió i exactitud és de 8,48 ppm. En los últimos años ha habido un incremento de la demanda hídrica mientras que la oferta se ha mantenido igual o ha llegado a disminuir en algunos sitios. Una posible solución a este problema es la utilitzación de aguas residuales regeneradas, generalmente en regiones con escasez de agua. La principal utilización de esta agua se da en agricultura y espacios verdes. No obstante, las plantas de tratamiento de regeneración de agua convencionales no consiguen eliminar la presencia de xenobióticos, entre ellos la presencia de contaminantes orgánicos emergentes. Para reducir la acumulación de estos contaminantes en el suelo o en el cultivo, cuando se riega con estas aguas, se ha visto que puede ser disminuida con la aplicación de biochars en el suelo. El objetivo principal del trabajo es estudiar si la incorporación de biochar en un suelo permite reducir los posibles efectos de toxicidad, generados por la presencia de un conjunto de contaminantes orgánicos emergentes aplicados en el agua de riego. Esto se comprobará determinando la biomasa producida, la concentración de clorofilas y el estrés oxidativo que presenten las diferentes muestras. En este estudio, se incorporaron diferentes cantidades de biochar (0, 2,5% y 5%) en unas columnas (botellas de vidrio invertidas con la base cortada) que contenían suelo procedente de un campo agrícola de Viladecans. El cultivo era lechuga de tipo Maravilla. Este material se sometió a 8 riegos con contaminantes orgánicos emergentes (Triclosan, Bisfenol A, Ibuprofeno, Cafeína, Carbamazepina, Tonalida, Ácido clofíbrico, Furosemida, Metilo dihidrojasmonato, Sulfametazina, Hidrocloruro de propranolol, Tris(2-cloroetilo)fosfato i 17 α-Etiniloestradiol a una concentración final de riego de 15 ng de cada analito por mililitro). Las plantas eran regadas diariamente por goteo con una dosis de 100 mL con agua adicionada con solución nutritiva. La adición de contaminantes orgánicos emergentes afectó negativamente la producción de biomasa y clorofilas. La incorporación de biochar en el suelo no contribuyó a contrarrestar el efecto de la presencia de contaminantes emergentes. En cuanto al estrés oxidativo, el almacenamiento del material vegetal a -20ºC durante 5 meses no resultó idóneo para frenar la actividad de la enzima catalasa, y por lo tanto, no se ha detectado estrés. La evaluación de este método indica que cuando la concentración de peróxido de hidrógeno es baja el método pierde exactitud. La mínima cantidad que se pudo detectar con certeza razonable es de 2,5 ppm y la mínima cantidad que pudo ser medida con precisión y exactitud es de 8,48 ppm.

L’activitat Pkh resulta essencial pel creixement vegetatiu del llevat Saccharomyces cerevisiae i es proporcionada principalment per Pkh1 i Pkh2. Es desconeixen però, en gran mesura, tant la totalitat de les seves funcions cel·lulars com els mecanismes de regulació. Amb l’objectiu d’estudiar les funcions de les proteïnes Pkh en llevat, els diferents grups d’investigació han utilitzat fins a dia d’avui una única aproximació consistent en l’eliminació del gen PKH2 i la substitució de PKH1 per una versió que codifica una proteïna l’activitat de la qual resulta suprimida a 37 ºC. L’ús d’aquesta estratègia implica un estrès tèrmic per les cèl·lules de llevat, les quals responen activant la via de la CWI, on es troba implicada la via Pkh-Pkc1-MAPK. És per aquesta raó que en aquest treball s’ha utilitzat una estratègia diferent, desenvolupada al laboratori, la qual consisteix en l’obtenció d’una soca mutant en la que se li han suprimit els gens PKH1 i PKH3 i en la que s’ha col·locat un promotor regulable per doxiciclina que controla l’expressió de PKH2. Gràcies a aquesta soca hem pogut verificar per primera vegada que les proteïnes Pkh són necessàries per la fosforilació de Slt2 en front a diversos estressos de paret cel·lular. A més, s’han estudiat els canvis a nivell transcripcional provocats per la manca de les proteïnes Pkh, revelant que es produeix una resposta característica d’una situació d’estrès oxidatiu. En