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Le lupus érythémateux systémique est une pathologie auto-immune rare certes mais qui intéresse les chercheurs par sa spécificité à pouvoir toucher différents organes. C'est la réaction de l'immunité contre des éléments du noyau cellulaire qui lui confère cette particularité. Les traitements standards du lupus érythémateux systémique permettent un contrôle de la maladie et un allongement des périodes sans crise. Néanmoins, ces traitements pris au long terme, peuvent causer de nombreux effets indésirables d'où la nécessité de trouver des alternatives thérapeutiques. Un grand nombre d'essais cliniques ont été réalisés ou sont en cours pour obtenir des biothérapies qui pourront bloquer des mécanismes responsables du lupus. A l'heure actuelle peu de molécules ont obtenu des résultats suffisants pour permettre leur commercialisation. Pourtant ces résultats ont l'avantage d'élargir les connaissances sur la maladie, en particulier sa physiopathologie. La thérapie cellulaire semble être une bonne alternative mais est, elle aussi, au stade d'étude. Cette thèse regroupe des études effectuées durant ces dernières années autour de ces deux alternatives thérapeutiques.

L'auteur de la thèse a souhaité limiter l'accès aux membres de l'Enseignement supérieur français.; Le tube digestif abrite entre 1012 et 1014 micro-organismes non pathogènes, constituant notre microbiote intestinal. Le rôle et les différentes fonctions de cet ensemble complexe sont de mieux en mieux connus. Les liens existants entre le microbiote, le système immunitaire et certaines pathologies, notamment le cancer, sont actuellement un sujet de recherche majeur. On sait aujourd'hui que le microbiote est un acteur notable dans la modulation de la mise en place et du fonctionnement du système immunitaire. De plus, l'implication du microbiote dans la carcinogénèse est maintenant documentée. En effet, de nombreuses études ont montré qu'une dysbiose intestinale associée à la présence de populations spécifiques peut être à l'origine de certains types de tumeurs. En parallèle, l'innovation thérapeutique portée par les immunothérapies dans le traitement des cancers a permis d'obtenir des résultats très prometteurs. Cependant, les réponses hétérogènes et transitoires retrouvées avec l'immunothérapie en font une limite à la généralisation à tous les patients de ces traitements. De plus, l'apparition d'effets secondaires potentiellement létaux est également une limite de ces traitements. Des recherches sont en cours de réalisation, permettant d'identifier des biomarqueurs qui prédisent la réponse aux immunothérapies en termes d'efficacité et de tolérance. Au regard des données recueillies, la connaissance spécifique des bactéries impliquées dans la réponse aux immunothérapies ainsi que l'analyse du microbiote des patients atteints de cancer permettraient de mettre en place une complémentation efficace, rétablir un microbiote compétent et ainsi obtenir de meilleurs résultats. Aujourd'hui, plusieurs options concernant le microbiote sont à l'étude. La transplantation fécale et l'apport oral de pro- et prébiotiques sont les deux principales. Des expérimentations supplémentaires sont nécessaires, mais la perspective d'une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer via la manipulation du microbiote intestinal se profile dans les années à venir.

Thèse confidentielle

L'auteur de la thèse a souhaité limiter l'accès aux membres de l'Enseignement supérieur français.; L'immunothérapie adoptive utilisant les lymphocytes T est une stratégie extrêmement prometteuse dans la lutte contre le cancer. Cependant, malgré le succès des CAR CD19, son utilisation reste complexe dans un contexte de tumeur solide. Le choix d'une cible sûre et la persistance in vivo des lymphocytes T génétiquement modifiés sont deux facteurs clés du succès d'un tel traitement. De ce fait, un outil de reprogrammation génique conférant une spécificité pour l'oncoprotéine E7 du papillomavirus humain a d'abord été validé sur des lymphocytes T provenant de sang périphérique. Puis, l'utilisation de sang placentaire comme source de lymphocytes T pour la thérapie cellulaire anti-tumorale a été étudiée en comparaison avec le sang périphérique. Qu'ils proviennent de sang périphérique ou de sang placentaire, les lymphocytes T générés expriment le transgène et sont fonctionnels en termes de sécrétion cytokinique et de dégranulation. Les lymphocytes T provenant de sang placentaire ont un profil moins différencié que ceux provenant de sang périphérique, phénomène associé à une fonctionnalité moins importante. Enfin, deux conditions de culture ont été comparées pour la génération de lymphocytes T transgéniques issus de sang placentaire. Lorsqu'ils sont cultivés avec de l'interleukine (IL)-7 et de l'IL-15, les lymphocytes T transgéniques provenant de sang placentaire présentent une plus forte expression du transgène et sont plus polyfonctionnels, en comparaison à une culture avec de l'IL-2. Cette étude renforce le fait que des lymphocytes T provenant de sang placentaire peuvent être génétiquement modifiés pour une utilisation en tant qu'immunothérapie anti-cancéreuse. Leur profil moins différencié pourrait permettre une plus longue persistance in vivo, tout en présentant des capacités anti-tumorales. Ces résultats permettent également de souligner l'intérêt du sang placentaire comme source de lymphocytes T plus économique et facile d'accès par rapport au sang périphérique.

The determination of the HLA compatibility at the structural level has proven its usefulness in donor/recipient matching and graft outcomes domains. The release of the HLAMatchmaker computer program has been one of the most substantial contributions in this field. HLAMatchmaker program allows one to obtain an exhaustive list of potential reactive eplets through a two-step approach: (i) emitting beads, referred to as positive beads, are identified using MFI (Mean Fluorescent Intensity) value thresholding and (ii) eplets which belong to all positive beads and do not belong to negative beads are reported as reactive. Such a technique has shown to perform well and extensive validations are reported in the literature but the results interpretations are time consuming because of their presentation even more when a lot of positivity are found in profiles. This paper consists in the presentation of a novel non negative least squares based method to facilitate the identification of the most probably HLA eplets involved in the positive results of single antigen class I tests. Such a model allows one to express the list of potential reactive eplets as a non negative least squares solution making use of all the MFI measurements simultaneously in a single step approach. A validation of the model has been conducted over three patients data. The obtained non negative least squares solutions delivers coherents reactives eplets with the one obtained using HLAMatchmaker (Version connected to the Fusion V4.2). The obtained results therefore suggest that our analysis method may complement the HLAMatchmaker program in order to make eplets analysis easier in a less time consuming and more pertinent/efficient way.

