El llevat metilotròfic Pichia pastoris (genere Komagataella) s’ha convertit en una de les plataformes cel·lulars més populars per produir proteïnes d’interès industrial, la majoria de les quals es secreten extracel·lularment per facilitar el posterior procés de purificació. La secreció de proteïnes heteròlogues fora de la cèl·lula està mediada per la via secretora, una ruta que engloba diversos passos i té diferents orgànuls interconnectats per aconseguir una secreció eficient. Tanmateix, quan P. pastoris es veu obligat a produir proteïnes heteròlogues, el correcte funcionament de la via de secreció podria veure’s compromesa. En aquest context, s’han realitzat diferents estudis per identificar colls d’ampolla específics i maximitzar la producció de proteïnes. Es va identificar la translocació de proteïnes del citoplasma al reticle endoplasmàtic (ER) com un coll d’ampolla precoç important que es troba a la via secretora. El pas de translocació sol estar mediat per un pèptid senyal que es troba al N-terminal de la proteïna a traduir. Depenent de la seqüència senyal, aquest pas es pot realitzar mentre la proteïna es tradueix (translocació co-traduccional) o després de la traducció (post-traducció). A més, la senyal de secreció ha de contenir l’anomenada regió ‘pro’ per mediar una ràpida exportació de la proteïna recombinant des del ER al Golgi per tal que s’acabi secretant. A la primera part d’aquest estudi, ens vam centrar en l’enginyeria i la caracterització del pèptid senyal de secreció com a estratègia per millorar la secreció de proteïnes recombinants. Per tal de comparar-les, hem utilitzat el senyal de secreció de Saccharomyces cerevisiae anomenat ‘alfa mating factor’ (α-MF) que és el senyal de secreció més comú utilitzat per la comunitat científica per secretar proteïnes recombinants en P. pastoris. Es diu que aquest senyal de secreció condueix proteïnes mitjançant la traducció post-traduccional. Com a resultat, si el α-MF es fusiona amb una proteïna que es pot plegar en el citosol del llevat, és possible que la proteïna no pugui travessar el translocó del ER i entrar a la via secretora. La solució va ser substituir la seqüència senyal pre-α MF per la seqüència senyal pre-Ost1, que dirigeix la translocació de forma co-traduccional a través del ER, garantint així que les proteïnes heteròlogues només es pleguin després d’arribar al lumen del ER. Addicionalment, la pro-regió del α-MF contenia una regió propensa a l’agregació, que va ser fàcilment eliminada mitjançant l’intercanvi d’una treonina per una serina en la posició 42 (Ser42). Aquest senyal de secreció híbrid resultant va augmentar dràsticament la producció de tres proteïnes models diferents utilitzades en aquesta tesi: una proteïna model fluorescent anomenada E2-Crimson i dues lipases diferents d’interès industrial anomenades Lipasa 2 de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) i Lipasa de Rhizopus oryzae (ROL). Més important encara, es van provar aquestes troballes a escala bioreactor, obtenint així resultats similars als observats a escala matràs. En particular, les soques amb el senyal de secreció millorat van tenir un millor rendiment cel·lular en comparació amb l’α-MF. En resum, s’ha proposat un nou senyal de secreció híbrid per substituir el senyal de secreció α MF com a estàndard predeterminat per produir proteïnes heteròlogues en P. pastoris. No obstant això, per aprofitar plenament el potencial del senyal de secreció millorat, es necessita enginyeria cel·lular addicional per superar els colls d’ampolla que apareixen posteriorment de la translocació, particularment en condicions de bioprocessos com en un fed-batch. La levadura metilotrófica Pichia pastoris (genero Komagataella) se ha convertido en una de las plataformas celulares más populares para producir proteínas de interés industrial, la mayoría de las que se secretan extracelularmente para facilitar el posterior proceso de purificación. La secreción de proteínas heterólogas fuera de la célula está mediada por la vía secretora, una ruta que engloba varios pasos y tiene diferentes orgánulos interconectados para conseguir una secreción eficiente. Sin embargo, cuando P. pastoris se ve obligada a producir proteínas heterólogas, el correcto funcionamiento de la vía de secreción podría verse comprometida. En este contexto, se han realizado diferentes estudios para identificar cuellos de botella específicos y maximizar la producción de proteínas. Se identificó la translocación de proteínas del citoplasma al retículo endoplasmático (ER) como un cuello de botella precoz importante que se encuentra en la vía secretora. El paso de translocación suele estar mediado por un péptido señal que se encuentra en el N-terminal de la proteína a traducir. Dependiendo de la secuencia señal, este paso se puede realizar mientras la proteína se traduce (translocación co-traduccional) o después de la traducción (post-traduccional). Además, la señal de secreción debe contener la llamada región “pro” para mediar una rápida exportación de la proteína recombinante desde el ER al Golgi para que acabe secretando. En la primera parte de este estudio, nos centramos en la ingeniería y la caracterización del péptido señal de secreción como estrategia para mejorar la secreción de proteínas recombinantes. Con el fin de compararlas, hemos utilizado la señal de secreción de Saccharomyces cerevisiae llamado “alfa mating factor” (α-MF) que es la señal de secreción