efecte, les cèl·lules sense activitat Pkh acumulen més ROS i aquest fet va acompanyat d’un procés de mort cel·lular programada independent de la metacaspasa del llevat Mca1, segons els anàlisis de TUNEL que s’han realitzat. Els fenotips d’estrès oxidatiu i mort cel·lular es veuen disminuïts en part, per l’activació de la via MAPK de Slt2 mitjançant l’expressió d’una versió constitutivament activa de la MAPKK Bck1 . Quelcom que afegeix complexitat a la regulació d’aquesta família de cinases, és el fet que alguns esfingolípids de cadena llarga o esfingolípids complexos de llevat, podrien regular la via de senyalització de Pkh1. Es coneix que les proteïnes Pkh tenen, a diferència de PDK1, un domini C-terminal molt més extens, de funció desconeguda, sense el domini PH, essencial per la unió de PtdIns(3,4,5)P3 en mamífers (que no sintetitza el llevat). Amb l’objectiu d’estudiar-ne la funcionalitat, s’han generat soques haploides on l’única activitat Pkh ve proporcionada per un plasmidi que porta la versió sencera de Pkh1 o bé una versió sense el domini C-terminal. Gràcies a aquestes soques hem identificat l’esfingolípid sulfàtid, no descrit en llevats, capaç d’unir-se específicament als últims 100 aa del domini no catalític de Pkh1. Aquest fet ens ha portat a estudiar el lipidoma del llevat, el qual s’ha separat per la tècnica de HPTLC, que ens ha permès identificar una fracció polar del lipidoma que s’uneix a Pkh1. A més hem determinat que el domini C-terminal de Pkh1 és responsable de la sensibilitat als inhibidors de la síntesis dels esfingolípids, indicant així que els esfingolípids podrien tenir un paper en l’activació de les proteïnes Pkh. A partir d’un assaig cinasa fet amb liposomes que contenen sulfàtid, hem vist que la unió amb sulfàtid té una efecte negatiu sobre la capacitat de Pkh1 de fosforilar el substrat PKBΔPH, a diferència de l’assaig realitzat amb liposomes que contenen la fracció polar del lipidoma, que no en modifiquen l’activitat., Pkh activity is essential for vegetative growth of yeast Saccharomyces cerevisiae and is mainly provided by Pkh1 and Pkh2. However, it is still largely unknown the set of cellular functions and the regulatory mechanisms of Pkh. With the aim of studying the functions of Pkh proteins in yeast, different research groups have used the approach consisting in the deletion of the gene PKH2 and replacement of PKH1 by a protein version whose activity is suppressed at 37 ºC. The use of this strategy involves a heat stress for yeast cells and, consequently, activation of the CWI pathway, where the Pkh-Pkc1-Slt2 MAPK pathway is involved. For this reason we have used a different strategy, developed in the laboratory, for this study, consisting in generate a mutant strain where PKH1 and PKH3 genes were deleted and PKH2 was placed under control of doxycycline-repressed promoter. The use of this strain allowed us to verify, for the first time, that Pkh proteins are required for the phosphorylation of Slt2 in response to several cell wall stresses. We have also studied the transcriptional changes caused by lack of Pkh proteins, revealing that there is a response similar to that induced by oxidative stress. Indeed, cells without Pkh activity accumulate ROS and this was accompanied by a process of programmed cell death that was independent of the yeast metacaspasa Mca1, according to performed TUNEL analysis. The phenotypes of oxidative stress and cell death were attenuated, at least in part, by the activation of the Slt2 MAPK by expression of a constitutively active version of MAPKK Bck1. An element that adds complexity to the regulation of this kinases family is that long-chain sphingolipids, or yeast complex sphingolipids, could regulate Pkh1 signaling pathway. It is known that Pkh proteins, unlike mammalian PDK1, have a larger C-terminal domain of unknown function that apparently lacks a PH domain, which is essential for the binding of PDK1 to PtdIns(3,4,5)P3 (a lipid that is not synthesized in yeast). In order to study the functions of this domain, we have generated haploid strains