Search

T- and B-lymphocytes usually express the human voltage-gated Kv1.3 channel (hKv1.3). Verapamil known as a potent L-type Ca2+channel blocker is also able to block hKv1.3 channels. The blocking effect of verapamil on currents through wild-type and six hKv1.3 mutant channels in the open and not in the inactivated state was determined using the whole-cell patch clamp technique. From the time course of the open channel block kon of verapamil was calculated. Comparing on-rates of different mutations helps to identify the interaction of different amino acid residues with verapamil reaching its blocking site. The on-rate of verapamil was not altered by a mutation to position 419. Mutations to position 417, 418, 346 and 346/418 had a moderate effect whereas a mutation to position 420 had a great effect and reduced kon ~ 6 fold. We conclude that position 420 in hKv1.3 channels strongly interacts with verapamil and is a presumed second binding site. Both positions 417 and 418 in hKv1.3 channels interfere with verapamil whereby mutation L418C only interferes with verapamil until verapamil has reached its blocking site. Position 419 does not interfere with verapamil at all. Mutant hKv1.3_L346C and hKv1.3_L346C_L418C mutant channels indirectly influenced verapamil’s ability to reach its binding site.

Diese Doktorarbeit gliedert sich in drei Teilprojekte, welche sich alle mit der strukturellen und funktionellen Charakterisierung von medizinisch-relevanten Proteinen (HMGA1a, NFKB1, Bs6) mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie beschäftigten. Projekt 1: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des durch Festphasensynthese hergestellten Kaliumkanalinhibitors, isoliert aus dem Gift von \(\textit {Buthus sindicus}\), Alpha-KTx 3.8 (Bs6) mittels homonuklearer 2D NMR-Spektroskopie, MD Simulation und elektrophysiologischer Messungen. Projekt 2: Heteronukleares NMR-Zuordnung des 2D [\(^1\)H,\(^{15}\)N] HSQC Spektrums und klassische Dynamikstudien (T\(_1\)/T\(_2\)/hetNOE) der Dimerisierungsdomäne des Transkriptionsfaktors NFKB1 (p50). Projekt 3: NMR-basierte Charakterisierung des dreidimensionalen Strukturensembles des intrinsisch ungefalteten Proteins HMGA1a und Untersuchung des Einflusses von post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) auf die globale Struktur und Funktion von HMGA1a.

TASK potassium channels control the membrane potential in many cell types and thus affect a plethora of cellular functions such as excitability of neurons and cardiac muscle, and secretion of aldosterone in the adrenal gland. Although commonly termed ‘leak channels’, TASK channels are highly regulated. Most importantly, they are strongly inhibited by a variety of hormones and neurotransmitters activating Gq-protein coupled receptors (GqPCRs). Despite extensive studies of TASK inhibition by the GqPCR-induced signaling cascade, the underlying mechanism of channel regulation has not been elucidated. Thus I aimed to unravel the second messenger responsible for GqPCR-mediated TASK channel inhibition and validate my findings from the heterologous expression system in cerebellar granule neurons. The signaling cascade induced by GqPCRs is initiated by activation of Gαq, which in turn stimulates phospholipase Cβ to hydrolyze the membrane phospholipid phosphatidylinositol( 4,5)bisphosphate producing the second messengers 1,2-diacylglycerol (DAG) and inostol( 1,4,5)trisphosphate. Using different approaches, I first established that phospholipase C is critical for GqPCR-mediated TASK channel inhibition. Next, I found that direct application of a DAG analog was sufficient to inhibit TASK channels. Accordingly, experimental attenuation of the DAG transients evoked by GqPCR stimulation diminished TASK channel inhibition, indicating that DAG is responsible for the current reduction following receptor activation. Because it had been previously established that a six amino acid motif within the proximal C-terminus is important for TASK channel regulation by GqPCRs, I compared the effects of GqPCR stimulation and DAG application on TASK channel proteins either truncated or mutated within this motif. A correlation of the sensitivities towards DAG and GqPCR activation further supported the hypothesis of DAG production as the underlying mechanism for the GqPCR-mediated effect. Lastly, to test whether native TASK-mediated currents were also inhibited by DAG, I probed application of this lipid on dissociated cerebellar granule neurons that express the TASK-mediated standing outward potassium current (IKSO). IKSO was inhibited by muscarinic receptor agonist as well as by direct application of DAG, producing a significant membrane depolarization. In conclusion, my findings demonstrate that DAG mediates the GqPCR-induced inhibition of TASK channels in an expression system as well as native, TASK-mediated currents. Thus, my data expand the view on the signaling effects of the small membrane lipid DAG and establish a link between DAG and cell excitability. Additionally, they may pave the way towards understanding the mechanism of DAG action on ion channels as atypical DAG effector proteins., TASK Kaliumkanäle tragen in vielen Zelltypen zur Generierung des Membranpotentials bei, wodurch sie zahlreiche zelluläre Funktionen beeinflussen. Obwohl TASK-vermittelte Ströme häufig als „Hintergrundleitfähigkeit“ bezeichnet werden, sind sie vielfach reguliert; unter anderem werden TASK Kanäle durch jene Hormone und Neurotransmitter gehemmt, welche Gαq/11-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GqPCR) aktivieren. Diese Kanalregulation spielt zum Beispiel für die Anpassung der Erregbarkeit von Nerven- und Herzmuskelzellen, wie auch für die Aldosteronsekretion in der Nebenniere eine Rolle. Trotz der physiologischen Bedeutung von TASK Kanälen und deren Inhibition konnte der zugrunde liegende Mechanismus für die GqPCRvermittelte Regulation noch nicht aufgeklärt werden. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, das verantwortliche Signalmolekül zu identifizieren und seinen Effekt auf zerebelläre Körnerzellen zu untersuchen. Die klassische GqPCRs Signalkaskade beginnt mit der Aktivierung von Gαq, welches die Phospholipase Cβ aktiviert. Diese spaltet daraufhin das Membranlipid Phosphatidylinositol( 4,5)bisphosphat zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol(1,4,5)trisphosphat. Mit verschiedenen experimentellen Ansätzen habe ich zuerst die Bedeutung der Phospholipase C für die GqPCR-vermittelte TASK Regulation herausgearbeitet. In weiterer Folge konnte ich zeigen, dass die direkte Applikation eines DAG-Analogons ausreicht, um den Kanal zu inhibieren. Die Abschwächung des durch Stimulation von GqPCRs erreichten DAG-Transienten durch Überexpression DAG-metabolisierender Enzyme reduzierte gleichermaßen die Inhibition der TASK Kanäle. Da bereits gezeigt wurde, dass ein sechs Aminosäuren langes Motiv im TASK C-Terminus essentiell für die GqPCR-vermittelte Inhibition ist, habe ich den Kanal in diesem Motiv mutiert und die Mutanten auf ihre DAG-Sensitivität untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen der Inhibition durch Aktivierung eines GqPCRs und der Applikation des DAG-Analogons und untermauern die vorangegangenen Resultate, dass die DAG Produktion der GqPCR-vermittelten TASK Inhibition zugrunde liegt. Um die Ergebnisse aus den heterolog exprimierenden Zellen im nativen System zu validieren, untersuchte ich den TASK-vermittelten Strom IKSO in dissoziierten zerebellären Körnerzellen. Sowohl die Aktivierung muskarinischer Rezeptoren, als auch die Applikation des DAG-Analogons führten zu einer deutlichen Reduktion des IKSO, welche mit einer Depolarisation der Zellmembran einher ging. Zusammengefasst zeigen meine Ergebnisse, dass DAG der verantwortliche second messenger in der GqPCR Signalkaskade ist, welcher zur Schließung der TASK Kanäle führt. Das erweitert die Sicht auf die Signalwirkung des kleinen Membranlipids DAG und betont den Zusammenhang zwischen DAG und zellulärer Erregbarkeit.