Les tumeurs primitives cérébrales, bien que rares, font partie des tumeurs de plus mauvais pronostic. Du fait de leur localisation, elles sont particulièrement difficiles à traiter par les moyens thérapeutiques conventionnels. Les chercheurs et les médecins s'intéressent de plus en plus à l'utilisation de traitements plus ciblés parmi lesquels l'immunothérapie prend une place grandissante. Cette approche visant à stimuler ou moduler le système immunitaire afin de favoriser la l'élimination des cellules cancéreuses s'est particulièrement développée au cours de ces dernières années, notamment avec la découverte des CAR T cell, lymphocytes T génétiquement modifiés et capable de reconnaitre spécifiquement un antigène donné. L'utilisation de cellules Natural Killer est approche différente permettant l'utilisation de cellules allogéniques, plus flexible et moins chères à produire, sans risque d'induction de GvHD chez le patient. Les cellules Natural Killer sont un sous type de lymphocyte CD3-CD56+ capables de reconnaitre et détruire directement les cellules étrangères ou altérées (tumorales ou infectées) et ce en l'absence d'immunisation spécifique préalable mais grâce un répertoire varié de récepteurs activateurs et inhibiteurs capables de reconnaitre un grand nombre de ligands. De nombreux auteurs se sont intéressés à l'utilisation de cellules NK dans le traitement du plus agressif des cancers cérébraux: le glioblastome. Les essais cliniques sur l'utilisation de LAK ou cellules NK injectées en intracérébral ont prouvé que la méthode était sûre, et les études précliniques sur l'utilisation de NK CAR ont montré des résultats plutôt positifs compte tenu de l'agressivité de ce type de tumeur. Cependant, peu d'étude se sont intéressées à l'utilisation des cellules NK comme traitement du médulloblastome qui est la tumeur cérébrale maligne la plus fréquente dans la population pédiatrique. Le but de notre étude expérimentale a donc été d'évaluer l'effet cytotoxique de cellules NK allogéniques envers des cellules de médulloblastome. Les cellules NK ont été sélectionnées à partir de cellules sanguines de donneurs sains par technique immunomagnétique, puis amplifiées ex vivo en présence d'interleukine 15. Après expansion, le potentiel cytotoxique des cellules NK a été évalué in vitro par différents tests ciblant chaque étape impliquée dans le processus de lyse tumorale : l'aspect phénotypique initial des cellules tumorales par cytométrie en flux, la conjugaison par cytométrie en flux, la dégranulation des cellules NK par technique Elispot granzyme B et enfin la mort des cellules cibles, par nécrose, apoptose tardive et lyse cellulaire par cytométrie en flux et mesure de la libération d'adénylate kinase. Trois lignées établies à de médulloblastome ont été analysées : les lignées DAOY, D283 et D341, et comparées à la lignée de cellules leucémiques K562, connue comme étant très sensible aux cellules NK. Les résultats obtenus ont montré que les 3 lignées de médulloblastome étaient sensibles à la cytotoxicité des cellules NK, et particulièrement la lignée DAOY. Cependant les résultats étaient très hétérogènes d'une lignée à l'autre et dépendaient aussi du donneur de cellules NK. L'analyse de l'expression des récepteurs activateurs et inhibiteurs des cellules NK ainsi que celle des ligands correspondants sur les cellules de médulloblastome notamment les molécules du CMH de classe 1 permettrait de prédire cette cytotoxicité voir de screener les donneurs afin de trouver la meilleur lignée de NK pour une cible donnée. Les résultats de ce travail in vivo permettront par la suite de réaliser une étude in vivo chez l'animal.

L'auteur de la thèse a souhaité limiter l'accès aux membres de l'Enseignement supérieur français.; Le syndrome de Guillain et Barré (SGB), maladie neurologique appartenant aux neuropathies périphériques, est depuis la disparition totale de la poliomyélite la cause la plus fréquente de paralysies aigues extensives dans les pays développés. Cette pathologie se caractérise par une paralysie symétrique ascendante progressive, pouvant même parfois atteindre les muscles respiratoires et nécessitant ainsi une hospitalisation en réanimation. Cela fait 100 ans que les premiers symptômes du Syndrome de Guillain et Barré ont été décrits, et la physiopathologie se précise un peu plus chaque jour. Cependant, il semblerait qu'elle soit très compliquée et que de nombreux acteurs entrent en jeu. Le SGB étant une pathologie aiguë, les patients sont traités en urgence. Il existe aujourd'hui deux types de traitements pour ce syndrome : les immunoglobulines intraveineuses ou les échanges plasmatiques. Cette thèse comporte deux principaux objectifs, le premier étant de faire l'état des lieux sur ce que l'on sait aujourd'hui sur ce syndrome, en allant de la physiopathologie aux différents traitements et à d'éventuelles perspectives thérapeutiques. Le second objectif est de recueillir le ressenti et le vécu des patients concernant « l'après-maladie » afin d'observer l'impact de ce syndrome sur leur vie.

The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations, Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique

The ability of natural killer (NK) cells to kill tumor cells without the need to recognize a tumor-specific antigen provides advantages over T cells and makes them appealing for a use as effectors for adoptive immunotherapy. However, the full therapeutic potential of NK cell-based immunotherapy has not been fully investigated in the context of leukemic relapse after hematopoietic stem cell transplantation. Today, patients relapsing after hematopoietic stem cell transplantation are often treated with donor lymphocyte infusion (DLI) based on small cell fractions frozen at the time of the stem cell transplantation. Since peripheral blood stem cells are increasingly used as stem cell source and as source of cells for DLI, we aimed to evaluate the impact of G-SCF mobilization on NK cell phenotype and functions. Therefore, we compared the expansion capacity, the phenotype and the function of NK cells from blood for healthy donors, from allogeneic HSCT healthy donors or from autologous HSCT from patients. We also determine the impact of G-CSF on NK cell subset repartition before and after expansion in presence of IL-15. Our results showed that G-CSF administration to patients decreases CD56brightCD16+ NK cell population, proliferation and function. Overcoming this impairment in lymphoid capacity may be important to facilitate post-transplant immunotherapy., Les cellules Natural Killer (NK) sont capables de lyser les cellules tumorales sans la nécessité de reconnaitre un antigène tumoral spécifique. Cette propriété leur confère un avantage par rapport aux lymphocytes T et les rend intéressantes à utiliser en tant que cellules effectrices pour l’immunothérapie adoptive. A ce jour, le potentiel thérapeutique des cellules NK n’a pas été complétement exploré notamment dans le contexte du traitement de la rechute post-allogreffe de cellules souches hématopoïétiques. Actuellement, les patients en rechute post-greffe sont traités avec des injections de lymphocytes du donneur (DLI) parfois issues de petites fractions du greffon de cellules souches hématopoïétiques congelées. Les cellules souches périphériques étant fréquemment utilisées comme source de cellules souches et parfois utilisées comme DLI, nous avons souhaité évaluer l’impact du G-CSF sur le phénotype et les fonctions des cellules NK présentes dans ces fractions. Dans cet objectif, nous avons comparé différentes sources de cellules NK isolées à partir de sang de donneurs sains, de sang mobilisé de donneurs sains ou de patients et observé l’évolution des différentes sous-populations de cellules NK issues de ces prélèvements au décours d’une expansion en présence d’IL-15. Nos résultats ont montré que l’administration de G-CSF diminuait la proportion de cellules NK CD56brightCD16+ au profit d’une population CD16-, diminuait la prolifération des cellules NK lors de l’expansion en culture, et modifiait les propriétés fonctionnelles des cellules NK.