where the only Pkh activity is provided by a plasmid, which carries either the full Pkh1 or a version without its C-terminal domain. With these strains, we have identified a sphingolipid sulfatide, not described in yeast, able to specifically bind to the last 100 aa of the non- catalytic domain of Pkh1. This has led us to study the yeast lipidome, which was separated by HPTLC technique, allowing us to identify a polar fraction that binds to Pkh1. In addition, we determined that the C-terminal domain is responsible for sensitivity to inhibitors of sphingolipid synthesis pathway, indicating that sphingolipids may play a role in the activation of Pkh proteins. Pkh1 kinase assay with liposomes containing sulfatide indicated that binding of Pkh1 to the sulfatide has a negative effect on the Pkh1 activity when PKBΔPH was used as a substrate. In contrast, liposomes containing the polar lipidome fraction did not alter the Pkh1 activity.

[cat] Un programa de quatre setmanes d'exposició intermitent a hipòxia hipobàrica (HHI) de quatre hores per sessió, s'ha demostrat com un estímul eficaç per induir hematopoesi en rata, influir de manera variable en l'efecte angiogènic de diversos músculs (miocardi, tibialis anterior i diafragma) i preservar la pèrdua de massa corporal. Quatre grups experimentals van ser estudiats: hipòxic, Post-hipòxic 20 dies, Post-hipòxic 40 dies i els seus corresponents Controls, els quals s’uniren en un sol grup en no diferir entre si. Degut a l’augment de massa eritrocitària, seria d’esperar un increment de la viscositat de la sang. Tot i que s’observà una tendència coherent, les propietats hemoreològiques no van ser substancialment alterades, quan es van comparar els quatre grups entre si. Es proposen certs mecanismes compensatoris com serien el descens de la viscositat del plasma i possibles canvis microreològics eritrocítics (deformació i agregació). Malgrat l'increment del volum d'eritròcits i hemoglobina, els índexs indicadors de transport d'oxigen van ser similars per als grups experimentals. Es van estudiar paràmetres histoquímics-morfomètrics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.), bioquímics (enzim lactat deshidrogenasa, enzim citrat sintasa, mioglobina i proteïnes totals) i indicadors d'estrès oxidatiu (enzims CAT i SOD, i TBARS) per a cada un dels músculs a dalt esmentats. Per contrastar els resultats obtinguts després d'aplicar el protocol HHI amb unes condicions d’hipoxèmia sostinguda, es va dissenyar un procediment d’anemització que provoqués també una limitació en el subministrament d'oxigen als teixits. Es va dissenyar aquest protocol amb l'objectiu de no sotmetre els animals als efectes deleteris que indueix la hipòxia hipobàrica crònica. S’estudiaren paràmetres histoquímics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.) i bioquímics dels músculs soleus i extensor digitorum longus. Una situació d'hipòxia provoca un estat d'estrès en la majoria d'animals que la pateixen. Per tal d’afrontar aquesta baixa disponibilitat d'oxigen, l'organisme desenvolupa respostes compensatòries per fer front a aquesta nova situació. D’aquesta manera, és capaç de dur a terme ajustaments fisiològics i morfològics per tal de mantenir un mínim nivell de metabolisme aeròbic durant aquestes condicions de transport limitat d'oxigen als teixits. Aquests ajustaments segueixen el principi de simmorfosi, mitjançant el qual la formació d'elements estructurals en els organismes animals s'orienta a aconseguir una reestructuració equilibrada amb l'objectiu d'adaptar-se a les noves situacions, però mai sense excedir els requeriments funcionals necessaris. En els nostres estudis aquest principi significaria que, les respostes perifèriques (hemàtiques i reològiques) i centrals (ventilació i control cardíac) induïbles per una situació hipòxica, han estat acompanyades d'uns ajustaments en el bescanvi de gasos i en la capacitat oxidativa, especialment en múscul esquelètic i miocardi. Després de dur a terme els nostres protocols HHI i d’anemització podem concloure que, els reajustaments fisiològics