TASK potassium channels control the membrane potential in many cell types and thus affect a plethora of cellular functions such as excitability of neurons and cardiac muscle, and secretion of aldosterone in the adrenal gland. Although commonly termed ‘leak channels’, TASK channels are highly regulated. Most importantly, they are strongly inhibited by a variety of hormones and neurotransmitters activating Gq-protein coupled receptors (GqPCRs). Despite extensive studies of TASK inhibition by the GqPCR-induced signaling cascade, the underlying mechanism of channel regulation has not been elucidated. Thus I aimed to unravel the second messenger responsible for GqPCR-mediated TASK channel inhibition and validate my findings from the heterologous expression system in cerebellar granule neurons. The signaling cascade induced by GqPCRs is initiated by activation of Gαq, which in turn stimulates phospholipase Cβ to hydrolyze the membrane phospholipid phosphatidylinositol( 4,5)bisphosphate producing the second messengers 1,2-diacylglycerol (DAG) and inostol( 1,4,5)trisphosphate. Using different approaches, I first established that phospholipase C is critical for GqPCR-mediated TASK channel inhibition. Next, I found that direct application of a DAG analog was sufficient to inhibit TASK channels. Accordingly, experimental attenuation of the DAG transients evoked by GqPCR stimulation diminished TASK channel inhibition, indicating that DAG is responsible for the current reduction following receptor activation. Because it had been previously established that a six amino acid motif within the proximal C-terminus is important for TASK channel regulation by GqPCRs, I compared the effects of GqPCR stimulation and DAG application on TASK channel proteins either truncated or mutated within this motif. A correlation of the sensitivities towards DAG and GqPCR activation further supported the hypothesis of DAG production as the underlying mechanism for the GqPCR-mediated effect. Lastly, to test whether native TASK-mediated currents were also inhibited by DAG, I probed application of this lipid on dissociated cerebellar granule neurons that express the TASK-mediated standing outward potassium current (IKSO). IKSO was inhibited by muscarinic receptor agonist as well as by direct application of DAG, producing a significant membrane depolarization. In conclusion, my findings demonstrate that DAG mediates the GqPCR-induced inhibition of TASK channels in an expression system as well as native, TASK-mediated currents. Thus, my data expand the view on the signaling effects of the small membrane lipid DAG and establish a link between DAG and cell excitability. Additionally, they may pave the way towards understanding the mechanism of DAG action on ion channels as atypical DAG effector proteins.