La maladie de Behçet est une vascularite chronique et systémique caractérisée notamment par des lésions buccales, génitales et des manifestations oculaires.C’est une maladie rare surtout reportée dans les populations de l’ancienne « route de laSoie ». Elle se déclare généralement chez l’adulte dans la troisième décade de vie. La maladie est caractérisée par des épisodes récurrents d’aphtes buccaux, qui peuvent être accompagnés d’aphtes génitaux, de signes cutanés (pseudofolliculite, érythème noueux) ainsi que de troubles oculaires (notamment d’uvéites) ou d’un test pathergique positif. D'origine inconnue, des données épidémiologiques suggèrent que le processus autoimmune inflammatoire est multifactoriel, résultant de facteurs environnementaux liés à uneprédisposition génétique de la maladie. L'antigène HLAB5 est associé à la maladie de Behçet dans de nombreux cas et des niveaux anormaux de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, TNF-a, IL-8, IL-12, IL-17 et IL-21) sont impliqués dans la pathogenèse de la maladie. Ces facteurs pourraient favoriser certaines infections (en particulier Streptococcus sanguis) qui provoquent le déclenchement des poussées inflammatoires. Les patients sont actuellement traités par immunosuppresseurs, notamment par des corticoïdes. Les nombreux effets indésirables liés à la prise d’une corticothérapie au long cours posent de nombreux problèmes. Les biothérapies pourraient permettre unemeilleure prise en charge des patients. Plusieurs études cliniques sont en cours de recrutement actuellement, dont deux en phase III. Les trois molécules à l’essai : abatacept, ustekinumab et apremilast ont déjà obtenu une AMM dans une autre pathologie inflammatoire. L’obtention d’une AMM pour ces biothérapies serait donc une véritable avancée dans la thérapie de la maladie de Behçet. Plusieurs facteurs freinent la mise en oeuvre d’un essai clinique dans le cadre d’une maladie orpheline. Le recrutement est difficile, dû au nombre limité de patients. Un schéma d’étude doit être mis au point afin d’être adapté à de petits effectifs. Cela permet d’obtenir une puissance statistique satisfaisante afin d’obtenir des résultats significatifs en termes d’efficacité. Le coût de la réalisation d’un essai clinique est également plusimportant ce qui rend les industries peu enclines à développer des médicaments orphelins

L'immunophénotypage lymphocytaire sanguin possède une place importante dans la démarche diagnostique deslymphomes en phase leucémique. Dans 20% des diagnostics, la classification de la pathologie n'est pasconfirmée soit par absence de marqueur spécifique, soit parce que l'examen anatomopathologique (« goldstandard ») est non disponible ou non discriminant. Le choix des marqueurs lymphoïdes, la recherche denouveaux marqueurs, et l?interprétation de l'immunophénotypage prennent alors une place importante dans ladémarche diagnostique. Nous avons donc évalué les différents marqueurs du panel lymphocytaire ainsi que denouveaux marqueurs : CD148, CD180 et CD200. Nous avons testé un logiciel de traitement de donnéescytométriques ainsi que quelques-unes de ses fonctionnalités. Dans un premier temps, nous avons déterminé lesintensités moyennes de fluorescence pour chaque marqueur dans la CLL, le MZL, et le MCL utile pour lavalidation quotidienne des immunophénotypages. Dans un second temps, l?étude du panel lymphocytaire amontré des marqueurs discriminants comme des expressions faibles dans la CLL des CD20, FMC7, CD79b, etCD81 ainsi qu'une expression faible des chaines légères ou un CD38 très fort dans le MCL. Les nouveauxmarqueurs apportent des arguments complémentaires dans l?interprétation : un CD200 fort dans la CLL, unCD180 fort dans le MZL et un CD148 fort associé à un CD200 faible dans le MCL. Le logiciel INFINICYTpermet de comparer graphiquement les différentes entités entre elles, et propose des représentations permettantde mettre en avant les marqueurs les plus discriminants comme l?APS. La fonction compas apporte une aidesupplémentaire dans la validation des immunophénotypages grâce à la création d?une base de données maisnécessite une standardisation des protocoles d?analyses. A l'avenir, ce type de logiciel pourra être utilisé dans lavalidation des immunophénotypages, et dans la recherche de nouveaux marqueurs pour la caractérisation dessyndromes lymphoprolifératifs B matures.

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul espoir thérapeutique dans le casd’hémopathies malignes ou de déficit immunitaires congénitaux. Différentes sources sont utilisées : lamoelle osseuse, les cellules souches du sang périphérique ou encore les unités de sang placentaire.Chacune possède ses avantages et inconvénients, mais dans tous les cas la greffe présente des effetssecondaires redoutables, principalement la réaction du greffon contre l’hôte, responsable d’unemortalité post- greffe élevée, après les rechutes des hémopathies.Les conditions optimales sont encore imparfaitement connues, qu’il s’agisse des compatibilités desmolécules du Complexe Majeur d’Histocompatibilité ou bien d’autres facteurs génétiques quipourraient avoir un rôle important.Les techniques de typage HLA actuellement utilisées n’arrivent plus à satisfaire les exigences de plusen plus strictes des standards de l’EFI. Le Séquençage Sanger est devenu une technique indispensablepour permettre au laboratoire d’être en conformité avec ces exigences. Parallèlement, l’arrivée duséquençage de nouvelle génération, apporte des solutions intéressantes, en termes de résolution detypage et de débit.Le premier objectif de cette thèse est de montrer l’amélioration apportée par le séquençage Sanger,dans la qualité des résultats rendus par le laboratoire du CHRU de Nancy. Nous constateronségalement que le séquençage Sanger possède ses propres limites, repoussées par les technologies de2ième et 3ième génération arrivant sur le marché. Nous discuterons ainsi de l’intérêt de la mise en placede ces nouvelles générations, et nous comparerons les différentes technologies disponibles sur lemarché. Ces avancées nous permettrons d’explorer plus aisément les facteurs influençant la réussited’une greffe de moelle. Elles faciliteront également l’incrémentation des registres de DonneursVolontaires de Moelle Osseuse avec des typages plus complets, contribuant à la valorisation desdonneurs inscrits sur le registre français.