i morfològics desencadenats en les dues condicions, poden ser utilitzats com a procediments que permetin orientar aquestes respostes adaptatives cap a canvis transitoris o permanents. Tots aquests canvis fisiològics tindrien múltiples aplicacions en medicina de muntanya, de l'esport i en d’altres futures aplicacions biomèdiques., [eng] An intermittent hypobaric hypoxia (IHH) program consisting of a daily 4-h sessions during four weeks of hypoxia exposure, has been proven as an effective stimulus to induce hematopoiesis in rats, influence in a variable way the angiogenic effect of various muscles (myocardium, tibialis anterior and diaphragm) and preserve the body mass loss. Four experimental groups were studied: hypoxic, post-hypoxic 20 days, post-hypoxic 40 days and their corresponding Controls. Due to the increase of red cell mass, an increase in blood viscosity would be expected. Although there was a consistent trend, the hemorheological properties were not substantially modified, when comparing the four groups. Some compensatory mechanisms are proposed such as the plasma viscosity decrease and microrheological erythrocyte changes. Despite the increase of volume of erythrocytes and hemoglobin, oxygen transport indicators rates were similar for the experimental groups. Histochemical, morphometric and biochemical parameters, as well as indicators of oxidative stress were studied for each muscle above mentioned. To compare the results obtained after applying the IHH protocol with sustained hypoxemia conditions, an anaemization procedure was designed to lead limitation in oxygen supply to tissues. This protocol was used in order to not submit the animals to the deleteric effects induced by chronic hypobaric hypoxia. Histochemical and biochemical parameters were also studied in soleus and extensor digitorum longus muscles. Hypoxia is a stressful situation for most animals. To cope with the oxygen requirements, the organism is able to perform physiological and morphological adjustments to maintain a minimum level of aerobic metabolism under conditions of poor oxygen delivery to the tissues. These adjustments follow the symmorphosis principle, which states that structural elements are formed to satisfy functional requirements without excess. In our studies, this principle would mean that peripheral and central responses, induced by a hypoxic situation, have been accompanied by some adjustments in gas exchange and oxidative capacity. After conducting our protocols IHH and anemia, we conclude that physiological and morphological adjustments triggered in the two different conditions can be used as procedures to lead these adaptive responses to transient or permanent changes. All these physiological changes would have multiple applications in mountain and sport medicine, and in other future biomedical applications.

En aquesta tesi es presenten un seguit de treballs on s'estudien aspectes patogènics de diferents taupaties tals com l'estrès oxidatiu, la fosforil·lació de la proteína tau, la malfunció de la degradació proteosomal, l'acúmul de factors de transcripció en les inclusions pròpies d'aquestes malalties i el truncatge i degradació de proteïnes.L'objectiu general de la tesi has estat el d'esbrinar els components proteics que, a més de la proteína tau, es troben segrestats en les inclusions de tau en les diferents taupaties. Les diferents taupaties estudiades han estat la malaltia d'Alzheimer, la paràlisi supranuclear progressiva, la malaltia de Pick i la malaltia dels grans argiròfils.La tesi mostra com la majoria de procesos neurodegenratius estudiats són compartits per totes aquestes malalties., The aim of this thesis has been focused on the study of the common factors that may lead to neuronal degeneration in a bunch of the most frequent tauopathies. We studied oxidative stress, tau phosphorylation and truncation, glia activation, and protein trapping inside tau inclusions.We have seen that most of the neurodegenerative factors studied are quite similar among tauopathies, suggesting a common pathogenic process.

