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La thérapie antirétrovirale (TAR) n'éradique pas le VIH de l'organisme. Le VIH persiste grâce à la prolifération de lymphocytes T CD4+ infectés de manière latente. De plus, bien que la plupart des provirus persistent sous une forme latente, un petit nombre de cellules infectées produisent des protéines virales et des virions. Les immunosuppresseurs administrés aux personnes subissant une greffe de rein, pour prévenir le rejet d’organe, inhibent la prolifération des lymphocytes T et l'activation immunitaire. Nous avons émis l'hypothèse que les immunosuppresseurs pourraient réduire à la fois la taille du réservoir viral latent ainsi que les marqueurs associés à la production résiduelle de VIH. Sept participants vivant avec le VIH sous TAR efficace et ayant subi une transplantation rénale suivie de la prise d’un traitement immunosuppresseur ont été recrutés. Des échantillons sanguins longitudinaux ont été prélevés avant et après la greffe (6-7 échantillons/participant, sur 2 ans). Les effets des immunosuppresseurs sur l'activation des lymphocytes T ainsi que les taux d’anticorps plasmatiques dirigés contre l'enveloppe du VIH (un reflet de la production virale résiduelle) ont été évalués par cytométrie en flux et ELISA, respectivement. L'ADN total du VIH et les transcrits d'ARN-gag-LTR associés aux cellules ont été quantifiés par qPCR et la fréquence des cellules p24+ par HIV-Flow. Pour confirmer les résultats obtenus in vivo, nous avons optimisé un protocole de culture cellulaire pour évaluer l'impact des immunosuppresseurs les plus fréquemment utilisés (MMF, tacrolimus, dasatinib) sur les cellules infectées dans un environnement contrôlé. Suite à la transplantation et à l’initiation du traitement immunosuppresseur, nous avons observé une diminution significative des niveaux d'expression des marqueurs d’activation et de prolifération HLA-DR et Ki67 dans les lymphocytes T CD4+, accompagnée d'une augmentation de la fréquence des cellules mémoires centrales et d'une forte diminution de la fréquence des lymphocytes T régulateurs. Les niveaux d'anticorps ciblant l'enveloppe du VIH ont également diminué pendant le traitement immunosuppresseur. Il y avait une diminution modeste et transitoire des niveaux d'ADN et d'ARN du VIH un mois après la transplantation rénale. Les résultats de HIV-Flow n'ont montré aucun impact significatif des immunosuppresseurs sur le réservoir inductible, avec de grandes variations entre les participants. Le modèle de culture cellulaire in vitro a révélé que de faibles doses d'immunosuppresseurs induisent généralement une diminution des marqueurs du VIH, alors que des doses plus élevées conduisent à des variations dépendantes des donneurs. Ainsi, nos résultats montrent que les traitements immunosuppresseurs diminuent la prolifération et l'activation des lymphocytes T CD4+, ce qui est concomitant avec une diminution modeste et transitoire des taux d'ADN et d'ARN du VIH. Nos résultats indiquent que la combinaison des traitements immunosuppresseurs actuels sont toutefois insuffisants pour affecter profondément et durablement le réservoir du VIH et suggèrent que la taille du réservoir est étroitement régulée par des forces homéostatiques difficiles à contrer., Antiretroviral therapy (ART) does not eradicate HIV from the body. HIV persists through proliferation of latently infected CD4+T-cells. Moreover, although most proviruses persist in a latent form, a small number of infected cells produce viral protein and virions. Immunosuppressants given to people undergoing kidney transplants to prevent rejection inhibit T-cell proliferation and immune activation. We hypothesized that immunosuppressants could reduce both the size of the latent viral reservoir as well as markers associated with residual production of HIV. Seven participants living with HIV on suppressive ART who underwent kidney transplantation and initiated immunosuppressive therapy were enrolled. Longitudinal blood samples were collected before and after the transplant (6-7 samples/participant, over 2years). The effects of immunosuppressants on T-cell activation as well as plasma HIV-envelope antibody responses (a surrogate of residual viral production) were assessed by flow cytometry and ELISA, respectively. Total HIV-DNA and cell-associated LTR-gag-RNA transcripts were quantified by qPCR and the frequency of p24+ cells by HIV-Flow in isolated CD4+T-cells. To confirm the results saw in vivo, we optimized a cell culture protocol to assess the impact of frequently given immunosuppressants (tacrolimus, MMF and dasatinib) on infected cells in a controlled environment. Following organ transplant and initiation of immunosuppressive treatment, we observed a significant decrease in the expression levels of HLA-DR and Ki67 in CD4+T-cells, which was accompanied by an increase in the frequency of central memory cells and a sharp decrease in the frequency of regulatory T-cells. Antibody levels targeting HIV envelope also decreased during immunosuppressive therapy. There was a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels one month following kidney transplantation. HIV-Flow results showed no significant impact of immunosuppressants on the inducible reservoir, with large variations between participants. The in vitro cell culture model showed that low doses of immunosuppressants generally induces a reduction in HIV markers, but higher doses lead to variations between donors. Immunosuppressive therapy decreases the proliferation and activation of CD4+ T-cells which is concomitant with a modest and transient decrease in HIV DNA and RNA levels. Our results indicate that current immunosuppressive drugs are insufficient to profoundly and durably affect the HIV reservoir and suggest that the size of the reservoir is tightly regulated by homeostatic forces that are difficult to counteract.

