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Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, is responsible of more than 200000 deaths worldwide. Despite a high vaccine coverage in developed countries, a reemergence of the disease has been observed, which is in part linked to vaccine-pressure. Strains able to evade vaccine-induced immunity show high genome organization rearrangements, essentially due to mobile genetic elements (IS) present in more than 230 copies, which could impact on messenger and regulatory transcription of the pathogene.To assess the impact of IS on the global transcriptome of Bordetella pertussis, we first determined the coding and non-coding primary transcriptome by a combination of differents RNA-sequencing approaches and predictive bioinformatics analysis software packages. We identify mono- and polycistronic coding structures, including regulatories structures like riboswitches, excludon, and long overlapping 5’ and 3’UTR. A list of candidates regulating transcripts (small RNA) has been mapped from new transcripts located in intergenic regions (IGR) and transcripts oriented in antisense of annotated coding sequences. Extended transcriptions emerging from IS elements have been observed, originating from internal promoters or newly formed promoters by insertion in a specific genomic region. Those transcripts can extend in sense or in antisense of the flanking gene, or in IGR. The regulatory function of those transcripts has been studied from the characterization and the mode of action of an extended regulatory RNA, BPnc264, oriented in antisense of the virulence gene fim2.; Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche, provoque près de 200000 morts par an dans le monde. Malgré une forte couverture vaccinale, une réémergence de la maladie a été observée dans les pays développés, liée en partie à une adaptation à la pression vaccinale. Les souches capables d’échapper à la réponse immunitaire montrent des réarrangements génomiques importants, provoqués par des éléments génétiques mobiles (IS) présents en plus de 230 copies, qui pourraient impacter sur la transcription des gènes et ARN régulateurs du pathogène.Pour élucider l’impact des IS sur le transcriptome global de Bordetella pertussis, nous avons d’abord déterminé le transcriptome codant et non-codant du pathogène par des approches de séquençage d’ARN couplées à des prédictions bioinformatiques. Cette étude a permis d’identifier les structures codantes mono- et polycistroniques, incluant des structures régulatrices telles que des riboswitches, un excludon et de longs 5’ et 3’UTR chevauchants. Une cartographie de candidats ARN régulateurs non-codant a été édifiée à partir de nouveaux transcrits localisés en régions intergéniques (IGR) et de transcrits orientés en antisens de séquences codantes. Des prolongements de transcriptions des IS ont été observés, prenant leur origine de promoteurs internes à l’IS ou formés par insertion de celles-ci. Ces transcrits sont spécifiques d’une souche à l’autre du pathogène, et s’orientent en sens ou en antisens des gènes environnant, ou dans des IGR. Le potentiel caractère régulateur de ces transcrits a été étudié par la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un ARN régulateur, BPnc264, orienté en antisens du gène de virulence fim2.

Bordetella pertussis is the agent of an acute and highly contagious respiratory disease, whooping cough. In order to colonize the human respiratory tract, this strictly aerobic Gram negative bacterium produces many virulence factors, the expression of which is regulated by the BvgAS two-component system. BvgS is a sensor-kinase composed of three putative domains of perception –two periplasmic Venus flytrap domains and a cytoplasmic PAS domain -, followed by the enzymatic domain and two other domains called phosphotransfert and receiver involved in the phophorelay. The expression of the virulence regulon is activated after the phosphorylation by BvgS of the response regulator BvgA. BvgS is in a kinase mode at the basal state, and the perception of low temperatures or chemical signals like sulfate ions or nicotinate causes a shift to the phosphatase state. The study presented in this manuscript has focused on the characterization of the BvgS sensor-kinase. We have analyzed its putative domains of perception and the mechanisms of signal transduction.Investigations into the dynamics of the periplasmic moiety has provided evidence for a decreasing gradient of dynamics from N to C-terminus at the basal state. Nicotinate binding to the membrane-proximal VFT2 domains decreases the dynamics of the second lobe of VFT1. Tighter interactions between the latter and the VFT2 domain cause a tension on the α helices that precede the transmembrane segments, triggering the transition to the phosphatase state of the enzymatic portion. Perception of modulator by the VFT2 domains –or possibly binding of a ligand in the VFT1 cavity- thus appears to modify periplasmic dynamics, which shifts BvgS activity. We propose that the VFT1 domains are the motor for BvgS activity, and their dynamics are relayed or attenuated by the VFT2 domains. A search for antagonistic VFT1 ligands has been undertaken, along the idea that ligand binding may reduce their dynamics.The VFT