El distrès oxidatiu és un desequilibri entre els sistemes oxidants i antioxidants. Aquests es poden alterar en diferents situacions fisiològiques i patològiques degut als RL. En aquest treball s'han estudiat: la insuficiència renal i el tractament amb eritropoetina, la malaltia pulmonar obstructiva crònica, la sèpsia i l'infart agut de miocardi. També l'embaràs i el tractament preventiu de l'anèmia amb ferro, l'envelliment, el gènere i l'estrès psicològic que provoca el període d'exàmens universitaris, juntament amb l'efecte de l'estil de vida en l'estrès oxidatiu.El distrès oxidatiu es quantifica amb la PDO (puntuació del distrès oxidatiu) i inclou la quantificació en sang dels següents biomarcadors: antioxidants de baix pes molecular [glutatió reduït (GSH)], enzims antioxidants [superòxid dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatió peroxidasa (GPx), glutatió reductasa (GR) i glutatió s-transferasa total, termoestable i % residual (T-GST, TS-GST i RGST)], productes de la peroxidació lipídica [substancies reactives a l'àcid tiobarbitúric (TBARS)], productes de la peroxidació proteica [glutatió oxidat (GSSG)] i marcadors de la susceptibilitat d'oxidació [hemòlisi].Hipòtesi: un model de puntuació global basat en biomarcadors indirectes és capaç de valorar el desequilibri entre els sistemes prooxidants i antioxidants tant en situacions de malaltia com fisiològiques, i permet detectar a què és degut el desequilibri en cada una de les situacions fisiopatològiques estudiades: a una major producció de RLO, a una disminució en la disponibilitat dels antioxidants, o a ambdues.Objectius: Definir, en la població sana, els rangs de normalitat pels biomarcadors sistèmics.Establir el pes dels biomarcadors estudiats en el model de puntuació global que ens ha de permetre valorar el grau de distrès oxidatiu en diferents situacions fisiològiques i patològiques. Aplicar el model de puntuació en diferents situacions fisiològiques i patològiques en desequilibri oxidatiu. I comparar la PDO amb un model estadístic de puntuació de discriminants.En individus control, la PDO es situa al voltant de zero punts, i en individus amb estrès oxidatiu, la PDO és superior a zero. Segons la PDO, els pacients amb IR no sotmesos a diàlisi tenen estrès oxidatiu, i aquest estrès es manté després de sis mesos de tractament amb EPO. També en tenen els pacients amb MPOC. En la sèpsia i l'IAM l'estrès oxidatiu apareix en el moment de l'ingrés hospitalari però no a les 24 i 48 hores, ni en el moment de l'alta. La PDO es manté als zero punts en homes i dones sans de tots els rangs d'edat. Les dones embarassades que prenen ferro tenen estrès oxidatiu a les 26 setmanes de gestació, i aquest és més elevat en les que no tenen anèmia. Els estudiants universitaris obtenen una PDO superior a zero abans i després dels exàmens universitaris, però l'estrès oxidatiu després és superior en els que no tenen hàbits de vida saludables.El test dels discriminants separara correctament els individus en grups utilitzant els paràmetres lligats al distrès oxidatiu i ens diu els biomarcadors que més s'alteren en cada situació estudiada. No obstant, ni indica quin dels grups té més estrès oxidatiu i quin és el grau d'estrès en cada individu, ni obté en un moment concret la puntuació d'estrès oxidatiu d'un sol individu.La PDO és un possible paràmetre clínic a tenir en compte a l'hora d'avaluar l'estrès oxidatiu de manera rutinària i individual, la seva aplicació és possible tant en el context de la malaltia com per al control d'altres situacions, com ara els efectes d'una vida no saludable. En tots dos casos, la informació que ens aporta el nostre mètode obre la porta a una possible prescripció de teràpia antioxidant, ja sigui de tipus farmacològica o dietètica., Numerous factors are related to oxidative stress (OS) in humans, which is particularly common in individuals with psychological or health problems. The following blood biomarkers were used to determine the oxidative status of healthy individuals: antioxidant enzymes [glutathione Stransferase (GST), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR)], peptide peroxidation products and low molecular weight antioxidants [reduced and oxidized glutathione (GSH, GSSG), GSSG/GSH ratio], lipid peroxidation products [thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)] and oxidizability measurements [haemolysis test]. The relationships between biomarkers were studied in a healthy group of individuals, and used to create a score of oxidative stress (SOS). SOS was clinically validated by applying it to a group of patients with chronic renal insufficiency (CRI), chronic obstructive pulmonary disease, sepsis, and acute myocardium infarction. SOS was also applyed in a various groups of healthy individuals and we studied the effect of sex, age, pregnancy, and lifestyle on oxidative stress. SOS was statistically validated with discriminating test. In conclusion, OS biomarkers were strongly related, and SOS was a useful clinical parameter for evaluating the effect of OS on the illness. This may be important in the future for preventing and treating OS with antioxidants.