Kalium-Kanäle der Zwei-Poren-Domänen Familie (KCNK, \(K_{2P}\)) sind \(K^{+}\)-selektive Kanäle, die sich spannungsunabhängig und spontan öffnen. Sie sind verantwortlich für den Hintergrund-\(K^{+}\)-Strom, der in den meisten erregbaren Zellen vorhanden ist und ihre Erregbarkeit reguliert. In der vorliegenden Studie wurden 6 KCNK-Kanäle pharmakologisch charakterisiert. Es wurde beobachtet, dass die Basalaktivität von manchen KCNK-Kanälen sowohl durch scharfe Substanzen als auch durch, in der Natur vorkommende, Terpene modifiziert werden kann. Im nächsten Schritt wurden Aminosäuren identifiziert, die in die Kanal-Ligand-Interaktionen involviert sind. Zuletzt wurde der Effekt von der scharf- und prickelnden Substanz Piperin auf die Hintergrund \(K^{+}\)-Leitfähigkeit trigeminaler Neurone der Maus untersucht. Dies zeigte, dass Piperin eine Depolarisierung in vielen Neuronen induziert. Diese Depolarisierung entsteht in vielen Neuronen durch die Hemmung der Hintergrund-\(K^{+}\)-Leitfähigkeit.

In der vorliegenden Arbeit wurden, mit Hilfe von \(\textit {in vitro}\) elektrophysiologischen Methoden an akuten Hirnschnitten von Ratten, umfassend beschriebene Effekte cholinerger Erregung auf CA1 Pyramidalneurone repliziert. Des Weiteren wurde zum ersten Mal für diese Neuronenpopulation gezeigt, dass cholinerge Aktivierung der Zellen sogenanntes persistierendes Feuern (PF) ermöglicht. PF wird als Kurzzeitgedächtnismechanismus betrachtet. Es ist die fortlaufende Erzeugung von Aktionspotentialen, obwohl ein kurzer, Aktionspotential-initiierender, elektrischer Stimulus beendet wurde, und obwohl die Zelle vor der elektrischen Stimulation keine Aktionspotentiale zeigte. PF schien von denselben Mechanismen mediiert zu werden, wie eine, bereits ausführlich beschriebene, epilepsiebezogene neuronale Aktivitätsform. Das Ausmaß cholinerger Aktivierung schien zu bestimmen ob die Zelle lediglich transiente, oder gedächtnisbezogene, oder epilepsiebezogene Aktivität zeigte.

Die Serum- und Glucocorticoid-induzierbare Kinase 3 (SGK3) erhöht die Oberflächenexpression zahlreicher Membranproteine. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus, durch den SGK3 die Oberflächenexpression des Kaliumkanals Kir2.2 erhöht, in Xenopus laevis Oozyten und einer Säugerzelllinie (COS-7) untersucht. Dazu wurden die Zwei-Elektroden-Spannungsklemme, luminometrische Oberflächen-Assays und Fluoreszenz-mikroskopie eingesetzt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen, durch die SGK3 die Oberflächenexpression von verschiedenen Membranproteinen und Transportern erhöht, wurde bereits beschrieben. Darunter die Phosphorylierung der Ubiquitin-Ligase Nedd4-2, die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors FOXO3a und die Phosphorylierung der Phosphoinositid-Kinase PIKfyve. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass keiner dieser Mechanismen für die erhöhte Anzahl von Kir2.2-Kanälen in der Membran verantwortlich ist. Sie lassen weiterhin den Schluss zu, dass SGK3 weder einen Effekt auf die Anzahl der endozytierten Kir2.2-Kanäle, noch auf die Anzahl der neu synthetisierten Moleküle hat. Mit einem auf Antikörpern basierenden Recycling-Assay konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der Kanäle während zweier dreißigminütiger Inkubationszeiten internalisiert und anschließend zurück an die Zellmembran transportiert wurde. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Ko-Expression einer konstitutiv aktiven SGK3-Mutante im Vergleich zu der Ko-Expression einer dominant-negativen Mutante zu einer erhöhten Anzahl von recycelten Kir2.2 Kanälen führte. Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen mit lebenden COS-7 Zellen und zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen zeigten, dass der Kaliumkanal Kir2.2, die Kinase SGK3 und das kleine G-Protein Rab7 in hohem Maße in PI(3)P positiven, endosomalen Kompartimenten kolokalisiert waren. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine SGK3-Mutanten, die nicht mehr in der Lage ist an PI(3)P zu binden, einen deutlich geringeren Effekt auf die Oberflächenexpression von Kir2.2 hat, als die Wildtyp-Kinase. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass die intrazelluläre Lokalisation von SGK3 an endosomalen Membranen eine wichtige Rolle für ihren Effekt auf Kir2.2 spielt. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse darauf hinweisen, dass SGK3 das Recycling von Kir2.2-Kanälen aus einem PI(3)P und Rab7 positiven Kompartiment stimuliert. Bei diesem Kompartiment handelt es sich um ein Zwischenstadium im Reifungsprozess von frühen zu späten Endosomen. Während des Recyclings zurück an die Zellmembrane werden die Kanäle wahrscheinlich durch das Rab11-positive Recycling Endosom geschleust., Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 (SGK3) increases the expression of various membrane proteins at the cell surface. In this study, the mechanism by which SGK3 increases the surface expression of the potassium channel Kir2.2 was investigated using two-electrode voltage clamp, luminometric surface expression measurements and fluorescence microscopy in a mammalian cell line (COS-7) and Xenopus laevis oocytes. A number of different mechanisms by which SGK3 increases the membrane expression of various channel and transporter proteins has been proposed, including phosphorylation of the ubiquitin ligase Nedd4-2, phosphorylation of the transcription factor FOXO3a and phosphorylation of the phosphoinositide kinase PIKfyve. The results obtained in this study suggest that none of these mechanisms is responsible for the increased surface expression of Kir2.2 induced by SGK3. They furthermore indicate that SGK3 neither affects the amount of endocytosed Kir2.2 channels nor the number of newly synthesized channel molecules. An antibody-based recycling assay showed that a substantial amount of Kir2.2 was internalized and recycled back to the plasma membrane during two 30 min time periods. It further indicated that coexpression of a constitutively active SGK3-mutant leads to an increased number of recycled channel proteins in comparison to coexpression of a dominant negative mutant. Live-cell fluorescence imaging with two different colors revealed that Kir2.2 channels, SGK3 and the small G-protein Rab7 were extensively colocalized in a PI(3)P positive endosomal compartment. Furthermore, frequent interactions of Kir2.2-positive, SGK3-positive or Rab7-positive vesicles with the Rab11-positive recycling endosome were observed. I line with these results, a mutant of SGK3 that does not bind to PI(3)P had a much smaller effect on Kir2.2 surface expression than the wild-type kinase, suggesting that the intracellular localization of SGK3 to endosomal membranes plays a crucial role for its effect on Kir2.2. Taken together, the results obtained in this study suggest that SGK3 promotes the recycling of Kir2.2 channels from a PI(3)P and Rab7-positive intracellular compartment that represents an intermediate stage of maturing early endosomes. The recycling of the channel back to the plasma membrane possibly occurs via Rab11 positive recycling endosomes.