La trithérapie antirétrovirale a considérablement augmenté l’espérance de vie des personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), mais ne permet pas de guérir l’infection. En effet, le virus latent persiste dans des réservoirs, comme les lymphocytes T CD4+, ce qui empêche son élimination complète. Bien que plusieurs études aient montré un lien entre l’âge et la progression de la maladie, la relation entre le vieillissement et la persistance virale demeure peu explorée. Puisqu’il est connu que la diminution de la production thymique avec l’âge a un impact sur l’homéostasie lymphocytaire, nous avons étudié l’association entre le vieillissement, l’activité thymique et les réservoirs du VIH. Chez les personnes infectées traitées, nos résultats montrent que le réservoir viral inductible est significativement corrélé à l’âge. Cette association est partiellement expliquée par la diminution de la production thymique, causant notamment une réduction de la fréquence des lymphocytes T CD8+. De plus, nous avons observé que les individus ayant des plaques athérosclérotiques, un indicateur sous clinique fortement associée au vieillissement, ont un réservoir viral plus élevé. Finalement, nos résultats montrent que la restauration du thymus par l’administration d’hormone de croissance semble avoir un impact bénéfique sur la taille du réservoir total. Nos résultats suggèrent que le réservoir évolue différemment en fonction de l’âge et que l’involution du thymus contribue à la persistance du VIH, ce qui ouvre la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. Également, ils indiquent que certaines mesures du réservoir viral pourraient contribuer à l’évaluation du risque de développement de plaques d’athérosclérose., Antiretroviral therapy has prolonged the life expectancy of people living with the human immunodeficiency virus (HIV), but does not cure the infection. Indeed, latent virus persists in reservoirs, like CD4+ T cells, which is a major barrier to it’s complete elimination. It is well established that age has an impact on the clinical progression of the disease. However, the relationship between aging and viral persistence is still unknown. As age-associated reduction of thymic production has important consequences on lymphocyte homeostasis, we studied the association between aging, thymic activity avec HIV reservoirs. In infected individuals under antiretroviral therapy, we show that the inducible reservoir is significantly correlated with age. This association can be partially linked to the reduction of thymic production with age, causing a decrease in the frequency of CD8+ T cells. Furthermore, we highlight that individuals with atherosclerotic plaques, a sub-clinical factor highly associated with aging, have a bigger HIV reservoir. Finally, we show that restauration of thymic activity induced by the administration of recombinant growth hormone has a modest but significant beneficial effect on the size of total HIV reservoir. Overall, our results indicate that HIV reservoir evolves differently with age and that thymic involution contributes to viral persistence, which open the way to novel therapeutic approaches. In addition, they suggest that some viral reservoir measures could contribute to the evaluation of the risk of atherosclerotic plaques development.