más común utilizado por la comunidad científica para secretar proteínas recombinantes en P. pastoris. Se dice que esta señal de secreción conduce proteínas mediante la traducción post-traduccional. Como resultado, si el -MF se fusiona con una proteína que se puede plegar en el citosol de la levadura, es posible que la proteína no pueda atravesar el translocón del ER y entrar en la vía secretora. La solución fue sustituir la secuencia señal pre-α MF por la secuencia señal pre-Ost1, que dirige la translocación de forma co-traduccional a través del ER, garantizando así que las proteínas heterólogas sólo se plieguen después de llegar al lumen del ER. Adicionalmente, la pro-región del α-MF contenía una región propensa a la agregación, que fue fácilmente eliminada mediante el intercambio de una treonina por una serina en la posición 42 (Ser42). Esta señal de secreción híbrido resultante aumentó drásticamente la producción de tres proteínas modelos diferentes utilizadas en esta tesis: una proteína modelo fluorescente llamada E2-Crimson y dos lipasas diferentes de interés industrial llamadas Lipasa 2 de Bacillus thermocatenulatus (BTL2) y lipasa de Rhizopus oryzae (ROL). Más importante aún, se probaron estos hallazgos a escala biorreactor, obteniendo así resultados similares a los observados a nivel matraz. En particular, las cepas con la señal de secreción mejorado tuvieron un mejor rendimiento celular en comparación con la α-MF. En resumen, se ha propuesto una nueva señal de secreción híbrido para sustituir la señal de secreción α-MF como estándar predeterminado para producir proteínas heterólogas en P. pastoris. Sin embargo, para aprovechar plenamente el potencial de la señal de secreción mejorado, se necesita ingeniería celular adicional para superar los cuellos de botella que aparecen posteriormente de la translocación, particularmente en condiciones de bioprocesos como en un fed-batch. The methylotrophic yeast Pichia pastoris (Komagataella spp.) has become one of the most popular cellular platforms to produce industrially relevant proteins, most of which are secreted in the extracellular media to facilitate subsequent downstream processing. The secretion of heterologous proteins out of the cell is mediated by the secretory pathway, a route that encompasses several steps and has different organelles interconnected to achieve an efficient secretion. However, when P. pastoris is forced to produce heterologous proteins, the proper function of the secretion pathway might be compromised. In this context, different studies have been carried out to identify specific bottlenecks and maximize protein production. We identified the translocation of proteins from the cytoplasm to the Endoplasmic Reticulum (ER) as a major early bottleneck present in the secretory pathway. The translocation step is usually mediated by a signal sequence present at the N-terminal of the protein to be translocated. Depending on the signal sequence, this step can be performed while the protein is being translated (co-translational translocation) or after the translation (post-translational translocation). In addition, the secretion signal has to contain a so-called pro-region to mediate a fast export of the recombinant protein from the ER to the Golgi for subsequent secretion. In the first part of this study, we focused on the engineering and characterization of the secretion signal peptide as a strategy to improve recombinant protein secretion. For comparison, we used the secretion signal from the alpha mating factor (α-MF) from Saccharomyces cerevisiae, which is the most common secretion signal used by the scientific community to secrete recombinant proteins in P. pastoris. This secretion signal is reported to drive proteins through the post-translational translocation. As a result, if the α-MF is fused to a protein that can fold in the yeast cytosol, the protein may be unable to traverse the ER translocon and enter the secretory pathway. The solution was to replace the pre-α MF signal sequence with the pre-Ost1 signal sequence, which directs co-translational translocation across the ER membrane, thereby ensuring that heterologous proteins fold only after reaching the ER lumen. Additionally, the pro-region from the α-MF contained a region prone to aggregation, which was easily removed by exchanging a threonine by a serine at position 42 (Ser42). The resulting hybrid secretion signal drastically increased the production of three different model proteins used in this thesis: a fluorescent model protein called E2-Crimson and two different lipases of industrial interest, namely the lipase 2 from Bacillus thermocatenulatus (BTL2) and a lipase from Rhizopus oryzae (ROL). More importantly, these findings were then tested at bioreactor scale, thereby obtaining similar results to those observed at shake flask scale. Notably, strains with the improved secretion signal had a better cell performance in comparison with the α-MF. Overall, a new hybrid secretion signal has been proposed to replace the α factor secretion signal as the default standard for producing heterologous proteins in P. pastoris. However, to fully exploit the power of the improved secretion signal, additional cellular engineering is needed to overcome bottlenecks that appear downstream of the translocation event, particularly under bioprocess (fed-batch) conditions. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biotecnologia