La pharmacie de notre établissement prépare pour le service d'allergologie les dilutions nécessaires à laréalisation des tests pour intradermoréactions (IDR). Les préparations sont stériles, réalisées sous hotte àflux d’air laminaire vertical, en atmosphère contrôlée ; elles sont destinées à un patient et sont faites lejour de la pose. L'objectif de notre travail est de déterminer le coût direct lié à cette préparation pour desordonnances standards avec les principaux produits responsables d’allergies (antibiotiques, produits decontraste iodés, anti-inflammatoires ...)Nous avons déterminé les coûts directs liés à trois postes de dépenses : le personnel (mesure du tempspharmacien et préparateur en pharmacie hospitalière nécessaire), les matières premières, médicaments etdispositifs médicaux (coût d’achat en fonction des appels d’offres de l’établissement) et le conditionnementdes dilutions en flacons stériles (coût d’achat selon les appels d’offres). Le calcul a été fait sur huitordonnances.En 2014, la pharmacie a préparé 7536 dilutions d’IDR : anti infectieux (33%), produits de contraste(19%), anesthésiques (16%), anti-inflammatoires (11%), héparines (6%), antinéoplasiques (3%) et autres(12%). Le coût moyen est de 111,15€ [58,76-153,57], les matières premières représentent 13% [1,71-41,15],le conditionnement en flacon stérile 27% [17,74-36,95], le matériel nécessaire à la préparation 9% [6,10-11,04] et la main d’oeuvre 51% [33,21-66,56].Ce coût calculé peut paraitre élevé mais il garantit la qualité et la reproductibilité des préparations ainsique leur interprétation par le personnel médical. Des pistes sont en cours d’exploration pour rationnaliserles dépenses : convocation de plusieurs patients le même jour pour les mêmes batteries, rationalisation del’utilisation du matériel, études de stabilité permettant de conserver les flacons entre deux séances. Letravail suivant est la comparaison de ces coûts de préparation et des coûts liés à la pose par les infirmièresdes IDR avec le tarif d’hospitalisation du groupe homogène de séjour (GHS) d’un patient hospitalisé pourla réalisation de tests cutanés.

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the standard treatment for malignant or non-malignant hematological disorders or primary immunodeficiencies. However, microbiological infections especially viral infections are the major cause for morbidity and mortality for the patients after HSCT except the GvHD and disease relapse. It comes often in the period of absence of cellular immunity when the antiviral treatment is not always efficiency with an important toxicity. So the alternative treatment is adoptive cellular immunotherapy by infusion of virus specific T cells (VSTs) which has been shown efficacy in virus infections control after HSCT. In UTCT, they have produced the VSTs-ADV with a good procedure conforming to the European laws for clinical use and a clinic trial is in processing. So my work was to produce the VSTs-EBV with the same model aiming to promote a clinic trial in future. Furthermore, there are several subsets of T lymphocytes. Each subset has their own unique feature which decides their efficacy in viral infection control. Especially the discovery of stem cell like memory T cells (TSCM) with an important self-renewed ability which is critical in successful immunotherapy in viral infection or tumor control inspire us to study the distribution of subsets for VSTs. Finally, it’s advantageous to produce the VSTs targeted two or more virus in the same time with one production which is more economical. So we are interested in producing the VSTs bi-specific to ADV and EBV. Here, we present firstly our results of six production of VSTs-EBV with a synthesized antigen which is compatible with clinic use and is defined in advance. Also the specificity, efficiency in eliminating the virus and the non toxicity with a weak alloreactivity are confirmed in vitro after a short-term cell culture with IL-2. Then we showed the results obtained with the T cell subset study in producing the VSTs-ADV for clinical trial and VSTs-CMV for validation of clinical grade medium TEXMACS for cell culture in producing the VSTs. We describe the distribution of T cell subsets in healthy donors (Before selection), also after selection and after expansion in vitro with IL-2. Finally, we present the preliminary results of producing the VSTs bi-specific with three donors, in total 3 VSTs-ADV, 3 VSTs-EBV and 3VSTs-ADV/EBV are generated. The comparison between the bi-specific VSTs and mono-specific VSTs in aspect of specificity, efficiency to eliminate the viral infection and toxicity of presenting the alloreactivity in vitro showed advantage to produce the bi-specific VSTs with one selection in keeping the same specific, efficiency and weak toxicity as mono-specific VSTs; L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement standard pour hémopathies bénigne ou malignes et immunodéficience primaire. Cependant, sauf le GvHD et la rechute de la maladie, l’infection microbiologique notamment l’infection virale est la complication fréquente des allogreffes qui est souvent responsable de la morbidité et la mortalité. Ces infections surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire. Les traitements médicamenteux anti-viraux qui ne sont pas toujours efficace et avec une toxicité non inégligeable. Donc le traitement prometteux est l’immunothérapie cellulaire notamment celui-ci avec l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux (VSTs). A UTCT, la production de VSTs-ADV a été mis au point depuis 2010 et une protocole clinique avec VSTs-ADV est en cours. Donc mon travail est s’inscrit dans ce thème pour produire les VSTs-EBV afin de proposer une protocole clinique. Comme les lymphocytes T ont plusieurs sous-populations, chaque sous-population présente des caractères différentes et leur efficacité en immunothérapie est limité par leur caractère. Notamment avec la découverte de Lymphocytes T mémoire à cellules souches (TSCM) qui joue un rôle très important en immunothérapie anti-cancéreux ou anti-viraux, nous nous intéréssons à étudier la compostion de sous-populations de VSTs. A la fin, c’est toujours avantageux de produire le VSTs contre deux ou plusieurs virus simutanément avec une économie financielle et personnelle. Nous voulons produire le VSTs bispécifique. Dans ce travail, premièrement, nous montrons le résulat de la mise au point de la production de VSTs-EBV de grade clinique qui est confromé à la réglémentation européenne. 6 productions ont été réalisées avec un antigène synthétique préablement défini qui est compatible avec utilisation clinique. In vitro, ces VSTs-EBV montre une spécificité, efficacité et non toxicité. Deuxième, nous illustrons nos résulats sur l’étude déscriptive de sous-populations de VSTs-ADV et CMV. D’abord nous montrons la distribution de sous-populations de VSTs chez les donneurs saints (avant la séléction), puis nous analysons la distribution après séléction immunomagnétique et aussi après expansion in vitro avec cytokine IL-2. A la fin , nous montrons nos résultats préliminaires sur les 3 productions de VSTs bispécifique anti-ADV et anti-EBV. Et nous les comprarer avec les VSTs monospécifique au niveau de qualité de production et spécificité, efficacité et toxicité in vitro

