Search

Metalotioneini (MT) su citosolski proteini odgovorni za homeostazu esencijalnih metala, poput Zn i Cu, i detoksikaciju neesencijalnih metala, poput Cd. Cilj ovoga istraživanja bio je potvrditi vezanje ova tri metala na MT u citosolu jetre vardarskog klena (Squalius vardarensis Karaman) uzorkovanog u listopadu 2012. godine u Krivoj reci, onečišćenoj rudarskim otpadom, u sjeveroistočnoj Makedoniji. Primijenjeni analitički pristup sastojao se od sljedećih koraka: (1) usporednog frakcioniranja citosolskih proteina iz jetre klena i standarda MT na osnovu njihove molekulske mase primjenom visokodjelotvorne tekućinske kromatografije s isključenjem po veličini (SE-HPLC), koje je bilo praćeno određivanjem koncentracija odabranih metala u tako dobivenim proteinskim frakcijama pomoću spektrometra masa s induktivno spregnutom plazmom (ICP-MS) ; (2) frakcioniranja proteina prema molekulskoj masi pomoću ultrafiltera, sa svrhom odvajanja proteina molekulske mase >30 kDa, koje je bilo praćeno daljnjim frakcioniranjem tih proteina pomoću anionsko- izmjenjivačke kromatografije (AEX-HPLC) te određivanjem raspodjele profila metala u tako dobivenim frakcijama primjenom ICP-MS-a ; (3) analiziranja proteinskih frakcija dobivenih dvodimenzionalnim frakcioniranjem, koje sadrže metale Zn, Cu i Cd, pomoću masene spektrometrije (ESI-Q-TOF MS) s ciljem potvrđivanja prisutnosti MT. Primijenjeni analitički pristup omogućio je identifikaciju MT u proteinskim frakcijama citosola jetre klena koje sadrže Zn, Cu i Cd, što je u skladu s ulogom MT u homeostazi i detoksikaciji metala. Analitički pristup koji se zasniva na kombiniranoj primjeni različitih analitičkih metoda, poput dvodimenzionalnog razdvajanja proteina (SE-AEX-HPLC) povezanog s određivanjem metala (ICP-MS) i identifikacijom proteina (ESI-MS) predstavlja brz, osjetljiv i pouzdan alat za prepoznavanje citosolskih proteina koji vežu metale.

Budući da su prirodne koncentracije prijelaznih metala u rijekama vrlo niske, svaki dodatni unos utječe na njihovu koncentraciju i time mijenja prirodnu ravnotežu u vodenom okolišu. Metali nisu biorazgradivi te njihov unos predstavlja dodatnu prijetnju vodenim ekosustavima jer se mogu akumulirati u sedimentu ili živim organizmima (1). Procjena biološkog učinka metala obuhvaća i praćenje biomarkera izloženosti metalima, metalotioneina (MT). Ovi niskomolekulski citosolski proteini sudjeluju u održavanju homeostaze esencijalnih (Zn, Cu) i detoksifikaciji toksičnih metala (Cd, Hg, Ag), a njihova pobudna sinteza ukazuje na izloženost metalima (2). Pouzdana i osjetljiva elektrokemijska metoda određivanja MT u biološkim uzorcima je diferencijalna pulsna voltametrija (DPV). Prikazano istraživanje provedeno je tijekom jeseni, kao sezoni fiziološkog mirovanja nakon mrijesta Vardarskog klena (Squalius vardarensis L.), u makedonskim rijekama Zletovska i Kriva koje su onečišćene otpadnim vodama rudnika olova i cinka (rudnici Zletovo i Toranica) te Bregalnici koja nije izložena utjecaju rudarskih aktivnosti. Cilj istraživanja je procijeniti izloženost i biološke učinke metala praćenjem koncentracija metala i MT u citosolu probavila riba te koncentracija metala u riječnoj vodi. MT su određeni DPV, metodom po Brdički, koja se koristi za određivanje proteina koji sadrže tiolne skupine, uključujući MT (3). Mjerenje je provedeno na 797 Computrace (Metrohm) uređaju s troelektrodnim sustavom (radna elektroda (viseća živina kap), protuelektroda (platinska žica) i referentna elektroda (Ag/AgCl/3M KCl)) u amonijačnoj otopini kobaltove(III) soli (1M NH4Cl + 1M NH4OH, pH=9, 5 i 6 x10-4 M Co(NH3)6Cl3). Metoda se temelji na određivanju visine katalitičkog vala vodika pri potencijalu Ep = -1, 48 V, koji je proporcionalan koncentraciji MT. Kao kalibrant je korišten MT zečje jetre (Ikzus Proteomics) otopljen u 0.25 M NaCl. Na temelju toplinske stabilnosti, MT su određeni u toplinski obrađenom citosolu probavila klena. Koncentracije metala su izmjerene masenim spektrometarom visokog razlučivanja s induktivno spregnutom plazmom (HR ICP-MS). Statistički značajno povišene koncentracije MT (mg g-1) zabilježene su u riba iz Zletovske i Krive (3, 9 i 3, 3) koje su izložene utjecaju zagađenja iz rudnika Pb/Zn u odnosu na referentnu Bregalnicu (2, 1). Većina izmjerenih metala u riječnoj vodi i citosolu probavila Vardarskog klena također ima povišene koncentracije u rijekama pod utjecajem rudnika. Primjena DPV u praćenju promjena MT u biološkim uzorcima dokazana je kao osjetljiva metoda koja se koristi u biomonitoring studijama procjene izloženosti okoliša metalima.