We have studied some of the mechanisms responsible for controlling the density of Kir2.1 channels at the cell surface. In particular, we have explored the mechanisms underlying the of Kir2.1 channel into the endocytic pathway. We found that 1. The antibody uptake assay showed that about 20% of the antibodies labeled surface channels were internalized within 5 min of temperature shift; an apparent maximum was reached after 15 min. Kir2.1 undergoes constitutive internalization. 2. Co-expression of a dominant-negative mutant of dynamin K44A or AP180C enhanced the surface expression of Kir2.1 by 40% and 49% respectively. AP180C inhibited clathrin mediated internalization of Kir2.1 by 80% compared with COS-7 cells transfected with Kir2.1 and a control vector. Kir2.1 is internalized by clathrin-mediated endocytosis. 3. In both Xenopus oocytes and mammalian cells system, disruption of Y242 and Y341 motif significantly increased the amount of Kir2.1 at cell surface respectively. The mutants Y242A and Y341A also showed dramatic decrease in the rate of endocytosis as compared to wild-type Kir2.1 channels respectively. Two tyrosine based endocytic motifs 242YIPL245 and 341YSRF344 in the C-terminal domain of Kir2.1 are both involved in the endocytosis of Kir2.1. 4. Live cell imaging clearly showed that Kir2.1 channels strongly colocalized with early endosomal marker, Rab5 or late endosomal marker, Rab7 or recycling endosome marker, Rab11 or Lyso-Tracker Red. Kir2.1 is targeted to the endosome-lysosomal and endosomal- recycling pathway. 5. The two endocytosis signals studied here are in close vicinity as indicated by the tertiary structure of the cytosolic pore of Kir2.1 channels. Since mutation of both motifs had the similar effect as mutation of only one of these motifs. We hypothesize that both signals must be present for efficient constitutive endocyosis to occur.

Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 (SGK3) increases the expression of various membrane proteins at the cell surface. In this study, the mechanism by which SGK3 increases the surface expression of the potassium channel Kir2.2 was investigated using two-electrode voltage clamp, luminometric surface expression measurements and fluorescence microscopy in a mammalian cell line (COS-7) and Xenopus laevis oocytes. A number of different mechanisms by which SGK3 increases the membrane expression of various channel and transporter proteins has been proposed, including phosphorylation of the ubiquitin ligase Nedd4-2, phosphorylation of the transcription factor FOXO3a and phosphorylation of the phosphoinositide kinase PIKfyve. The results obtained in this study suggest that none of these mechanisms is responsible for the increased surface expression of Kir2.2 induced by SGK3. They furthermore indicate that SGK3 neither affects the amount of endocytosed Kir2.2 channels nor the number of newly synthesized channel molecules. An antibody-based recycling assay showed that a substantial amount of Kir2.2 was internalized and recycled back to the plasma membrane during two 30 min time periods. It further indicated that coexpression of a constitutively active SGK3-mutant leads to an increased number of recycled channel proteins in comparison to coexpression of a dominant negative mutant. Live-cell fluorescence imaging with two different colors revealed that Kir2.2 channels, SGK3 and the small G-protein Rab7 were extensively colocalized in a PI(3)P positive endosomal compartment. Furthermore, frequent interactions of Kir2.2-positive, SGK3-positive or Rab7-positive vesicles with the Rab11-positive recycling endosome were observed. I line with these results, a mutant of SGK3 that does not bind to PI(3)P had a much smaller effect on Kir2.2 surface expression than the wild-type kinase, suggesting that the intracellular localization of SGK3 to endosomal membranes plays a crucial role for its effect on Kir2.2. Taken together, the results obtained in this study suggest that SGK3 promotes the recycling of Kir2.2 channels from a PI(3)P and Rab7-positive intracellular compartment that represents an intermediate stage of maturing early endosomes. The recycling of the channel back to the plasma membrane possibly occurs via Rab11 positive recycling endosomes.