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the standard treatment for malignant or non-malignant hematological disorders or primary immunodeficiencies. However, microbiological infections especially viral infections are the major cause for morbidity and mortality for the patients after HSCT except the GvHD and disease relapse. It comes often in the period of absence of cellular immunity when the antiviral treatment is not always efficiency with an important toxicity. So the alternative treatment is adoptive cellular immunotherapy by infusion of virus specific T cells (VSTs) which has been shown efficacy in virus infections control after HSCT. In UTCT, they have produced the VSTs-ADV with a good procedure conforming to the European laws for clinical use and a clinic trial is in processing. So my work was to produce the VSTs-EBV with the same model aiming to promote a clinic trial in future. Furthermore, there are several subsets of T lymphocytes. Each subset has their own unique feature which decides their efficacy in viral infection control. Especially the discovery of stem cell like memory T cells (TSCM) with an important self-renewed ability which is critical in successful immunotherapy in viral infection or tumor control inspire us to study the distribution of subsets for VSTs. Finally, it’s advantageous to produce the VSTs targeted two or more virus in the same time with one production which is more economical. So we are interested in producing the VSTs bi-specific to ADV and EBV. Here, we present firstly our results of six production of VSTs-EBV with a synthesized antigen which is compatible with clinic use and is defined in advance. Also the specificity, efficiency in eliminating the virus and the non toxicity with a weak alloreactivity are confirmed in vitro after a short-term cell culture with IL-2. Then we showed the results obtained with the T cell subset study in producing the VSTs-ADV for clinical trial and VSTs-CMV for validation of clinical grade medium TEXMACS for cell culture in producing the VSTs. We describe the distribution of T cell subsets in healthy donors (Before selection), also after selection and after expansion in vitro with IL-2. Finally, we present the preliminary results of producing the VSTs bi-specific with three donors, in total 3 VSTs-ADV, 3 VSTs-EBV and 3VSTs-ADV/EBV are generated. The comparison between the bi-specific VSTs and mono-specific VSTs in aspect of specificity, efficiency to eliminate the viral infection and toxicity of presenting the alloreactivity in vitro showed advantage to produce the bi-specific VSTs with one selection in keeping the same specific, efficiency and weak toxicity as mono-specific VSTs, L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement standard pour hémopathies bénigne ou malignes et immunodéficience primaire. Cependant, sauf le GvHD et la rechute de la maladie, l’infection microbiologique notamment l’infection virale est la complication fréquente des allogreffes qui est souvent responsable de la morbidité et la mortalité. Ces infections surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire. Les traitements médicamenteux anti-viraux qui ne sont pas toujours efficace et avec une toxicité non inégligeable. Donc le traitement prometteux est l’immunothérapie cellulaire notamment celui-ci avec l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux (VSTs). A UTCT, la production de VSTs-ADV a été mis au point depuis 2010 et une protocole clinique avec VSTs-ADV est en cours. Donc mon travail est s’inscrit dans ce thème pour produire les VSTs-EBV afin de proposer une protocole clinique. Comme les lymphocytes T ont plusieurs sous-populations, chaque sous-population présente des caractères différentes et leur efficacité en immunothérapie est limité par leur caractère. Notamment avec la découverte de Lymphocytes T mémoire à cellules souches (TSCM) qui joue un rôle très important en immunothérapie anti-cancéreux ou anti-viraux, nous nous intéréssons à étudier la compostion de sous-populations de VSTs. A la fin, c’est toujours avantageux de produire le VSTs contre deux ou plusieurs virus simutanément avec une économie financielle et personnelle. Nous voulons produire le VSTs bispécifique. Dans ce travail, premièrement, nous montrons le résulat de la mise au point de la production de VSTs-EBV de grade clinique qui est confromé à la réglémentation européenne. 6 productions ont été réalisées avec un antigène synthétique préablement défini qui est compatible avec utilisation clinique. In vitro, ces VSTs-EBV montre une spécificité, efficacité et non toxicité. Deuxième, nous illustrons nos résulats sur l’étude déscriptive de sous-populations de VSTs-ADV et CMV. D’abord nous montrons la distribution de sous-populations de VSTs chez les donneurs saints (avant la séléction), puis nous analysons la distribution après séléction immunomagnétique et aussi après expansion in vitro avec cytokine IL-2. A la fin , nous montrons nos résultats préliminaires sur les 3 productions de VSTs bispécifique anti-ADV et anti-EBV. Et nous les comprarer avec les VSTs monospécifique au niveau de qualité de production et spécificité, efficacité et toxicité in vitro