and PAS domains, and the PAS and kinase domains are joined to each other by long α helices predicted to form coiled coils. We performed directed mutagenesis and cysteine scanning analyses to decipher signal transduction between the periplasmic domains and the enzymatic moiety of BvgS. The close contacts between the helices of the transmembrane segment are not modified after perception of the modulator, suggesting that signal transduction across the membrane is mediated by symmetrical piston motions. The putative coiled coil before the PAS domain shows rotational dynamics at the basal state. Modulator perception causes the helices to splay, and this motion may modify the PAS domains interface. Our topology analyses of the PAS domain confirm that changes occur at this interface between the kinase and phosphatase states of BvgS. Finally, the coiled coil between the PAS and kinase domains presents a strong rotational dynamics at the basal state, which is consistent with the model of regulation of kinase activity proposed for other sensor-kinases. After perception of a modulator, this coiled coil becomes more rigid, allowing the shift to the phosphatase state. The occurrence of two states of dynamics for this coiled coil has also been demonstrated in the absence of the PAS domain.These studies have advanced our understanding of BvgS and allow us to propose a model of signaling by this sensor-kinase, which may apply more broadly to other family members.; Bordetella pertussis est l’agent responsable de la coqueluche. Pour coloniser le tractus respiratoire humain, cette bactérie à Gram négatif, aérobie stricte, produit de nombreux facteurs de virulence dont l’expression est sous la dépendance du système à deux composants BvgAS. BvgS est un senseur-kinase dimérique. Chaque monomère est constitué de trois domaines putatifs de perception - deux domaines Venus flytrap périplasmiques et un domaine PAS cytoplasmique -, suivis du domaine enzymatique et deux autres domaines, de phospho-transfert et receveur, impliqués dans la cascade de phosphorylation. L’expression du régulon de virulence est activée suite à la phosphorylation par BvgS du régulateur de réponse BvgA. BvgS est en mode kinase à l’état basal, et la perception de basses températures ou de signaux chimiques comme les ions sulfate ou nicotinate cause son passage en mode phosphatase. L’étude présentée dans ce manuscrit vise à caractériser le senseur-kinase BvgS en analysant les domaines putatifs de perception ainsi que la transduction de signal qui s’effectue au sein de la molécule. L’étude de la portion périplasmique a permis de mettre en évidence, à l’état basal, un gradient de dynamique décroissant. En se fixant au domaine VFT2 proximal à la membrane, le nicotinate induirait une diminution de la dynamique du second lobe du VFT1, causée par la formation d’un bloc compact entre le domaine VFT2 et le deuxième lobe du domaine VFT1. Cette rigidification exercerait une tension sur les hélices α qui précèdent les segments transmembranaires, provoquant une transition de la portion cytoplasmique vers l’état phosphatase. La perception de modulateurs par le domaine VFT2 - ou possiblement la fixation d’un ligand dans la cavité du VFT1- modifierait cette dynamique et causerait le changement d’activité de BvgS. Ainsi, nous proposons un modèle dans lequel le VFT1 est considéré comme le moteur du système, lui impulsant une dynamique qui serait relayée ou atténuée par le domaine VFT2. Une recherche de ligands antagonistes pour le domaine VFT1 a été entreprise, selon l’idée que la fixation d’un ligand réduirait la dynamique de ce dernier. Au sein du dimère, des connecteurs prédits pour former des enroulements d’hélices α (‘coiled coil’) relient entre eux les domaines VFT et PAS, et les domaines PAS et kinase de BvgS. La transduction d’information entre les domaines périplasmiques et le site enzymatique de BvgS a été analysée par mutagénèse dirigée et ‘cysteine scanning’. Des contacts proches sont observés entre les hélices constituant le segment transmembranaire, qui ne semblent pas être modifiés après perception de modulateur. Nous suggérons donc un modèle de piston symétrique pour la transmission d’information au travers de la membrane. Le coiled coil putatif précédant le domaine PAS présente une certaine dynamique rotationnelle à l’état basal. La perception de modulateurs semble induire l’écartement de ces hélices, ce qui pourrait permettre un changement de l’interface des domaines PAS. L’étude de la topologie du domaine PAS confirme une modification de cette interface entre les modes kinase et phosphatase de BvgS. Enfin, le coiled coil reliant les domaines PAS et kinase est sujet à une forte dynamique rotationnelle à l’état basal, en accord avec un modèle de régulation de l’activité kinase proposé dans d’autres systèmes. Suite à la perception de modulateur, une rigidification marquée de ce coiled coil est observée, permettant le passage en mode phosphatase. L’existence de deux états dynamiques différents de ce coiled coil a également été mise en évidence en absence du domaine PAS.Ces études ont permis d’avancer dans la compréhension de BvgS et de proposer un modèle de la signalisation au sein de ce senseur-kinase, qui pourrait s’appliquer aux autres membres de la famille de BvgS.