Avec près de 35 millions de personnes infectées à travers le monde et 60.000 au Canada, le VIH reste un problème majeur de santé publique. Bien que la thérapie antirétrovirale ait amélioré de façon considérable la qualité et la durée de vie des personnes infectées, elle ne permet pas d’éliminer complètement le virus de l’organisme. Cette persistance virale est liée à l’existence de réservoirs cellulaires et anatomiques dans lesquels le virus persiste par réplication résiduelle et/ou par latence, et au sein desquels le virus est invisible par le système immunitaire et insensible au traitement. La mise au point de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à éliminer ces réservoirs viraux nécessite une compréhension approfondie de la nature des cellules dans lesquelles le virus persiste et des mécanismes moléculaires et virologiques associés à la persistance virale. Bien que le virus persiste essentiellement dans les lymphocytes T CD4+ mémoires, le phénotype exact des cellules réservoirs reste à déterminer. Nous avons mis au point une nouvelle méthode de cytométrie en flux (HIV-Flow) permettant la détection des cellules produisant la protéine virale p24 et facilitant l’étude du phénotype des cellules réservoirs. Nos résultats suggèrent que le réservoir viral est constitué d’un ensemble hétérogène de sous-populations cellulaires exprimant divers marqueurs qui ne sont pas spécifiques aux cellules infectées de manière latente. Néanmoins, nous avons identifié certains marqueurs exprimés de façon préférentielle à la surface des cellules p24+, tels que PD-1, TIGIT et l’intégrine a4b1. L’identification d’a4b1 comme marqueur de réservoir viral ouvre la voie à de nouvelles perspectives thérapeutiques. Enfin, nos résultats montrent que les virus compétents pour la traduction protéique persistent dans les 3 sous-populations de lymphocytes T CD4+ mémoires [lymphocytes T CD4+ mémoires centraux (TCM), transitionnels (TTM), et effecteurs (TEM)], mais sont particulièrement enrichis dans les cellules TTM et TEM chez les individus sous ART. Les 3 sous-populations de lymphocytes T CD4+ mémoires dans lesquelles le virus persiste possèdent des propriétés différentes en termes de capacité de survie et de prolifération. La mise au point de protocoles de cytométrie en flux permettant d’étudier divers facteurs impliqués dans l’expression transcriptionnelle du génome proviral (acétylation des histones, NF-kB, PTEF-b) a révélé que ces facteurs sont exprimés à différents niveaux entre les sous-populations, d’où l’importance de tenir compte de l’hétérogénéité des réservoirs viraux. Nous avons également montré que les agents anti-latence ont des capacités différentes à moduler les niveaux de ces facteurs entre les différentes sous-populations. Enfin, grâce au HIV-Flow, nous avons identifié une combinaison d’agents anti-latence capable de réactiver très efficacement le virus dans les i TCM. Des travaux supplémentaires devraient nous permettre de mettre en évidence une combinaison capable de réactiver le virus très efficacement dans toutes les sous-populations. Au-delà des réservoirs cellulaires décrits ci-dessus, le VIH persiste dans une variété de sanctuaires anatomiques. Puisque les ganglions lymphatiques constituent un site de prédilection pour la persistance du VIH, nous avons étudié les mécanismes virologiques de persistance virale dans ce compartiment anatomique. Nous avons montré que la fréquence de cellules T CD4 produisant des ARNs tat/rev spontanément est plus élevée dans les ganglions lymphatiques que dans le sang des mêmes individus. Néanmoins, nous n’avons pas pu observer de production virale active par HIV-Flow dans les ganglions lymphatiques de ces individus, probablement en raison du faible nombre de cellules CD4+ obtenus. En conclusion, les observations réalisées dans le cadre de cette thèse nous aident à mieux comprendre le phénomène de persistance virale, qui constitue le principal obstacle à l’élimination du VIH. Ces résultats devraient aider au développement de stratégies thérapeutiques permettant la rémission des personnes infectées par le VIH., With nearly 35 million people infected worldwide and 60,000 in Canada, HIV remains a major public health problem. Although antiretroviral therapy (ART) has significantly improved the quality of life and lifespan of HIV-infected people, it does not completely eliminate the virus from the human body. HIV persistence is attributed to the existence of cellular and anatomical reservoirs in which the virus persists through residual replication and/or latency, and in which the virus is invisible to the host immune system and to ART. The development of new therapeutic strategies aimed at eliminating these viral reservoirs requires a thorough understanding of the nature of the cells in which the virus persists and of the molecular and virologic mechanisms contributing to viral persistence. Although the virus primarily persists in memory CD4+ T cells, the exact phenotype of the reservoir cells remains to be determined. The development of HIV-Flow, a flow cytometry-based assay allowing the detection of cells producing the viral protein p24, greatly facilitated the study of the reservoir cells’ phenotype. Our results suggest that the viral reservoir consists of a heterogeneous pool of cell subsets expressing various markers that are not specifically expressed by latently infected cells. Nevertheless, we have identified several markers preferentially expressed on the surface of p24+ cells, including PD-1, TIGIT and the a4b1 integrin. The identification of a4b1 as a marker of viral reservoirs opens the way to new therapeutic perspectives. Finally, our results show that translation-competent viruses persist in the three subsets of memory CD4 + T lymphocytes [central (TCM), transitional (TTM), and effector (TEM) memory lymphocytes], but are particularly enriched in TTM and TEM cells in ART-suppressed individuals. The three subsets of memory CD4+ T cells in which the virus persists have different properties in terms of survival and proliferation. The development of flow cytometry protocols to study various factors involved in the transcriptional expression of the proviral genome (histone acetylation, NF-kB, PTEF-b) revealed that these factors are expressed at different levels between subsets. This observation highlights the importance of taking into account the heterogeneity of viral reservoirs. We have shown that latency reversing agents have different abilities to modulate the levels of these factors between the different subsets. Finally, by using the HIV-Flow assay, we identified a combination of latency reversing agents that is highly effective to reactivate the virus in TCM cells. Further work should permit the identification of a combination that is capable of reactivating the virus very effectively in all subsets. Beyond the cellular reservoirs described above, HIV persists in a variety of anatomical sanctuaries. Since lymph nodes are a major site for HIV persistence, we studied the virologic iii mechanisms of viral persistence in this anatomical compartment. We showed that the frequency of cells producing tat/rev spontaneously is significatively higher in the lymph nodes compared to the blood. Nevertheless, we could not observe active viral production by HIV-Flow in the lymph nodes of these ART-suppressed individuals, probably due to the low number of CD4+ cells analyzed. In conclusion, the observations made in this thesis contribute to a better understanding of the phenomenon of viral persistence, which is the main obstacle to HIV eradication. These results should favor the development of new therapeutic strategies allowing the remission of HIV-infected people.