Mesenchymal Stromal/Stem Cells from human Wharton’s jelly (WJ-MSC) are an abundant and interesting source of stem cells for applications in cell and tissue engineering. Their fetal origin confers specific characteristics compared to Mesenchymal Stromal/Stem Cells isolated from human bone marrow (BM-MSC). First, the aim of this work is to optimize WJ-MSC culture conditions for their subsequent clinical use. We focus on the influence of oxygen concentration during monolayer expansion on several parameters to characterize MSC. The results are compared to those obtained with BM-MSC. Our work distinguishes WJ-MSC from BM-MSC in terms of proliferation and adipogenic differentiation. Considering our results, hypoxia during cell expansion is an important parameter to take into account regarding proliferation potential but also chondrogenic differentiation potential. The influence of obstetric factors on WJ-MSC characteristics is also explored. In cartilage tissue engineering context, the second phase of the project is to induce cell differentiation into chondrocytes by seeding them in Alginate/Hyaluronic Acid hydrogel scaffold, and during 28 days. The results obtained are compared to those obtained with BM-MSC. After 4 weeks of culture, WJ-MSC are able to adapt to their environment and express specific cartilage-related genes and matrix proteins such as type 2 collagen, which is found more expressed after differentiation fromWJ-MSC, than from BM-MSC; Les cellules stromales/souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton humaines (CSM-WJ) représentent une source abondante et intéressante de cellules souches pour des applications en ingénierie cellulaire et tissulaire. Leur origine fœtale leur confère des caractéristiques spécifiques par rapport aux cellules stromales/souches mésenchymateuses isolées à partir de moelle osseuse humaine (CSM-MO). Tout d'abord, le but de ce travail est d'optimiser les conditions de culture des CSM-GW pour leur utilisation clinique ultérieure. Nous nous concentrons sur l'influence de la concentration en oxygène lors de l'expansion en monocouche de P1 à P7 sur plusieurs paramètres permettant de caractériser les CSM. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Notre travail a montré des différences entre les deux sources cellulaires en termes de prolifération et de différenciation adipocytaire. D’après nos résultats, l'hypoxie, au cours de l'expansion, est un paramètre important à prendre en compte en ce qui concerne la prolifération et le potentiel de différenciation chondrocytaire. L'influence des facteurs obstétricaux sur les caractéristiques des CSM-GW est également explorée. Cette étude se situant également dans le cadre de l’ingénierie tissulaire du cartilage, la seconde phase du projet consiste à induire la différenciation des cellules en chondrocytes en ensemençant ces dernières dans un biomatériau à base d’alginate et d’acide hyaluronique, et sur une cinétique de 28 jours. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Après 4 semaines de culture, les CSM-GW sont capables de s'adapter à leur environnement et d’exprimer des gènes et des protéines matriciels spécifiques du cartilage tels que le collagène de type 2, qui se trouve plus exprimé après différenciation à partir des CSM-GW qu’à partir de CSM-MO

Située au CHU de Brabois, la Banque de Sang Placentaire (BSP) de Nancy a ouvert sesportes le 19 novembre 2012. Cette BSP est associée à la Polyclinique Majorelle qui s’occupe durecrutement des mères et du prélèvement des Unités de Sang Placentaire (USP).Le Réseau Français de Sang Placentaire (RFSP), créé en janvier 1999 par l’Agence de laBiomédecine (ABM), a mis en place des critères stricts de sélection des USP mis en banque. Ainsidès leur réception à la BSP, les USP sont mises en production et éliminées pour qu’il ne reste que lesUSP conforme à toutes les spécifications du RFSP. Les causes d’élimination sont très diverses :volume sanguin trop faible, nombre de cellules nucléées totales (CNT) trop faible, nombre de cellulesCD34+ trop faible, contamination microbienne, problème au moment de la congélation… Nous allonsdétailler ici toutes ces causes et voir s’il existe des moyens de les limiter afin d’obtenir un meilleurrendement d’USP inscrites sur le registre national France Greffe de Moelle (FGM) par rapport à tousles prélèvements effectués.Deux facteurs prioritaires sont pris en compte lors de la cession d’une USP en vue d’unegreffe de CSH : la compatibilité HLA entre le donneur et le receveur et le nombre de CNT en fonctiondu poids du receveur. Nous décrirons ici les caractéristiques des USP inscrites sur le registre nationalpar la BSP de Nancy afin de déterminer si ces nouvelles USP inscrites apportent un plus par rapport àtoutes les USP déjà inscrites sur le registre.

Mesenchymal Stromal/Stem Cells from human Wharton’s jelly (WJ-MSC) are an abundant and interesting source of stem cells for applications in cell and tissue engineering. Their fetal origin confers specific characteristics compared to Mesenchymal Stromal/Stem Cells isolated from human bone marrow (BM-MSC). First, the aim of this work is to optimize WJ-MSC culture conditions for their subsequent clinical use. We focus on the influence of oxygen concentration during monolayer expansion on several parameters to characterize MSC. The results are compared to those obtained with BM-MSC. Our work distinguishes WJ-MSC from BM-MSC in terms of proliferation and adipogenic differentiation. Considering our results, hypoxia during cell expansion is an important parameter to take into account regarding proliferation potential but also chondrogenic differentiation potential. The influence of obstetric factors on WJ-MSC characteristics is also explored. In cartilage tissue engineering context, the second phase of the project is to induce cell differentiation into chondrocytes by seeding them in Alginate/Hyaluronic Acid hydrogel scaffold, and during 28 days. The results obtained are compared to those obtained with BM-MSC. After 4 weeks of culture, WJ-MSC are able to adapt to their environment and express specific cartilage-related genes and matrix proteins such as type 2 collagen, which is found more expressed after differentiation fromWJ-MSC, than from BM-MSC, Les cellules stromales/souches mésenchymateuses de la gelée de Wharton humaines (CSM-WJ) représentent une source abondante et intéressante de cellules souches pour des applications en ingénierie cellulaire et tissulaire. Leur origine fœtale leur confère des caractéristiques spécifiques par rapport aux cellules stromales/souches mésenchymateuses isolées à partir de moelle osseuse humaine (CSM-MO). Tout d'abord, le but de ce travail est d'optimiser les conditions de culture des CSM-GW pour leur utilisation clinique ultérieure. Nous nous concentrons sur l'influence de la concentration en oxygène lors de l'expansion en monocouche de P1 à P7 sur plusieurs paramètres permettant de caractériser les CSM. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Notre travail a montré des différences entre les deux sources cellulaires en termes de prolifération et de différenciation adipocytaire. D’après nos résultats, l'hypoxie, au cours de l'expansion, est un paramètre important à prendre en compte en ce qui concerne la prolifération et le potentiel de différenciation chondrocytaire. L'influence des facteurs obstétricaux sur les caractéristiques des CSM-GW est également explorée. Cette étude se situant également dans le cadre de l’ingénierie tissulaire du cartilage, la seconde phase du projet consiste à induire la différenciation des cellules en chondrocytes en ensemençant ces dernières dans un biomatériau à base d’alginate et d’acide hyaluronique, et sur une cinétique de 28 jours. Les résultats obtenus sont comparés à ceux obtenus avec les CSM-MO. Après 4 semaines de culture, les CSM-GW sont capables de s'adapter à leur environnement et d’exprimer des gènes et des protéines matriciels spécifiques du cartilage tels que le collagène de type 2, qui se trouve plus exprimé après différenciation à partir des CSM-GW qu’à partir de CSM-MO