Copper has become an essential element for most living organisms since the adventof oxygen in the Earth’s atmosphere, 2.7 billion years ago. This metal is used in manybiological processes. However, the electronic properties that make it crucial for life are alsowhat makes it poisonous. This ambivalent biological impact has forced organisms to acquirean increasing number of mechanisms dedicated to maintaining a strict control over copperhomeostasis. In addition, a few organisms such as amoebae have taken advantage of its toxicproperties. Those lower eukaryotes have developed a complex predation mechanism to feedon other unicellular organisms, phagocytosis, and make use of metal poisoning, in particularcopper, to kill their preys. Phagocytosis has persisted over the course of evolution to becomea key actor of innate immunity in metazoans, including humans. Copper detoxificationmechanisms developed by prokaryotic organisms have likely been selected through thepressure exerted by phagocytosis. In particular, copper homeostasis regulation mechanismsare part of the strategies adopted by pathogenic bacteria to survive phagocytosis. Thesemechanisms vary depending on the ecological niche of each species. Studies on this topichave mainly focused on environmental bacteria and on pathogenic bacteria, especially thosewith an intracellular lifestyle. Copper homeostasis in Bordetella pertussis is at the centre ofthis thesis. This bacterium is the etiologic agent of whooping cough whose peculiarity is to bestrictly dependent on its host. Furthermore, its ecological niche is very limited, as it onlyinfects the human upper respiratory epithelium. This bacterium represents a new model tostudy the role of copper in host-pathogen relationships. This work has revealed the loss ofmost copper homeostasis systems in B. pertussis. An original detoxification mechanism witha composite regulation has been identified that includes the cytoplasmic metallochaperoneCopZ and two enzymes catalyzing detoxification of peroxides. This thesis work has led to thefollowing hypothesis: this system, which is a distinctive feature of the Bordetella genus, isinvolved in survival to phagocytosis, the only situation where the bacterium experiencescopper excess in its ecological niche. The metallo-chaperone CopZ mediates thedetoxification of free copper by complexation, and together the two enzymes decrease theconcentration of hydrogen peroxide, which causes oxidative stress through the Fenton andHaber-Weiss reactions. The co-regulation of this system by copper and hydrogen peroxideresults in a very dynamic and selective activation, specific to phagocytosis-relatedmechanisms. This system offers a sufficiently favorable cost-benefit balance to have beenselected over the course of the evolution of this host-restricted pathogen.This work has led to the identification of copper tolerance mechanisms in B. pertussisand to the description of their evolutionary selection among Bordetellae., Le cuivre est devenu un élément essentiel à la plupart des organismes vivants depuis l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère terrestre il y a 2,7 milliards d’années. Ce métal est utilisé dans de nombreux processus biologiques, mais les propriétés chimiques qui le rendent indispensable sont également à l’origine de sa toxicité. Cette ambivalence du cuivre a fait que tous les organismes ont développé divers systèmes permettant un maintien extrêmement strict de l’homéostasie de ce métal. Certains organismes comme les amibes ont également mis à profit ses propriétés toxiques pour la prédation d’autres organismes unicellulaires par la phagocytose. Un des mécanismes qui leur permet ensuite de tuer leurs proies est l’empoisonnement par les métaux, et en particulier par le cuivre. La phagocytose a perduré au cours de l’évolution jusqu’à constituer un acteur essentiel de l’immunité des métazoaires, dont l’humain fait partie. Les systèmes de détoxification du cuivre mis en place par les organismes procaryotes ont donc été sélectionnés par la pression exercée lors de la phagocytose. C’est ainsi que les bactéries pathogènes ont acquis des systèmes de survie à la phagocytose, dont des mécanismes de l’homéostasie du cuivre. Ces mécanismes sont variés et dépendent de la niche écologique de chaque bactérie. Les connaissances sur ce sujet se concentrent essentiellement sur les bactéries environnementales ainsi que sur quelques bactéries pathogènes, principalement intracellulaires. Ici, c’est l’homéostasie du cuivre chez Bordetella pertussis qui a été au centre de ces travaux de thèse. Cette bactérie est l’agent étiologique de la coqueluche et présente la particularité d’être un pathogène totalement dépendant de son hôte. De plus, sa niche écologique est extrêmement restreinte, se limitant à l’épithélium de l’arbre respiratoire supérieur de l’humain. Cette bactérie constitue donc un modèle nouveau pour l'étude du rôle du cuivre dans la relation hôte-pathogène. Ces travaux ont mis en évidence la perte de la plupart des systèmes de l’homéostasie du cuivre chez B. pertussis. Néanmoins, un système de détoxification original avec une régulation double a été découvert, composé de la métallochaperonne cytoplasmique CopZ et de deux enzymes impliquées dans la détoxification du stress oxydant. Les travaux de cette thèse ont permis d’émettre l’hypothèse que ce système propre aux Bordetella est impliqué dans la survie à la phagocytose par les cellules immunitaires, seule source d’excès de cuivre dans la niche écologique de B. pertussis. La métallochaperonne CopZ détoxifie le cuivre libre par complexation et les deux enzymes permettent de réduire la concentration de peroxyde d’hydrogène à l’origine du stress oxydant causé par les réactions de Fenton et d’Haber-Weiss. La co-régulation de ce système par le cuivre et le peroxyde d’hydrogène permet son activation sélective et très dynamique en réponse aux mécanismes liés à la phagocytose. Le rapport entre coût énergétique de ce système pour la bactérie et la protection qu’il lui assure doit être suffisamment favorable pour qu’il ait été spécifiquement sélectionné dans l’évolution de ce pathogène très spécialisé.Ces travaux ont permis de déterminer les mécanismes de tolérance au cuivre présents chez B. pertussis, ainsi que la sélection évolutive que ces systèmes ont subie chez Bordetella.

