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Streptococcus agalactiae (also known as Group B Streptococcus, GBS) is an opportunistic Gram-positive pathogen responsible for severe invasive infections, especially in neonates. GBS strains belonging to the ST-17 sequence type are responsible for 80% of late-onset neonatal meningitis. Genomic comparison of ST-17 strains to non-ST-17 GBS isolates revealed a few surface proteins that are characteristic of ST-17 clone, such as HvgA and Srr2, which contribute to colonization and dissemination. Similarly, the PI-2b type pilus is conserved in ST-17 strains and the main goal of this PhD project was to decipher the role of this pilus in the physiopathology of ST-17 strains. In the first part of this work, we compared the expression of the PI-2b pilus in our ST-17 representative strain BM110, and a non-ST-17 human clinical isolate, A909. We showed that PI-2b expression, although variable, was lower in ST-17 isolates as compared to non ST17 isolates. In the representative strain BM110, we demonstrated that the lower expression was be due to the presence of a 43-base pair (bp) hairpin-like structure in the upstream region of PI-2b, preventing read-through transcription from upstream antigen B (AgB) operon. Furthermore, gene reporter assays to characterize the Ppi-2b promoter region revealed the requirement of an extended 5’ region and of GBS-specific regulatory factors to drive PI-2b transcription. PI-2b transcription was shown to be maximal at 37 °C. Collectively our results suggest a complex regulation of PI-2b expression in ST-17 clinical isolates, that may confer a selective advantage in the human host either by reducing host immune responses and/or increasing their dissemination potential.In the second part of this work, we sought to investigate the role of the putative adhesin AP1-2b, and the two accessory genes lep and orf in the biosynthesis of PI-2b pilus. We showed that both orf and lep are important for PI-2b expression. Our results suggest that Lep is a functional signal peptidase involved in the optimal processing of the major PI-2b pilin. The role of orf remains to be uncovered; Streptococcus agalactiae (Streptocoque du Groupe B, SGB) est une bactérie pathogène opportuniste à Gram-positif responsable principalement d’infections néonatales. Les études épidémiologiques ont montré que les souches appartenant au complexe clonal 17 (ST-17) sont responsables de 80% des cas de méningites tardives. La génomique comparative a permis de mettre en évidence des gènes codant pour des protéines de surface spécifiques au clone ST-17 comme les adhésines Srr2 et HvgA. On y trouve également un locus codant pour un pilus spécifique appelé PI-2b, qui constitua l’objet principal de cette thèse. Ce locus PI-2b est ubiquitaire dans les souches ST-17, mais on le retrouve également dans quelques souches humaines non-ST-17 comme la souche A909 ainsi que dans les souches bovines. Dans la première partie de ce travail, nous avons comparé l’expression du pilus PI-2b dans les souches ST-17 versus non-ST-17. L’expression du locus PI-2b, bien que variable au sein du complexe ST-17, est plus faible que dans les souches non-ST-17. Dans la souche représentative du ST-17 BM110, l’expression du gène spb1codant pour la piline majeure est 4-6 fois plus faible que dans la souche A909. Nous avons montré que cet effet est dû à la présence d’une séquence de 43 paires de base en amont du locus PI-2b, formant une structure de type tige-boucle, qui empêche la transcription provenant du locus situé en amont codant pour l’antigène B. Grâce à des expériences de fusion transcriptionnelle avec un gène rapporteur codant pour la GFP, nous avons montré qu’une région étendue du promoteur ainsi que des facteurs spécifiques à S. agalactiae sont nécessaires pour l’expression maximale du locus PI-2b. Le niveau maximal de transcription du pilus PI-2b est observé à 37 °C. L’ensemble de nos résultats suggère une régulation complexe de l’expression du locus PI-2b, dont l’expression plus faible dans les souches ST-17, pourrait conférer aux bactéries la capacité d’échapper au système immunitaire de l’hôte et de disséminer plus efficacement. La deuxième partie de ce travail a porté sur le rôle des gènes orf, lep et san1519 dont la fonction sur la biosynthèse du pilus n’était pas connue. Nous avons montré que les gènes orf et lep sont importants pour l’expression et la polymérisation du pilus PI-2b. Nous avons montré que lep code pour une signal peptidase fonctionnelle qui participe à la maturation de la piline majeure. Quant à orf, nos autres résultats ainsi le chevauchement traductionnel entre ce gène et lep, conservé dans d’autres espèces de streptocoques, suggèrent un rôle dans la stabilisation des ARNm

Streptococcus agalactiae (also known as Group B Streptococcus, GBS) is an opportunistic Gram-positive pathogen responsible for severe invasive infections, especially in neonates. GBS strains belonging to the ST-17 sequence type are responsible for 80% of late-onset neonatal meningitis. Genomic comparison of ST-17 strains to non-ST-17 GBS isolates revealed a few surface proteins that are characteristic of ST-17 clone, such as HvgA and Srr2, which contribute to colonization and dissemination. Similarly, the PI-2b type pilus is conserved in ST-17 strains and the main goal of this PhD project was to decipher the role of this pilus in the physiopathology of ST-17 strains. In the first part of this work, we compared the expression of the PI-2b pilus in our ST-17 representative strain BM110, and a non-ST-17 human clinical isolate, A909. We showed that PI-2b expression, although variable, was lower in ST-17 isolates as compared to non ST17 isolates. In the representative strain BM110, we demonstrated that the lower expression was be due to the presence of a 43-base pair (bp) hairpin-like