Der exakte Mechanismus, welcher die Regulation der Oberfächenexpression des Kaliumkanals Kir2.1 beschreibt, ist bisher nicht abschließend aufgeklärt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, wie die Kir2.1-Oberflächenexpression gesteuert wird, indem der Kanal durch den Clathrin-abhängigen Endozytoseweg der Zelle geschleust wird und welche Signalsequenzen in Kir2.1 dabei eine Rolle spielen. Folgende Beobachtungen unterstützen diese Annahme. 1. Hämagglutinin-markierte Kir2.1-Kanäle werden zeitabhängig endozytiert. Dabei wurden 5 min nach Induzierung der Endozytose durch Temperaturerhöhung ca. 20 % der Antikörper-markierten Kanäle von der Zelloberfläche internalisiert und nach 30 min wurde ein Maximum erreicht. Dies deutet darauf hin, dass Kir2.1 konstitutiv endozytiert wird. 2. Die Koexpression der dominant-negativen Endozytosefaktoren Dynamin-K44A und AP180C erhöhte die Oberflächenexpression von Kir2.1 um 40 % bzw. 49 %. In COS-7 Zellen inhibierte AP180C die Internalisierung von Kir2.1 um 80 % verglichen mit der Kontrolle. Diese Beobachtungen zeigen, dass Kir2.1 Clathrin-abhängig endozytiert wird. 3. Sowohl in Xenopus Oozyten als auch in Säugerzellen führte die Mutation der Tyrosine Y242 und Y341 zu einer signifikanten Erhöhung der Kir2.1 Oberflächenexpression durch eine starke Verringerung der Endozytoserate. Beide Tyrosine bilden jeweils ein klassisches, Tyrosin-basiertes Endozytosemotiv, 242YIPL245 und 341YSRF344, im C-Terminus von Kir2.1. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass beide Motive bei der Endozytose des Kanals eine wichtige Rolle spielen. 4. Lokalisationsanalysen von fluoreszenzmarkierten Kir2.1-Kanälen in lebenden Zellen zeigten eine klare Kolokalisation von Kir2.1 mit Markern für frühe (Rab5) und späte Endosome (Rab7) sowie Lysosome (LysoTracker), aber auch mit Markern für Recycling-Endosomen (Rab11). Dies verdeutlicht, dass Kir2.1 durch den endosmal-lysosomalen sowie den endosomalen-recycling Transportweg geschleust wird. 5. Die 3D-Struktur der zytosolischen Pore von Kir2.1 zeigt, dass die beiden Endozytosemotive, die in dieser Studie untersucht wurden, sich in räumlicher Nähe befinden. Da die Mutation von beiden Motiven einen ähnlichen Effekt auf die Oberflächenexpression hatte, wie die Mutation von einem der beiden Motive, liegt die Schlussfolgerung nahe, dass beide Motive eine Voraussetzung für die effiziente, konstitutive Endozytose von Kir2.1 sind., We have studied some of the mechanisms responsible for controlling the density of Kir2.1 channels at the cell surface. In particular, we have explored the mechanisms underlying the of Kir2.1 channel into the endocytic pathway. We found that 1. The antibody uptake assay showed that about 20% of the antibodies labeled surface channels were internalized within 5 min of temperature shift; an apparent maximum was reached after 15 min. Kir2.1 undergoes constitutive internalization. 2. Co-expression of a dominant-negative mutant of dynamin K44A or AP180C enhanced the surface expression of Kir2.1 by 40% and 49% respectively. AP180C inhibited clathrin mediated internalization of Kir2.1 by 80% compared with COS-7 cells transfected with Kir2.1 and a control vector. Kir2.1 is internalized by clathrin-mediated endocytosis. 3. In both Xenopus oocytes and mammalian cells system, disruption of Y242 and Y341 motif significantly increased the amount of Kir2.1 at cell surface respectively. The mutants Y242A and Y341A also showed dramatic decrease in the rate of endocytosis as compared to wild-type Kir2.1 channels respectively. Two tyrosine based endocytic motifs 242YIPL245 and 341YSRF344 in the C-terminal domain of Kir2.1 are both involved in the endocytosis of Kir2.1. 4. Live cell imaging clearly showed that Kir2.1 channels strongly colocalized with early endosomal marker, Rab5 or late endosomal marker, Rab7 or recycling endosome marker, Rab11 or Lyso-Tracker Red. Kir2.1 is targeted to the endosome-lysosomal and endosomal- recycling pathway. 5. The two endocytosis signals studied here are in close vicinity as indicated by the tertiary structure of the cytosolic pore of Kir2.1 channels. Since mutation of both motifs had the similar effect as mutation of only one of these motifs. We hypothesize that both signals must be present for efficient constitutive endocyosis to occur.