Copper has become an essential element for most living organisms since the adventof oxygen in the Earth’s atmosphere, 2.7 billion years ago. This metal is used in manybiological processes. However, the electronic properties that make it crucial for life are alsowhat makes it poisonous. This ambivalent biological impact has forced organisms to acquirean increasing number of mechanisms dedicated to maintaining a strict control over copperhomeostasis. In addition, a few organisms such as amoebae have taken advantage of its toxicproperties. Those lower eukaryotes have developed a complex predation mechanism to feedon other unicellular organisms, phagocytosis, and make use of metal poisoning, in particularcopper, to kill their preys. Phagocytosis has persisted over the course of evolution to becomea key actor of innate immunity in metazoans, including humans. Copper detoxificationmechanisms developed by prokaryotic organisms have likely been selected through thepressure exerted by phagocytosis. In particular, copper homeostasis regulation mechanismsare part of the strategies adopted by pathogenic bacteria to survive phagocytosis. Thesemechanisms vary depending on the ecological niche of each species. Studies on this topichave mainly focused on environmental bacteria and on pathogenic bacteria, especially thosewith an intracellular lifestyle. Copper homeostasis in Bordetella pertussis is at the centre ofthis thesis. This bacterium is the etiologic agent of whooping cough whose peculiarity is to bestrictly dependent on its host. Furthermore, its ecological niche is very limited, as it onlyinfects the human upper respiratory epithelium. This bacterium represents a new model tostudy the role of copper in host-pathogen relationships. This work has revealed the loss ofmost copper homeostasis systems in B. pertussis. An original detoxification mechanism witha composite regulation has been identified that includes the cytoplasmic metallochaperoneCopZ and two enzymes catalyzing detoxification of peroxides. This thesis work has led to thefollowing hypothesis: this system, which is a distinctive feature of the Bordetella genus, isinvolved in survival to phagocytosis, the only situation where the bacterium experiencescopper excess in its ecological niche. The metallo-chaperone CopZ mediates thedetoxification of free copper by complexation, and together the two enzymes decrease theconcentration of hydrogen peroxide, which causes oxidative stress through the Fenton andHaber-Weiss reactions. The co-regulation of this system by copper and hydrogen peroxideresults in a very dynamic and selective activation, specific to phagocytosis-relatedmechanisms. This system offers a sufficiently favorable cost-benefit balance to have beenselected over the course of the evolution of this host-restricted pathogen.This work has led to the identification of copper tolerance mechanisms in B. pertussisand to the description of their evolutionary selection among Bordetellae., Le cuivre est devenu un élément essentiel à la plupart des organismes vivants depuis l’apparition de l’oxygène dans l’atmosphère terrestre il y a 2,7 milliards d’années. Ce métal est utilisé dans de nombreux processus biologiques, mais les propriétés chimiques qui le rendent indispensable sont également à l’origine de sa toxicité. Cette ambivalence du cuivre a fait que tous les organismes ont développé divers systèmes permettant un maintien extrêmement strict de l’homéostasie de ce métal. Certains organismes comme les amibes ont également mis à profit ses propriétés toxiques pour la prédation d’autres organismes unicellulaires par la phagocytose. Un des mécanismes qui leur permet ensuite de tuer leurs proies est l’empoisonnement par les métaux, et en particulier par le cuivre. La phagocytose a perduré au cours de l’évolution jusqu’à constituer un acteur essentiel de l’immunité des métazoaires, dont l’humain fait partie. Les systèmes de détoxification du cuivre mis en place par les organismes procaryotes ont donc été sélectionnés par la pression exercée lors de la phagocytose. C’est ainsi que les bactéries pathogènes ont acquis des systèmes de survie à la phagocytose, dont des mécanismes de l’homéostasie du cuivre. Ces mécanismes sont variés et dépendent de la niche écologique de chaque bactérie. Les connaissances sur ce sujet se concentrent essentiellement sur les bactéries environnementales ainsi que sur quelques bactéries pathogènes, principalement intracellulaires. Ici, c’est l’homéostasie du cuivre chez Bordetella pertussis qui a été au centre de ces travaux de thèse. Cette bactérie est l’agent étiologique de la coqueluche et présente la particularité d’être un pathogène totalement dépendant de son hôte. De plus, sa niche écologique est extrêmement restreinte, se limitant à l’épithélium de l’arbre respiratoire supérieur de l’humain. Cette bactérie constitue donc un modèle nouveau pour l'étude du rôle du cuivre dans la relation hôte-pathogène. Ces travaux ont mis en évidence la perte de la plupart des systèmes de l’homéostasie du cuivre chez B. pertussis. Néanmoins, un système de détoxification original avec une régulation double a été découvert, composé de la métallochaperonne cytoplasmique CopZ et de deux enzymes impliquées dans la détoxification du stress oxydant. Les travaux de cette thèse ont permis d’émettre l’hypothèse que ce système propre aux Bordetella est impliqué dans la survie à la phagocytose par les cellules immunitaires, seule source d’excès de cuivre dans la niche écologique de B. pertussis. La métallochaperonne CopZ détoxifie le cuivre libre par complexation et les deux enzymes permettent de réduire la concentration de peroxyde d’hydrogène à l’origine du stress oxydant causé par les réactions de Fenton et d’Haber-Weiss. La co-régulation de ce système par le cuivre et le peroxyde d’hydrogène permet son activation sélective et très dynamique en réponse aux mécanismes liés à la phagocytose. Le rapport entre coût énergétique de ce système pour la bactérie et la protection qu’il lui assure doit être suffisamment favorable pour qu’il ait été spécifiquement sélectionné dans l’évolution de ce pathogène très spécialisé.Ces travaux ont permis de déterminer les mécanismes de tolérance au cuivre présents chez B. pertussis, ainsi que la sélection évolutive que ces systèmes ont subie chez Bordetella.