structure in the upstream region of PI-2b, preventing read-through transcription from upstream antigen B (AgB) operon. Furthermore, gene reporter assays to characterize the Ppi-2b promoter region revealed the requirement of an extended 5’ region and of GBS-specific regulatory factors to drive PI-2b transcription. PI-2b transcription was shown to be maximal at 37 °C. Collectively our results suggest a complex regulation of PI-2b expression in ST-17 clinical isolates, that may confer a selective advantage in the human host either by reducing host immune responses and/or increasing their dissemination potential.In the second part of this work, we sought to investigate the role of the putative adhesin AP1-2b, and the two accessory genes lep and orf in the biosynthesis of PI-2b pilus. We showed that both orf and lep are important for PI-2b expression. Our results suggest that Lep is a functional signal peptidase involved in the optimal processing of the major PI-2b pilin. The role of orf remains to be uncovered; Streptococcus agalactiae (Streptocoque du Groupe B, SGB) est une bactérie pathogène opportuniste à Gram-positif responsable principalement d’infections néonatales. Les études épidémiologiques ont montré que les souches appartenant au complexe clonal 17 (ST-17) sont responsables de 80% des cas de méningites tardives. La génomique comparative a permis de mettre en évidence des gènes codant pour des protéines de surface spécifiques au clone ST-17 comme les adhésines Srr2 et HvgA. On y trouve également un locus codant pour un pilus spécifique appelé PI-2b, qui constitua l’objet principal de cette thèse. Ce locus PI-2b est ubiquitaire dans les souches ST-17, mais on le retrouve également dans quelques souches humaines non-ST-17 comme la souche A909 ainsi que dans les souches bovines. Dans la première partie de ce travail, nous avons comparé l’expression du pilus PI-2b dans les souches ST-17 versus non-ST-17. L’expression du locus PI-2b, bien que variable au sein du complexe ST-17, est plus faible que dans les souches non-ST-17. Dans la souche représentative du ST-17 BM110, l’expression du gène spb1codant pour la piline majeure est 4-6 fois plus faible que dans la souche A909. Nous avons montré que cet effet est dû à la présence d’une séquence de 43 paires de base en amont du locus PI-2b, formant une structure de type tige-boucle, qui empêche la transcription provenant du locus situé en amont codant pour l’antigène B. Grâce à des expériences de fusion transcriptionnelle avec un gène rapporteur codant pour la GFP, nous avons montré qu’une région étendue du promoteur ainsi que des facteurs spécifiques à S. agalactiae sont nécessaires pour l’expression maximale du locus PI-2b. Le niveau maximal de transcription du pilus PI-2b est observé à 37 °C. L’ensemble de nos résultats suggère une régulation complexe de l’expression du locus PI-2b, dont l’expression plus faible dans les souches ST-17, pourrait conférer aux bactéries la capacité d’échapper au système immunitaire de l’hôte et de disséminer plus efficacement. La deuxième partie de ce travail a porté sur le rôle des gènes orf, lep et san1519 dont la fonction sur la biosynthèse du pilus n’était pas connue. Nous avons montré que les gènes orf et lep sont importants pour l’expression et la polymérisation du pilus PI-2b. Nous avons montré que lep code pour une signal peptidase fonctionnelle qui participe à la maturation de la piline majeure. Quant à orf, nos autres résultats ainsi le chevauchement traductionnel entre ce gène et lep, conservé dans d’autres espèces de streptocoques, suggèrent un rôle dans la stabilisation des ARNm

International audience; The widely spread Streptococcus agalactiae (also known as Group B Streptococcus, GBS) "hypervirulent" ST17 clone is strongly associated with neonatal meningitis. The PI-2b locus is mainly found in ST17 strains but is also present in a few non ST17 human isolates such as the ST-7 prototype strain A909. Here, we analysed the expression of the PI-2b pilus in the ST17 strain BM110 as compared to the non ST17 A909. Comparative genome analyses revealed the presence of a 43-base pair (bp) hairpin-like structure in the upstream region of PI-2b operon in all 26 ST17 genomes, which was absent in the 8 non-ST17 strains carrying the PI-2b locus. Deletion of this 43-bp sequence in strain BM110 resulted in a 3-to 5-fold increased transcription of PI-2b. Characterization of PI-2b promoter region in A909 and BM110 strains was carried out by RNAseq, primer extension, qRT-PCR and transcriptional fusions with gfpas reporter gene. Our results indicate the presence of a single promoter (Ppi2b) with a transcriptional start site (TSS) mapped 37 bases upstream of the start codon of the first PI-2b gene. The large operon of 16 genes located upstream of PI-2b codes for the group B carbohydrate (also known as antigen B), a major constituent of the bacterial cell wall. We showed that the hairpin sequence located between antigen B and PI-2b operons is a transcriptional terminator. In A909, increased expression of PI-2b probably results from read-through transcription from antigen B operon. In addition, we showed that an extended 5′ promoter region is required for maximal transcription of gfpas a reporter gene in S. agalactiae from Ppi2b promoter. Gene reporter assays performed in Lactococcus lactis strain NZ9000, a related non-pathogenic Gram-positive species, revealed that GBS-specific regulatory factors are required to drive PI-2b transcription. PI-2b expression is up-regulated in the BM110AcovR mutant as compared to the parental BM110 strain, but this effect is probably indirect. Collectively, our results indicate that PI-2b expression is regulated in GBS ST17 strains, which may confer a selective advantage in the human host either by reducing host immune responses and/or increasing their dissemination potential.