Sustavno praćenje stanja okoliša mjerenjem bioloških promjena u indikatorskih organizama naziva se biomonitoring. S obzirom da se za razliku od organske tvari ne mogu razgraditi u okolišu, metali jednom unešeni u okoliš tu i ostaju te predstavljaju najopasnija zagađivala. Biomonitoring studije izloženosti metalima obuhvaćaju mjerenje metala u vodi i sedimentu te u indikatorskim organizmima. Ribe, kao organizmi na vrhu hranidbenog lanca u vodenom ekosustavu, su često korišteni indikatorski organizmi. Ribe unose metale putem škrga, probavila i kože, ali se neselektivno uz esencijalne metale akumuliraju i toksični. Jedna od ranih promjena na staničnoj razini organizma (biomarkeri) koja ukazuje na izloženost organizma metalima je pobudna sinteza metalotioneina (MT), citosolskih proteina odgovornih za homeostazu esencijalnih (Zn, Cu) i detoksifikaciju toksičnih metala (Cd, Hg, Ag) (1). Među različitim tehnikama mjerenja MT, elektrokemijska metoda diferencijalna pulsna voltametrija (DPV) predstavlja osjetljivu metodu određivanja MT u biološkim uzorcima. S obzirom da osim metala na koncentraciju MT utječu i drugi faktori, poput biometrije, fiziološkog stanja riba te abiotičkih faktora, istraživanje je provedeno u sezoni mrijesta i ubrzanog metabolizma Vardarskog klena (Squalius vardarensis L.) u makednoskim rijekama pod utjecajem otpadnih voda rudnika olova i cinka, Zletovska (rudnik Zletovo) i Kriva (rudnik Toranica). U riječnoj vodi su izmjereni metali, a u citosolu probavila klenova metali i MT kao biomarkeri izloženosti metalima te uspoređeni s referentom postajom, rijekom Bregalnicom na kojoj nema utjecaja otpadnih voda rudnika. DPV se temelji na difuzijom kontroliranom putovanju analita do površine živine elektrode. Depolarizacijski potencijal omogućava identifikaciju iona prisutnih u otopini, a mjerenjem difuzijske struje može se izračunati njihova koncentracija. Metodu je razvio češki kemičar Jaroslav Heyrovský te za nju 1959. dobio Nobelovu nagradu. Njegov student, Rudolf Brdička, je u svom radu 1933. otkrio da proteini s –SH skupinama daju karakterističan val i upravo se metoda po Brdički koristi za određivanje MT. Frakcija MT se izolira toplinskom obradom na 85°C, a mjerenje se provodi u otopini amonijačnog pufera (1M NH4Cl + 1M NH4OH), pH=9.5 koja sadrži 6x10-4 M Co(NH3)6Cl3 pri sljedećim mjernim parametrima na uređaju 797 Computrace (Metrohm): početni/završni potencijal: -0.9/-1.65 V ; amplituda/trajanje naponskog pulsa: 0.02502 V/0.057 s ; vrijeme ponavljanja promjene pulsa: 0.5 s ; brzina promjene potencijala: 0.005 Vs-1 (2). U proljetnom su periodu gotovo svi od 26 izmjenenih metala u vodi i citosolu povišeni u riba iz Zletovske i Krive u odnosu na Bregalnicu na kojoj nema rudarske aktivnosti. Biološki učinak ovih metala potvrđen je i značajno povišenim koncentracijama MT (mg g-1) u riba iz Zletovske i Krive (3, 1 i 2, 7) u odnosu na Bregalnicu (2, 0). DPV je potvrđena kao pouzdana metoda mjerenja MT u nativnim populacijama indikatorskih organizama.