Die spannungsabhängigen Kaliumkanäle Kv7 werden unter anderem in Herz, Gehirn und Innenohr exprimiert. Hier wurde die Interaktion zwischen Kv7.1/KCNE1-Kanälen und dem regulatorischen Lipid PI(4,5)P2 untersucht. Potentielle Interaktionsstellen wurden in den intrazellulären S2-S3- und S4-S5-Linkern und in der intrazellulären Region von S6 identifiziert. Molekulardynamik (MD)-Simulationen zeigten eine Stabilisierung von Spannungssensor-Domäne, Domänenverbindung und S6. PI(4,5)P2-Regulation war in krankheitsassoziierten Mutanten gestört. Weiterhin wurde die Regulation von Kv7.4 durch das Lipid PI(3,5)P2 und die synthetisierende Kinase PIKfyve untersucht. Tatsächlich regulierten PIKfyve und PI(3,5)P2 die Kanäle. Die Ergebnisse wiesen auf einen komplexen Mechanismus mit unbekannten Komponenten hin. Die Region vor S1 war wichtig für diese Regulation. MD Simulationen zeigten kleine strukturelle Veränderungen in der Porendomäne aber nicht in der vermuteten Bindestelle.

Cochlear outer hair cells (OHCs) are characterised by the voltage-dependent K+ conductance IK,n that previously was shown to be mediated by KCNQ4 (Kv7) channel subunits. IK,n/KCNQ4 dominates the electrical properties of the OHC cell membrane and furthermore is essential for OHC survival. Genetic deletion of KCNQ4 causes progressive degeneration of OHCs and deafness. Similarly, KCNQ4 loss-of-function mutations cause the progressive form of hereditary deafness DFNA2. The molecular mechanism leading to OHC degeneration remains elusive, but the survival of OHCs has been linked directly to KCNQ4 channel function. Strikingly, the loss of OHCs is phenotypically similar to OHC degeneration caused by ototoxic substances and noise damage (acquired hearing loss), but a role of IK,n/KCNQ4 in acquired hearing loss has never been investigated so far. In the present study I investigated the pathophysiological relevance of IK,n for OHC degeneration caused by aminoglycoside (AG) antibiotics. Since KCNQ4 channel function is essential for OHC survival, chemical current augmentation may provide a protective strategy against KCNQ4-related hearing loss. Thus, I analysed whether chemical KCNQ channel openers rescued IK,n currents from pathological inhibition. In brief, I found that AGs rapidly entered OHCs and that entry was necessary for IK,n current inhibition. The inhibition was caused by functional depletion of phospholipids by the AGs that are essential for the function of IK,n/KCNQ4. Various AGs exhibit different ototoxic potential, i.e. neomycin causes OHC degeneration whereas gentamicin damages vestibular hair cells. Strikingly, the degree of IK,n inhibition (neomycin > gentamicin) correlated with the phospholipid binding efficiency and with the ototoxic potential of the respective AG. Given the dependence of OHCs on IK,n, the ototoxic potential of AGs thus may be determined by their chemical nature and by their inhibitory impact on IK,n. Furthermore, I showed that IK,n was sensitive to current augmentation by chemical KCNQ channel openers. A combination of openers rescued IK,n from AG-induced inhibition to wild-type levels indicating full restoration of IK,n activity. Most DFNA2 patients are heterozygous carriers of KCNQ4 mutations that reduce IK,n through a dominant-negative effect. This reduction of IK,n activity causes OHC degeneration. Residual currents in the dominant-negative situation were essentially rescued to wild-type levels by the application of KCNQ channel openers, at least in a heterologous expression system. The current rescue indicated that KCNQ channel openers might be used to stabilise IK,n in heterozygous DFNA2 patients. In summary, the present work demonstrated for the first time a role of the essential OHC K+ conductance IK,n in acquired hearing loss. The dependence of OHCs on IK,n may explain the high vulnerability of OHCs towards ototoxic influences. IK,n current augmentation by chemical KCNQ openers may be used to stabilise IK,n in OHCs and protect the sensory cells from KCNQ4-related degeneration. KCNQ openers rescued IK,n from AG-induced inhibition in OHCs and recombinant KCNQ4 from dominant-negative inhibition by mutant subunits. However, it remains elusive whether chemical KCNQ agonists alleviate OHC degeneration and protect from hearing loss., Äußere Haarsinneszellen (ÄHZ) des Corti´schen Organs im Innenohr werden biophysikalisch charakterisiert durch den K+ Strom IK,n, dessen molekulare Grundlage der spannungsabhängige K+ Kanal KCNQ4 (Kv7.4) ist. IK,n/KCNQ4 dominiert die elektrischen Eigenschaften der ÄHZ Zellmembran und ist darüber hinaus essentiell für das Überleben der Zellen. Im knock-out Tiermodell führte der Verlust der KCNQ4 Kanalaktivität zum Untergang der ÄHZ und zu Taubheit. Dies ist klinisch bedeutend, da im Menschen KCNQ4 Mutationen die Ursache für die erbliche Taubheit DFNA2 sind. Der Mechanismus, der zum Haarzelluntergang führt, ist noch unklar, doch korreliert das Überleben von ÄHZ direkt mit der Funktion von KCNQ4. Obwohl der durch Giftstoffe oder Lärm bewirkte Haarzelluntergang (erworbener Hörverlust) dem KCNQ4-bedingten ÄHZ Verlust ähnelt, wurde eine Verbindung zwischen IK,n/KCNQ4 und erworbenem Hörverlust bisher noch nicht experimentell erfasst. In der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der pathophysiologischen Rolle von IK,n/KCNQ4 in klinisch relevantem Haarzelluntergang beschäftigt, der durch Aminoglykosid (AG) Antibiotika hervorgerufen wird. Des Weiteren wurde untersucht, ob chemische KCNQ Kanalöffner die Funktion von IK,n trotz pathophysiologisch relevanter Inhibition wiederherstellen können, um eventuell Protektion der ÄHZ zu ermöglichen. Ich konnte erstmalig zeigen, dass AG Antibiotika schnell in Haarzellen eindringen und IK,n inhibieren. Die Inhibition war darauf zurückzuführen, dass AG über elektrostatische Wechselwirkungen negativ geladene Phospholipide funktionell depletieren, die für die Funktion von IK,n essentiell sind. Verschiedene AG zeigen unterschiedliches ototoxisches Potential: Neomycin führt zum Untergang von ÄHZ, während Gentamycin vestibuläre Haarzellen schädigt. Das Ausmaß der IK,n Kanalinhibition korrelierte (Neomycin > Gentamycin) mit dem Grad der Phospholipid Bindung und mit dem ototoxischen Potential der AG. Dies legt nahe, dass die hohe Anfälligkeit der ÄHZ gegenüber Neomycin auf die Inhibition von IK,n zurückzuführen ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von IK,n durch chemische KCNQ Kanalöffner verstärkt wird. Die AG-induzierte Hemmung von IK,n konnte aufgehoben und die Kanalaktivität vollkommen wiederhergestellt werden. In heterozygoten DFNA2 Patienten werden IK,n Ströme durch einen dominant-negativen Effekt mutierter KCNQ4 Kanaluntereinheiten verringert, was den ÄHZ Untergang bewirkt. Es ist mir im heterologen System gelungen, mittels chemischer KCNQ Kanalöffner KCNQ4 von dieser dominant-negativen Inhibition zu befreien. Die Ströme in Gegenwart der Kanalöffner waren vergleichbar mit Strömen unter Kontrollbedingungen, was gleichbedeutend mit der vollständigen Wiederherstellung der Kanalfunktion war. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ich in dieser Arbeit erstmals eine Rolle der Kaliumleitfähigkeit IK,n in erworbenem Hörverlust demonstrieren konnte. Dies kann die verstärkte Anfälligkeit von ÄHZ gegenüber ototoxischen Einflüssen erklären. Darüber hinaus stabilisieren chemische Kanalöffner IK,n in Anwesenheit von AG und stellen die Funktion von rekombinanten KCNQ4 Kanälen trotz dominant-negativer Inhibition wieder her. Dies könnte Haarzellen vor KCNQ4-bedingtem Untergang schützen. Es bleibt allerdings offen, ob die Substanzen den Verlust der ÄHZ verzögern und Taubheit abwenden können.