L'allogreffe permet d'exercer un effet allogénique, en cas de pathologies hématologiques malignes, ou de pallier une hématopoïèse défaillante. La source historique de greffon de cellules souches hématopoïétiques est médullaire. Actuellement, une des méthodes d'évaluation des cellules souches hématopoïétiques est la quantification en cytométrie en flux de l'antigène CD34+. Or, contrairement à l'autogreffe et à l'allogreffe avec greffon de type cellules souches périphériques, il n'y a pas de consensus sur une quantité minimale de CD34+ optimale dans le greffon médullaire. De plus, en cas d'incompatibilité de groupe sanguin, il est nécessaire de réaliser des manipulations sur le greffon qui peuvent entrainer une perte de CD34+.Matériels et méthodes : Nous avons étudié rétrospectivement toutes les allogreffes réalisées à Nancy de 2006 à 2011, afin de déterminer l'impact des caractéristiques du donneur (âge, sexe, compatibilité HLA, apparenté ou non), des caractéristiques du receveur(âge, sexe, pathologie maligne ou non), de la composition du greffon en cellules nucléées totales, CD34+, CFU-GM, CD3+ et des manipulations sur le greffon, sur la reconstitution hématopoïétique, la survie globale à 5 ans, la survie sans maladie, la rechute, les complications (GVH, infections et pathologies de l'endothélium). La quantité de CD34+ est évaluée selon les recommandations internationales (ISHAGE) en double plateforme.Résultats : En cas de greffon comportant plus de 3.47x106 CD34+/kg, on observesignificativement plus de maladie veino-occlusive (p=0.0119) mais moins d'infectionbactériennes et fongiques (p=0.0475 et p=0.0436). Un seuil de CD34+/kg supérieur à2.7x106 diminue significativement le risque d'infections fongiques (p=0.0095). Nousn'observons pas de différence significative liée à la composition cellulaire en termes desurvie globale à 5 ans et sans maladie à 5 ans, de rechute et de mortalité liée à latransplantation. Concernant, la reconstitution hématopoïétique, la faible quantité de CNT/kg dans le greffon est un facteur de risque significatif (p=0.0482) pour les patients reconstituants le plus lentement les PNN et les plaquettes. La reconstitution hématopoïétique n'est pas liée significativement à la dose de CD34+, de CFU-GM ou de CD3+.Les manipulations du greffon liées aux incompatibilités de groupe ABO n'ont pas d'impact significatif sur la survie globale et sans rechute à 5 ans.Conclusion : En analyse multivariée, le seul paramètre, ayant un impact négatif significatif sur la survie globale et la survie sans maladie à 5 ans, est un âge élevé du receveur. En cas d'incompatibilité de groupe ABO majeure ou complexe, nous proposons de prélever au moins 4.24x108 CNT/kg en vue de réinjecter au moins 3.47x106 CD34+/kg. Dans la procédure de choix d'un donneur, l'incompatibilité ABO ne devrait pas conduire à réfuter un donneur

Stem cells are the hopes for cell therapy and tissue engineering. MSCs from fetal tissue (umbilical cord blood and WJ), which are a source of embryonic epiblast grow relatively faster comparing to other adult sources. The culture condition can affect cell behavior. In our study, we explored the effect of oxygen concentration on the expansion, immunophenotyping, and differentiation of these cells. The aim of this work is to identify the optimal method for isolation of MSCs derived from fetal tissue. Given the low rate of success in the isolation of MSCs from cord blood, we headed to WJ-MSCs. We have determined in siu, the specific markers expressed in the WJ and in the perivascular region. Studies on the morphology growth kinetics, and phenotypic expression of surface makers of MSCs isolated from WJ were made over a long period (7 passages) in different culture conditions. We have shown that WJ is composed of an abundant extracellular matrix rich in collagen and glycasominoglycans and have variable phenotype depending from their localization in the jelly. This tissue is able to provide a large amount of MSCs (6.7x105 Cs/cm of cord) that maintain a constant morphology. Finally, regardless of the passage, the oxygen concentration does not effect on the phenotype of the cells. In contrast, a low oxygen concentration during expansion appears to decrease the doubling time of MSCs, promote chondrogenesis and inhibit osteogenic differentiation. Finally, whatever the culture conditions, adipogenic differentiation of WJ-MSC seems difficult to obtain; Les cellules souches suscitent de grands espoirs pour la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire. Les CSM du tissus foetaux (sang placentaire et gelée de Wharton du cordon ombilical), à l'origine d'épiblaste embryonnaire, sont considérées comme plus primitives que les CSM provenant de sources adultes. Les conditions de culture ayant un impact sur le comportement des cellules, dans notre étude, nous avons exploré l'effet de la concentration de l'oxygène sur l'expansion, l'immunophénotypage et la différenciation de ces cellules. L'objectif de ce travail est d'identifier la méthode optimale d'isolation des CSM issues de tissus foetaux. Compte tenu du faible taux de succès dans l'isolement des CSM extraites du sang placentaire, nous nous sommes dirigés vers les CSM-GW. Nous y avons déterminé in situ, les marqueurs spécifiques exprimés dans la gelée de Wharton et à la périphérie. Des études sur la morphologie, la cinétique de croissance, et sur l'expression phénotypique des marqueurs de surface, des CSM-GW, ont été effectuées sur une longue durée (7 passages) à différentes conditions de culture. Nous avons montré que la GW est composée d'une abondante matrice extracellulaire riche en collagènes et glycosaminoglycannes et que les cellules possèdent un phénotype variable selon leur localisation dans la gelée. Ce tissu est capable de fournir une quantité importante de CSM (6,7x105 Cs/cm de cordon) qui gardent une morphologie constante. Enfin, quel que soit le passage, la concentration de l'oxygène ne semble pas avoir d'effet sur le phénotype des cellules. En revanche, une faible teneur en oxygène durant l'expansion semble diminuer le temps de doublement des cellules, favoriser la chondrogénèse et inhiber la différenciation ostéogénique. Enfin, quelles que soient les conditions de culture, la différenciation adipogénique des CSM-GW semble difficile à obtenir