Most studies in the pathogenesis of Bordetella show persistent colonization of the bacterium in the lower respiratory tract, but recent researchs have shown that it can colonize the upper part of the respiratory tract, including the nasal cavity. These bacteria may induce local mucosal immunity, involving the potential role of secretory IgA in local control of infection. First, we plan to develop and use a high throughput growth inhibition test. This test, which we called BGIA (Bordetella growth inhibition assay), will evaluate the bactericidal and bacteriostatic properties of various biological fluids collected at different times of bacterial colonization after infection or vaccination with B. pertussis in mice, baboons and humans (serum, nasal wash and bronchoalveolar). In a second step, the inhibitory molecules (antibodies, comlement, peptides) and inhibitory mechanisms observed will be studied in greater depth. With this thesis project, we hope to advance on one hand in understanding the protective mechanisms of the humoral response and on another hand the relationship between local immunity and systemic immmunity., La plupart des études dans la pathogenèse de Bordetella montrent une colonisation persistante de la bactérie dans la partie inférieure du tractus respiratoire, mais de récentes recherches dévoilent qu’elles peuvent coloniser durablement la partie supérieure incluant la cavité nasale. Ces bactéries pourraient induire une immunité locale de type mucosale, impliquant le rôle potentiel des IgA sécrétoires dans le contrôle local de l’infection. Dans un premier temps, nous comptons développer et utiliser un test d'inhibition de croissance à haut débit. Ce test, que nous avons appelé BGIA (Bordetella growth inhibition assay), permettra d’évaluer la propriété bactéricide et bactériostatique de divers fluides biologiques prélevés à différents temps de la colonisation bactérienne après une infection ou une vaccination à B. pertussis chez les souris, babouins et humains (sérum, lavage nasal et broncho-alvéolaire). Dans un second temps, les molécules inhibitrices et les mécanismes inhibiteurs observés seront étudiés de manière plus approfondie. Avec ce projet de thèse, nous espérons avancer d’une part dans la compréhension des mécanismes de protection de la réponse humorale et des relations entre l’immunité locale et l’immunité systémique.

Most studies in the pathogenesis of Bordetella show persistent colonization of the bacterium in the lower respiratory tract, but recent researchs have shown that it can colonize the upper part of the respiratory tract, including the nasal cavity. These bacteria may induce local mucosal immunity, involving the potential role of secretory IgA in local control of infection. First, we plan to develop and use a high throughput growth inhibition test. This test, which we called BGIA (Bordetella growth inhibition assay), will evaluate the bactericidal and bacteriostatic properties of various biological fluids collected at different times of bacterial colonization after infection or vaccination with B. pertussis in mice, baboons and humans (serum, nasal wash and bronchoalveolar). In a second step, the inhibitory molecules (antibodies, comlement, peptides) and inhibitory mechanisms observed will be studied in greater depth. With this thesis project, we hope to advance on one hand in understanding the protective mechanisms of the humoral response and on another hand the relationship between local immunity and systemic immmunity., La plupart des études dans la pathogenèse de Bordetella montrent une colonisation persistante de la bactérie dans la partie inférieure du tractus respiratoire, mais de récentes recherches dévoilent qu’elles peuvent coloniser durablement la partie supérieure incluant la cavité nasale. Ces bactéries pourraient induire une immunité locale de type mucosale, impliquant le rôle potentiel des IgA sécrétoires dans le contrôle local de l’infection. Dans un premier temps, nous comptons développer et utiliser un test d'inhibition de croissance à haut débit. Ce test, que nous avons appelé BGIA (Bordetella growth inhibition assay), permettra d’évaluer la propriété bactéricide et bactériostatique de divers fluides biologiques prélevés à différents temps de la colonisation bactérienne après une infection ou une vaccination à B. pertussis chez les souris, babouins et humains (sérum, lavage nasal et broncho-alvéolaire). Dans un second temps, les molécules inhibitrices et les mécanismes inhibiteurs observés seront étudiés de manière plus approfondie. Avec ce projet de thèse, nous espérons avancer d’une part dans la compréhension des mécanismes de protection de la réponse humorale et des relations entre l’immunité locale et l’immunité systémique.