Cardiac GIRK channels are composed of Kir3.1 and Kir3.4 subunits and contribute to vagally induced bradycardia. Here, the effects of altered subunit expression ratios on cardiac GIRK currents were studied using adenovirally induced overexpression and RNA interference in primary cultured atrial myocytes of adult rats. We show that \(Na^{+}\)-dependent activation of GIRK channels is restricted to Kir3.4 homomers. Adenovirus-driven RNA interference specifically targeting Kir3.1 and Kir3.4 resulted in both cases in parallel reduction of Kir3.1 and Kir3.4 mRNA, suggesting a co-regulation of transcription. To study the role of GIRK channel regulation in chronic atrial fibrillation (cAF), \(Na^{+}\)-sensitivity of GIRK currents in atrial myocytes of cAF patients were compared to normal sinus rhythm (SR). The receptor dependent GIRK current in SR-myocytes increased with \([Na^{+}]_{i}\). This \(Na^{+}\)-sensitivity was impaired in cAF, suggesting decreased Kir3.4 expression due to cAF induced remodeling processes.

Cardiac GIRK channels are composed of Kir3.1 and Kir3.4 subunits and contribute to vagally induced bradycardia. Here, the effects of altered subunit expression ratios on cardiac GIRK currents were studied using adenovirally induced overexpression and RNA interference in primary cultured atrial myocytes of adult rats. We show that Na+-dependent activation of GIRK channels is restricted to Kir3.4 homomers. Adenovirus-driven RNA interference specifically targeting Kir3.1 and Kir3.4 resulted in both cases in parallel reduction of Kir3.1 and Kir3.4 mRNA, suggesting a co-regulation of transcription. To study the role of GIRK channel regulation in chronic atrial fibrillation (cAF), Na+-sensitivity of GIRK currents in atrial myocytes of cAF patients were compared to normal sinus rhythm (SR). The receptor dependent GIRK current in SR-myocytes increased with [Na+]i. This Na+-sensitivity was impaired in cAF, suggesting decreased Kir3.4 expression due to cAF induced remodeling processes.