TESILes procianidines són flavonoides (flavan-3-ols), de tipus oligomèric, que exerceixen efectes beneficiosos en malalties com càncer, diabetis, i malalties cardiovasculars, entre altres. Aquests efectes de les procianidines s'atribueixen, clàssicament, al seu caràcter antioxidant, eliminador d'espècies reactives d'oxigen (ROS), atès que en l'etiologia d'aquestes malalties sovint es descriu un estat associat d'estrès oxidatiu, degut a l'excés de ROS. No obstant, cal aprofundir en l'estudi dels efectes i mecanismes d'acció de les procianidines, que depassen ja aquest rol tradicional d'antioxidants, en mostrar recentment noves propietats que permeten ampliar el seu ventall d'actuació i de possibles aplicacions terapèutiques. L'objectiu principal de la tesi és, doncs, contribuir a entendre com les procianidines modulen l'equilibri redox cel·lular, tant a nivell de DNA com a nivell de l'expressió gènica d'enzims que formen part del sistema de defensa antioxidant en models d'estudi (in vivo i in vitro) induïts a estrès oxidatiu. Donat que les procianidines són força abundants en el vi negre, s'ha utilitzat com a font d'aquests compostos un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE).L'anàlisi in vitro de la capacitat antigenotòxica del GSPE, comparant-la amb la de flavonoides monomèrics mitjançant la tècnica del Comet assay, demostra que els flavonoides protegeixen el DNA de l'estrès oxidatiu, i que l'eficiència de la protecció es correlaciona estretament amb l'estructura del flavonoide. Així, les procianidines, d'estructura oligomèrica i que, per tant, posseeixen més centres reactius antioxidants respecte els seus monòmers base (catequina i epicatequina), són més efectives en la protecció contra el dany oxidatiu genòmic. No obstant, la quercetina, un flavonol descrit com estructuralment òptim per a desenvolupar un rol antioxidant, és el més efectiu entre els flavonoides analitzats. Tanmateix, l'efecte preventiu és més rellevant si, prèviament a induir les cèl·lules a estrès oxidatiu, incubem els flavonoides en el medi de cultiu. Per tant, el mecanisme d'eliminació de les ROS no és la via exclusiva d'actuació de les procianidines i dels altres flavonoides en la prevenció dels danys al DNA sinó que s'estimulen mecanismes d'adaptació cel·lular, com la modulació de l'expressió gènica dels enzims del sistema de defensa antioxidant. En aquests darrers, l'anàlisi in vitro de l'efecte de les procinidines en l'expressió gènica mostra una activació transcripcional de la glutatió peroxidasa (GPx), la glutatió S-transferasa (GST), i una regulació post-traduccional de la Cu,Zn-superòxid dismutasa (Cu,Zn-SOD) força marcada a la dosi de 15 mg/L de GSPE. Les condicions d'estrès oxidatiu s'estableixen per una disminució dels nivells de glutatió (GSH) associat a un alt índex de peroxidació lipídica. En aquestes condicions no hi ha una resposta coordinada del patró d'expressió dels enzims antioxidants malgrat que s'activen els enzims del cicle del glutatió.La pre-incubació dels hepatòcits amb procianidines prevé la disminució de glutatió, mantenint l'estat redox estable tot i exposar-los a condicions oxidants, probablement en activar els enzims limitants en la síntesi del glutatió, ajudant a regenerar-lo de nou. Aquest manteniment de l'estabilitat redox fa pensar que l'augment observat de les activitats dels enzims del cicle del glutatió comporten un enfortiment del sistema de defensa antioxidant contra possibles alteracions redox.Les procianidines regulen post-traduccionalment la Cu,Zn-SOD en un model in vivo d'hepatòcits de rata. Regulació que es confirma in vitro emprant cèl·lules Fao i que és molt marcada de nou a 15 mg/L, suggerint que aquesta dosi exerceix efectes més notables i que mereix ser estudiada en més profunditat. D'altra banda, les procianidines no exerceixen cap efecte modulador significatiu sobre el patró d'expressió