Type V secretion in bacteria mediates the export to the cell surface of proteins, some of which have been identified as important factors of pathogenicity. Type V includes the secretion of autotransporters and the ‘Two-partner Secretion’ (TPS) pathway. Autotransporters consist of a β barrel domain and a passenger domain. The interaction of autotransporters with the Bam complex, of which the BamA transporter is the central component, allows the insertion of the β; barrel in the outer membrane and the secretion of passenger domain. In contrast, the two-partner secretion involves two proteins, the exported ‘TpsA’ protein and its TpsB partner that controls its transport across the outer membrane. TpsB proteins are specific to their associated TpsA(s) and belong to the superfamily of the Omp85 transporters, which carry out the insertion of proteins into the bacterial outer membrane, like BamA, or in the outer membranes of eukaryotic organelles including chloroplasts and mitochondria. For my PhD work, I have been interested in the secretion of filamentous hemagglutinin (FHA), which is the major adhesin of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. This adhesin allows the colonization by this bacterium of its host’s respiratory tract. This protein corresponds to a 220kD TpsA protein efficiently secreted by its specific transporter TpsB named FhaC. Crystallographic studies have revealed that FhaC harbours a 16-stranded β;-barrel occluded by both the N-terminal α;-helix, H1, shared by the majority of TpsB proteins, and by a surface loop, L6, that carries a conserved, hallmark motif of the Omp85 superfamilly. This conformation suggests that FhaC is in a resting state in which the channel does not transport its partner. To understand how the FHA passes through the FhaC pore, it is necessary to address the conformational changes undergone by FhaC. During my thesis work, we provided a more dynamic view of the TPS pathway using the FHA/FhaC couple as study model. For this we used Electron Paramagnetic Resonance (EPR). This biophysical technique allows to study of FhaC in solution or reincorporated into a lipid bilayer and it reports the mobility at specific sites of the protein by using paramagnetic probes. Thus we have shown that FhaC is in equilibrium between multiple conformations, with H1 in the pore or at the periplasmic side of FhaC. The presence of FHA displaces the conformational equilibrium, promoting the exit of the helix going from the pore. We have also experimentally demonstrated that FHA does transit through the pore formed by FhaC while helix H1 is then in the periplasm. The study of the L6 loop enabled us to show that the mobility of this loop is highly constrained in the pore and remains so upon the recognition of FHA. Its slow mobility is linked to an interaction between an invariant L6 residue and a conserved motif present on the β; strand 13 of the barrel. This interaction affects the size of the FhaC pore.More generally, the study of the dynamics of FhaC contributes to the understanding the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the Omp85 superfamily., La voie de sécrétion bactérienne de type V permet l’exportation à la surface cellulaire de protéines dont certaines ont été identifiées comme d’importants facteurs de la pathogénicité bactérienne. Le type V regroupe la sécrétion des autotransporteurs et la sécrétion à deux partenaires (TPS). Les autotransporteurs sont constitués d’un domaine en tonneau β; et d’un domaine passager. L’interaction de l’autotransporteur avec le complexe protéique Bam, dont la pièce centrale est le transporteur BamA, permet l’insertion dans la membrane externe du tonneau β; et la sécrétion du passager. En revanche, la sécrétion à deux partenaires fait intervenir deux protéines, l’une appelée TpsA correspondant à la protéine exportée et l’autre, TpsB, formant un tonneau β qui contrôle le transport à travers la membrane externe. Les protéines TpsB sont spécifiques à leur(s) TpsA associée(s), et font partie de la superfamille des transporteurs Omp85 qui effectuent l’insertion de protéines dans la membrane externe bactérienne comme BamA, et dans celles des organites eucaryotes dont les chloroplastes et les mitochondries. Au cours de mon doctorat, je me suis intéressé à la sécrétion de l’hémagglutinine filamenteuse (FHA), qui est l’adhésine majoritaire de Bordetella pertussis, l’agent étiologique de la coqueluche. Cette adhésine qui permet à la bactérie de coloniser le tractus respiratoire de l’hôte est une protéine TpsA de 220 kD. Elle est très efficacement sécrétée par la voie de sécrétion à deux partenaires grâce à son transporteur spécifique TpsB nommé FhaC. L’étude cristallographique de FhaC a révélé un tonneau β; à 16 brins qui forme un canal dans la membrane externe obstrué par l’hélice-α; amino-terminale, H1, partagée par la majorité des TpsB, et par une boucle de surface, L6, conservée dans la superfamille Omp85. Cette conformation suggère un