In der vorliegenden Arbeit wurde die schnelle Desensitisierung von Agonisten-aktivierten GIRK-Kanälen analysiert. Simultane FRET- und Ganzzell-Ableitungen wurden durchgeführt, um zugrunde liegende molekulare Ereignisse innerhalb von Millisekunden zu untersuchen. Mittels elektrophysiologischer Messungen von fusionierten Kanaluntereinheiten konnte gezeigt werden, dass kinetische Eigenschaften der GIRK-Ströme sowohl von der Stöchiometrie der G-Protein-Untereinheiten als auch von der GIRK-Kanal Zusammensetzung abhängig sind. Diese Ergebnisse deuten auf zwei unterschiedliche, aber additive Mechanismen hin. Beide Mechanismen werden durch RGS4 vermittelt, unterscheiden sich aber in ihrem zeitlichen Verlauf. Die schnellere Komponente wird durch Strom-abhängige Veränderungen der elektrochemischen Triebkraft verursacht. Die langsamere Komponente dagegen spiegelt eine Desensitisierungskomponente wieder, die durch die GTPase-Aktivität des RGS Proteins vermittelt wird. In the present study, a FRET-based approach was used for studying acute desensitization of agonist-activated GIRK current. Simultaneous FRET-recordings and whole-cell measurements of current were performed to analyse underlying molecular events in a range of milliseconds. Whole-cell recordings using tagged channel subunits revealed that current kinetics depend on the stoichiometry of G protein subunits and on the composition of GIRK channels. We suggest that two distinct, but additive mechanisms contribute to acute desensitization of GIRK current. Both mechanisms depend on RGS4, but differ in their time course. The fast desensitizing component is caused by current-dependent changes in the electrochemical driving force for potassium ions. The slower desensitizing component, a \(\textit {bona fide}\) signalling mechanism, could be detected on protein level in the presence of RGS4 and corresponds to previous publications suggesting that acute desensitization is promoted by the GTPase activity of RGS4.

Die Rolle von Pannexin1 und Pannexin2 im zentralen Nervensystem wurde auf molekularer und funktioneller Ebene untersucht. Es wurde gezeigt, dass eine akzessorische Kaliumkanaluntereinheit, Kv\(\beta\)3, mit Panx1 interagiert und die Wirkung von Pharmaka durch diese Interaktion moduliert wird. Diese beiden Proteine sind in retinalen Ganglienzellen koexprimiert. Des Weiteren wurde die Bedeutung der Cysteine von Pannexin1 für dessen Funktion als Ionenkanal und der Einfluss von Reduktionsmitteln auf die Kanaleigenschaften untersucht. Mutationen einzelner Cysteine führen zu einem Hemikanal mit erhöhter oder erniedrigter Aktivität. Es wurde ein Pannexin2 spezifischer Antikörper hergestellt, mit Hilfe dessen die Expression im zentralen Nervensystem sowie die subzelluläre Lokalisation des Proteins analysiert wurden. Pannexin2 ist in Neuronen in weiten Bereichen des Gehirns vorzufinden. Es liegt vor allem intrazellulär vor, aber geringe Mengen konnten auch in der Plasmamembran nachgewiesen werden.

RNA Interferenz stellt eine weit verbreitete Methode zur funktionellen Charakterisierung von Genen dar, die jedoch an ausdifferenzierten Zellen nur unzureichend etabliert ist. Die vorliegende Arbeit beschreibt RNA Interferenz an ausdifferenzierten, postmitotischen Herzmuskelzellen unter Verwendung adeno-viraler Vektoren, die, unter Kontrolle des murinen U6 Promoters, eine Transkription von endogenen siRNAs vermitteln. Die effiziente Inaktivierung (> 90 %) eines Transgens (EGFP) sowie eines Gens, das für die endogene Untereinheit Kir2.1 eines einwärts gleichrichtenden Ionenkanals (I\(_{K1}\)) kodiert, erfolgte innerhalb von 6 bis 8 Tagen. Die Verminderung des Stromes I\(_{K1}\) führte zu einer Depolarisation des Membranruhepotentials sowie in einigen Zellen zu einem Schrittmacher-ähnlichen Phänotyp. Weiterhin führte die Reduktion des Hintergrundstromes I\(_{K1}\) zu einer Zunahme des muskarinergen Stromes I\(_{K(ACh)}\) , anhand derer der Nachweis einer stromabhängigen Interaktion nativer K\(_{ir}\)-Kanäle gezeigt wurde. RNA interference (RNAi) by short double-stranded RNA (siRNA) represents a frequently used technique for gene silencing to study gene function. Thus far, successful application of RNAi in highly differentiated cells \(\textit {in vitro}\) is sparse. This work demonstrates feasibility of RNAi in highly differentiated, postmitotic cardiac myocytes using adenovirus-driven transcription of siRNA hairpins under murine U6 promoter control. Efficient knockdown (> 90%) of a transgene (EGFP) or an endogenous gene encoding for Kir2.1, a subunit of an inward-rectifier channel that contributes to the current I\(_{K1}\), was demonstrated \(\textit {in vitro}\) within 6 to 8 days. Suppression of I\(_{K1}\) caused a depolarization of the membrane potential and generated, in a fraction of cells, a pacemaker-like phenotype. Moreover, ablation of I\(_{K1}\) was paralleled by an increase in amplitude of I\(_{K(ACh)}\). Evidence could be provided that this interference between K\(_{ir}\) channels is due to current-dependent K\(^{+}\)-accumulation/depletion.