L’infection par le VIH reste un problème de santé publique majeur, non seulement car il n’existe pas de vaccin préventif, mais aussi, car le traitement par les antirétroviraux n’offre pas de solution curative définitive. Malgré les progrès considérables dans l’accessibilité et l’efficacité des traitements l’arrêt du traitement chez les individus possédant une charge virale indétectable conduit presque invariablement à un rebond viral. Le VIH établit une latence dans certains lymphocytes T CD4+, et plus particulièrement dans les sous-populations mémoires « centrales » « transitionnelles » et « effectrices » (TCM, TTM et TEM, respectivement). Lorsque la pression antirétrovirale est interrompue, ces cellules sont capables de produire de nouveaux virions infectieux qui seront la cause du rebond viral. Il est généralement admis que l’un des facteurs importants dans la maintenance de la latence du VIH est une inhibition de l’élongation, de la polyadénylation et de l’épissage des transcrits viraux. Dans ce travail, nous avons développé une technique de RT-PCR sensible et robuste couplée à l’utilisation de standards ARN. Cette technique permet la quantification absolue de différents transcrits du VIH-1 au sein de lymphocytes T CD4+ totaux ainsi que dans les différentes sous-populations mémoires afin d’établir leur profil transcriptionnel à l’état d’infection latente. Nous avons ainsi identifié un blocage potentiel dans la production de transcrits long, polyadénylés et polyépissés à l’état de latence. Dans le contexte curatif du « Shock and Kill », nous avons également évalué l’impact de différents agents pharmacologiques sur la réactivation de la transcription du VIH-1 en analysant le changement du profil transcriptionnel des lymphocytes T CD4+. Nous avons conclu que l’utilisation de différentes familles d’agents anti-latence était plus efficace dans l’induction de transcription en combinaison plutôt qu’utilisés seuls., Infection with HIV remains a serious public health issue as there is currently no preventive vaccine available, and the current treatment does not offer definitive curative results. Although significant progress has been made in efficacy and accessibility of treatment, its interruption in HIV-infected individuals who have undetectable viral load almost invariably leads to viral rebound. HIV establishes latency in CD4+ T cells and primarily in “central”, “transitional” and “effector” memory CD4+ T cell subsets (TCM, TTM et TEM, respectively). When the antiretroviral pressure is interrupted, these cells will produce new infectious virions that will be the cause of this viral rebound. It is generally accepted that one of the important factors regulating HIV latency resides in the inhibition of elongation, polyadenylation, and multiple-splicing of viral transcripts. We report in this work the successful generation of a robust and sensitive RT-PCR technique coupled with the use of RNA standards. This technique enables the absolute quantification of different transcripts of HIV-1 in total and in memory subsets of T CD4+ lymphocytes to establish their transcriptional profile in latent HIV-1 infection. We have identified potential blocks in transcription of long, polyadenylated and multiply spliced transcrits. In the curative context of the “Shock and Kill” approach, this work has also measured the impact of different latency reversing agents on the reactivation of HIV-1 transcription by analysing the changes in the transcriptional profile of CD4+ T lymphocytes. We have concluded that the utilization of different families of latency reversing agents are more efficient in the induction of transcription when combined rather than when used alone.