état au repos dans lequel le canal bouché ne pourrait pas transporter son partenaire. Afin de comprendre comment la FHA transite à l’intérieur du pore, il est donc nécessaire de connaître les changements de conformations que subit FhaC. Durant mon travail de thèse, nous avons apporté une vision plus dynamique de la sécrétion à deux partenaires en utilisant le couple FHA/FhaC comme modèle d’étude. Pour cela nous avons utilisé principalement la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE). Cette technique de biophysique permet d’étudier FhaC en solution ou réincorporée dans une bicouche lipidique et de rendre compte de la mobilité à un site donné par l’utilisation de sondes paramagnétiques. Ainsi nous avons pu montrer que FhaC est en équilibre entre plusieurs conformations, avec H1 dans le pore ou du côté périplasmique de FhaC. La présence de la FHA déplace cet équilibre, favorisant ainsi la sortie de l’hélice hors du pore. Nous avons, par ailleurs, pu démontrer expérimentalement que la FHA transitait bien à l’intérieur du pore formé par FhaC et que l’hélice H1 se trouvait alors dans le périplasme. L’étude de la boucle L6 nous a permis de montrer que la mobilité de cette boucle était fortement contrainte à l’intérieur du pore même lors de la reconnaissance avec la FHA. Ce ralentissement de mobilité est lié, en autre, à une interaction avec un résidu d’un motif conservé présent sur le brin β13 qui influence la taille du pore. De manière plus générale, cette étude de la dynamique de FhaC contribue à la compréhension des mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille Omp85.

False-negative findings of polymerase chain reaction (PCR) for genuine pertussis as well as the numerous atypical forms of whooping cough make it difficult to diagnose this disease in young babies.For two years, real-time PCR was performed to test for Bordetella pertussis in 86 infants younger than 6 months hospitalized for apnea or paroxysmal and/or vomiting cough and in 205 of their household contacts, whether or not they coughed.Group 1 included 30 infants for whom PCR detected B. pertussis (25 of whom were also RSV+). PCR was also positive for at least one household contact in 25/30 families. This group included 16 babies with apnea and 12 who developed a whooping cough during follow-up. Group 2 comprised 12 infants whose PCR was negative while at least one household contact had positive results. Five of these infants had severe apnea and 6 developed a whooping cough. Group 3 included 44 infants (28 RSV +) for whom PCR was negative in the index case and in the household contacts: none developed a whooping cough during follow-up. Only 3 of the 54 positive household contacts had a paroxysmal cough or a typical whooping cough and 12 had no cough at all.Positive PCR in a household contact, symptomatic or not, is helpful for the diagnosis of atypical whooping cough in young infants.

Virulence of Bordetella pertussis, the whooping cough agent, is due to a plethora of virulence factors which expression is regulated by the two-component system BvgAS. BvgA is a classical response regulator and BvgS the sensor. BvgS contains 3 putative sensor domains, 2 periplasmic Venus FlyTrap (VFT), linked through a transmembrane segment to a cytoplasmic PAS domain preceding the histidine-kinase. Signals perceived by those sensor domains are still unknown, but a 37°C temperature is sufficient to maintain the system active under laboratory conditions. This activity can be down-modulated by chemical compounds, such as MgSO4 or nicotinate, which at sufficient concentration allows the bacteria to switch to avirulent phase.We investigated the role of BvgS VFT domains. VFTs are ubiquitous domains composed of 2 lobes linked by a hinge hence forming a cleft where a specific ligand can bind and stabilize the VFT in its closed conformation.BvgS VFT domains were crystalized and form an intricate dimer defining large interfaces between the 4 VFTs. VFT2s are closed without a ligand and VFT1s are opened, artificial closure of these domains via a disulfide bond indicates that this is the active conformation of BvgS. The role of the interfaces was probed by site-directed mutagenesis. A positive signal might originate from the periplasm to be transmitted through the membrane by the interfaces and integrated by a functional coupling between the VFT2s and the helices preceding the membrane, H19.These helices should be continued through the membrane and the cytoplasm to the PAS domain. Pas domains are ubiquitous with a highly conserved structure, a 5 stranded sheet surrounded by  helices defining a cavity. Pas domains are involved in a wide variety of physiological processes, depending on their ability to bind a ligand. Some PAS might function without a ligand and could then be signal adaptors or amplifiers.We demonstrated PASBvg was dimeric, confirming the dimeric nature of BvgS. Cavity residues were substituted indicating that integrity of the cavity is