gènica de la Cu,Zn-SOD in vivo, quan s'empren rates induïdes a diabetis, com a model d'estrès oxidatiu in vivo., Procyanidins are oligomeric flavonoids (flavan-3-ols), which exert a wide range of beneficial effects on many diseases such as cancer, diabetes and cardiovascular dysfunctions. The health-protective properties of procyanidins have mainly been attributed to their antioxidant activity, which involves mechanisms such as reactive oxygen species (ROS) scavenging. It is widely accepted that increased oxidative stress is involved in the development and progression of many diseases and their complications, because of excessive ROS generation. However, the effects of procyanidins and their mechanisms must be studied because it has been reported that, as flavonoid compounds, they can act as signaling molecules and these effects, in conjunction with their known antioxidant activity, will enable them to extend their roles and possible therapeutic applications.So the main aim of the thesis is to increase understanding of how procyanidins modulate the cellular redox equilibrium, both at the level of DNA and at the level of the gene expression of the antioxidant enzyme systems in oxidative stress-induced study models (in vivo and in vitro). Since procyanidins are mainly found in red wine, a grape seed procyanidin extract (GSPE) was used as a flavonoid source.The antigenotoxic GSPE capacity in vitro, compared with monomeric flavonoids by the Comet assay, demonstrates that flavonoids protect DNA against oxidative insult and that the efficiency is correlated with the flavonoid structure. In fact, procyanidins, which are made up of oligomeric units with more antioxidant reactive cores, and therefore have greater antioxidant capacity than their basic monomers (catechin and epicatechin), are more effective against oxidative genomic injury. On the other hand, quercetin, a flavonol whose structure has been reported to be optimum for an antioxidant role, is the most effective of all the flavonoids analyzed. However, the preventive effect of flavonoids is more significant if, before the cells are subjected to oxidative stress induction, we incubate the flavonoids in the culture medium. So ROS scavenging action is not the only means by which procyanidins and other flavonoids prevent oxidative insults to DNA but there is an enhancement of such cellular adaptation mechanisms as gene expression of the antioxidant defence system. In this sense, the in vitro analysis of the effect of procyanidins on gene expression shows a transcriptional activation of glutathione peroxidase (GPx) and glutathione S-transferase (GST) and a posttranslational regulation of Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD), which is particularly high at 15 mg/L of GSPE. The oxidative conditions are established by decreasing the glutathione (GSH) levels associated to high levels of lipid peroxidation. In these conditions there is no coordinated response of the gene expression profile although there is an enhancement of glutathione cycle-related enzyme activities.Pre-incubating the hepatocytes with procyanidins prevents the glutathione from decreasing, but keeps the redox status stable despite the oxidative conditions. This is probably due to of the fact that the rate-limiting enzyme for GSH synthesis is activated, which stimulates de novo synthesis of GSH. The fact that the redox stability is maintained suggests that the increase observed in the glutathione-related enzyme activities strengthens the antioxidant defence system against possible oxidative injuries.Procyanidins post-translationally regulate the Cu,Zn-SOD in an in vivo model of rat hepatocytes. This is also confirmed in an in vitro model using Fao cells and the regulation is again more enhanced at 15 mg/L, suggesting that this dose exerts greater effects and needs to be studied in more depth. On the other hand, procyanidins do not significantly modify the Cu,Zn-SOD gene expression profile in vivo, when t