necessary to maintain activity and modulation capacity coming from the periplasmic moiety. Ligand binding wasn’t demonstrated but couldn’t be excluded. Some residues are needed for the correct coupling of the PAS domain to its flanking helices and hence signal transmission. Loss of these connections generates a strong destabilization of PASBvg and turns BvgS inactive.A positive signal might come from the periplasmic moiety and shoul be maintaines by the PAS domain, which is in a rigid conformation also allowing the transmission of negative signals., La virulence de Bordetella pertussis, agent de la coqueluche, est liée à un arsenal de facteurs de virulence dont l’expression est régulée par le système à deux composants BvgAS. BvgA est le régulateur de réponse et BvgS le capteur du système, qui possède 3 domaines putatifs de perception de signaux. Il s’agit de 2 domaines périplasmiques « Venus FlyTrap » (VFT), reliés par un segment transmembranaire à un domaine PAS (Per-ARNT-Sim) cytoplasmique qui fait la jonction avec l’histidine-kinase. Les signaux perçus par ces domaines capteurs sont inconnus, mais une température de 37°C est suffisante pour maintenir le système actif en laboratoire. Cette activité peut être modulée négativement par des composés chimiques, comme le MgSO4 ou le nicotinate, qui à concentrations suffisantes entraînent le passage de la bactérie en phase avirulente.Nous nous sommes intéressés aux domaines VFT de BvgS. Ces domaines, ubiquitaires, sont composés de 2 lobes reliés par une charnière délimitant une cavité qui permet la fixation d’un ligand spécifique stabilisant le VFT sous une forme fermée.Les domaines VFT de BvgS ont pu être cristallisés et s’organisent en un dimère entrelacé définissant de larges interfaces entre les 4 VFTs. Les VFT2 sont fermés sans ligand et les VFT1 ouverts, et la fermeture artificielle de ces domaines par des ponts disulfure a montré qu’il s’agit de la conformation active de BvgS. L’importance des interfaces entre les domaines VFT pour la fonction de BvgS a été démontrée par mutagenèse dirigée. Un signal positif proviendrait du périplasme pour être transmis à travers la membrane par les interfaces entre les VFT et intégré via un couplage fonctionnel en trans entre ces domaines et les hélices pré-membranaires, dites H19.Ces hélices se prolongeraient à travers la membrane et dans le cytoplasme jusqu’au domaine PAS. Les domaines PAS sont ubiquitaires, avec une structure fortement conservée en feuillet  à 5 brins recouvert d’hélices  délimitant une cavité. Ils sont impliqués dans diverses fonctions biologiques, selon leur capacité de liaison d’un ligand. Certains domaines PAS fonctionneraient sans ligand et pourraient servir d’adaptateurs ou d’amplificateurs de signal.Nous avons pu mettre en évidence la capacité de dimérisation de PASBvg, confirmant la nature dimérique du capteur BvgS. Des substitutions de résidus de la cavité de PASBvg indiqueraient que l’intégrité de la cavité de PASBvg est nécessaire au passage de signaux positifs et négatifs provenant du périplasme. La fixation de ligand dans la cavité n’a pu être démontrée mais n’est pas exclue. D’autre part, certains résidus sont nécessaires au couplage du domaine PAS avec ses hélices flanquantes pour la transmission de signal. La perte de ces interactions déstabilise significativement PASBvg et rend BvgS inactif.Un message positif proviendrait du périplasme et serait maintenu par le domaine PAS, dans une conformation rigide, permettant aussi la transmission des signaux modulateurs.

La possible pression de sélection génétique associée à l'utilisation de vaccins pendant une longue durée a fait l'objet de réflexions théoriques et de revues récentes. Dans ce contexte, le modèle #Bordetella pertussis$, pour lequel un vaccin existe et est utilisé à large échelle depuis plus de trente années dans certains pays, peut aider à préciser les éléments d'appréciation de ce risque d'évolution. La poursuite et l'amélioration du contrôle de la coqueluche nécessitent une amélioration de la couverture vaccinale dans les pays où elle reste faible. Dans les pays où la couverture vaccinale est élevée depuis longtemps, l'observation d'une résurgence de la coqueluche nécessite le maintien d'un niveau élevé de la vaccination et la pratique de rappels vaccinaux. Ces deux aspects ont nécessité le développement et suggèrent l'utilisation de nouveaux vaccins mieux tolérés. La survenue d'épidémies dans des populations ayant une forte politique de vaccination pose le problème de l'efficacité des vaccins, de leurs effets épidémiologiques à long terme sur la transmission et d'une sélection génétique. L'évolution parallèle des modifications des isolats circulant et de la couverture vaccinale est compatible avec un tel mécanisme de sélection génétique, mais ne le prouve pas. Des études de surveillance intégrant la caractérisation standardisée des isolats et des vaccins selon un échantillonage spatio-temporel sont nécessaires. (Résumé d'auteur)