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic.L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu.L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics., Small heat shock proteins (sHsps,15-30 kDa) are the most abundant and diversified Hsps in plants. They have been classified according to its homology and cellular localisation in: mitochondrial, chloroplastic, endoplasmic reticulum and class I and II citoplasmic sHsps. Although sHsps-CI are involved in the stress response and accumulate at some stages of embryonic development and there is abundant work correlating stress resisitance and sHsps accumulation, the molecular mechanisms of their activity are not well known. However, in vivo and in vitro chaperone activity under temperature stress has been described. 2D immunodetection patterns of cork oak (Quercus suber) sHsps-CI (thermic, hydric and oxidative). At the 17 kDa region there is a set of protein species highly induced by temperature and, at least some of them correspond to QsHsp17.4-CI. On the other hand, protein species at the ca. 10 kDa region are highly induced under oxidative stress conditions and accumulate in the endogenous oxidatively stressed tissues xylem and phellem but not after a heat shock. PCR and RT-PCR assays allowed us to clone three new members of the sHsps-CI multigenic family in cork oak. Among them, Qshsp10-CI is specially interesting because codes for a truncated protein that lacks 55% of the -crystallin domain and all the C-terminal extension, being the more C-terminal truncated sHsp reported to date. Overexpression of recombinant QsHsp10-CI and a more truncated protein lacking the whole -crystallin domain in E. coli cells shows that most of the -crystallin domain and all the C-terminal extension are dispensable, but amino acids 1 to 41 of the -crystallin domain (including the consensus II region) are essential for sHsps-CI protective activity under temperature and oxidative stress conditions. The expression of Qshsp10-CI in response to oxidative but not temperature stress and its protective activity of E. coli cells under oxidative stress conditions points to a correspondence between Qshsp10-CI and the ca. 10 kDa protein species detected in 2D immunodetections and a protective activity of those in the oxidatively stressed phellem cells. Endogenous oxidative stress of phellem cells might generate mutations accumulation in nucleic acids. Variability analyses of DNA and mRNA of phellem cells in the coding region of Qshsp17.4-CI showed a surprisingly high rate of mutation in both mRNA (1/1784 bp) and genomic DNA (1/1520 bp). These are the highest rates described for a nuclear eukariotic genome and are similar to those detected in RNA viruses. With these mutation rates one third of mRNAs of phellem cells would contain mutations and code for abnormal proteins. No mutations were detected in root tip, a normally growing young tissue. With the aim of deeping into the nature of mutations that accumulate in phellem cells, we applied a method to in vitro select mutant sequences using restriction enzymes. The types of mutation predominant in phellem cells mRNA were those related with oxidative stress in other systems (plasmids, phages and bacterial DNA). In addition, the predominant DNA lesions that accumulate in H2O2 treated cork oak plantlets, as shown by GC-MS analyses, generate the same type of mutations detected in mRNA of phellem cells. Accordingly, the high accumulation of mutations detected in phellem cells might be due to its endogenous oxidative stress. Moreover, young and actively growing tissues are also subjected to a certain degree of base lesions and mRNA mutations. However, both mutational spectrum and accumulation levels are different compared to oxidatively stressed tissues.