Stem cells are the hopes for cell therapy and tissue engineering. MSCs from fetal tissue (umbilical cord blood and WJ), which are a source of embryonic epiblast grow relatively faster comparing to other adult sources. The culture condition can affect cell behavior. In our study, we explored the effect of oxygen concentration on the expansion, immunophenotyping, and differentiation of these cells. The aim of this work is to identify the optimal method for isolation of MSCs derived from fetal tissue. Given the low rate of success in the isolation of MSCs from cord blood, we headed to WJ-MSCs. We have determined in siu, the specific markers expressed in the WJ and in the perivascular region. Studies on the morphology growth kinetics, and phenotypic expression of surface makers of MSCs isolated from WJ were made over a long period (7 passages) in different culture conditions. We have shown that WJ is composed of an abundant extracellular matrix rich in collagen and glycasominoglycans and have variable phenotype depending from their localization in the jelly. This tissue is able to provide a large amount of MSCs (6.7x105 Cs/cm of cord) that maintain a constant morphology. Finally, regardless of the passage, the oxygen concentration does not effect on the phenotype of the cells. In contrast, a low oxygen concentration during expansion appears to decrease the doubling time of MSCs, promote chondrogenesis and inhibit osteogenic differentiation. Finally, whatever the culture conditions, adipogenic differentiation of WJ-MSC seems difficult to obtain, Les cellules souches suscitent de grands espoirs pour la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire. Les CSM du tissus foetaux (sang placentaire et gelée de Wharton du cordon ombilical), à l'origine d'épiblaste embryonnaire, sont considérées comme plus primitives que les CSM provenant de sources adultes. Les conditions de culture ayant un impact sur le comportement des cellules, dans notre étude, nous avons exploré l'effet de la concentration de l'oxygène sur l'expansion, l'immunophénotypage et la différenciation de ces cellules. L'objectif de ce travail est d'identifier la méthode optimale d'isolation des CSM issues de tissus foetaux. Compte tenu du faible taux de succès dans l'isolement des CSM extraites du sang placentaire, nous nous sommes dirigés vers les CSM-GW. Nous y avons déterminé in situ, les marqueurs spécifiques exprimés dans la gelée de Wharton et à la périphérie. Des études sur la morphologie, la cinétique de croissance, et sur l'expression phénotypique des marqueurs de surface, des CSM-GW, ont été effectuées sur une longue durée (7 passages) à différentes conditions de culture. Nous avons montré que la GW est composée d'une abondante matrice extracellulaire riche en collagènes et glycosaminoglycannes et que les cellules possèdent un phénotype variable selon leur localisation dans la gelée. Ce tissu est capable de fournir une quantité importante de CSM (6,7x105 Cs/cm de cordon) qui gardent une morphologie constante. Enfin, quel que soit le passage, la concentration de l'oxygène ne semble pas avoir d'effet sur le phénotype des cellules. En revanche, une faible teneur en oxygène durant l'expansion semble diminuer le temps de doublement des cellules, favoriser la chondrogénèse et inhiber la différenciation ostéogénique. Enfin, quelles que soient les conditions de culture, la différenciation adipogénique des CSM-GW semble difficile à obtenir

Hematopoietic stem cells Transplantation (HSCT) is a well recognized strategy for treatment of haematological malignancies. However, HSCT complications among which the viral infections a reassociated with high morbidity and mortality. These infections arise in the absence of immune reconstitution. Monitoring of viral reactivations after allogeneic HSCT is necessary, to identify patients at risk of viral infections, but not sufficient, as patients may be abusively treated. In this work we propose to combine viral DNA load assessment with specific immune monitoring to target patients who need to be treated. We report a retrospective study investigating EBV infection and EBV-specific immune recovery using the functional IFN Elispot assay in 40 allogeneic HSCT patients. We initiated a similar study with ADV which is pending. However, although patients are correctly targeted, anti-viral treatment is sometimes not effective. We present a study on the development of a complete clinical grade generation of Human anti-Adenovirus cytotoxic T cells in GMP (Good Manufacturing Practice) conditions, thanks to the system CliniMACS and the Cytokine Capture System, to propose an adoptive immunotherapy to the recipient.We describe afterwards three clinical experiments of treatment of an ADV infection after HSCT.Finally, we present the preliminary results of the anti-ADV and -CMV bi-specific CTL production.; L'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement efficace des Hémopathies malignes. Cependant, les complications des allogreffes parmi lesquelles les infections virales sont associées parfois à une morbidité et une mortalité importantes. Ces infections surviennent en l'absence de reconstitution immunitaire. Un monitoring régulier de la charge virale des principaux agents infectieux impliqués est réalisé mais amène parfois à la mise en oeuvre abusive de traitements anti-viraux qui ne sont pas dénués de toxicité.Dans ce travail, nous proposons d'associer à ce monitoring un suivi régulier de la reconstitution immunitaire spécifique afin de cibler parmi les patients présentant une réactivation ceux qui nécessitent un traitement curatif de ceux qui pourront maîtriser l'infection par leur système immunitaire. Nous illustrons ce propos avec le virus d'Epstein Barr (EBV) et avons en cours une étude sur l'Adénovirus (ADV).Dans certains cas parfaitement ciblés, les traitements anti-viraux s'avèrent inefficaces. C'est pourquoi dans ce travail, nous présentons la mise au point d'une technique de grade clinique de production de lymphocytes T cytotoxiques anti-ADV (CTL anti-ADV) en condition GMP (Good Manufacturing Practice), grâce au système CliniMACS et au Cytokine Capture System de Miltenyi, afin de proposer une immunothérapie adoptive.Nous décrivons par la suite trois expériences cliniques de traitement compassionnel d'une infection ADV post-allogreffe de CSH. Enfin, nous présentons les résultats préliminaires de la production de CTL bispécifique anti-ADV et CMV.

Hematopoietic stem cells Transplantation (HSCT) is a well recognized strategy for treatment of haematological malignancies. However, HSCT complications among which the viral infections a reassociated with high morbidity and mortality. These infections arise in the absence of immune reconstitution. Monitoring of viral reactivations after allogeneic HSCT is necessary, to identify patients at risk of viral infections, but not sufficient, as patients may be abusively treated. In this work we propose to combine viral DNA load assessment with specific immune monitoring to target patients who need to be treated. We report a retrospective study investigating EBV infection and EBV-specific immune recovery using the functional IFN Elispot assay in 40 allogeneic HSCT patients. We initiated a similar study with ADV which is pending. However, although patients are correctly targeted, anti-viral treatment is sometimes not effective. We present a study on the development of a complete clinical grade generation of Human anti-Adenovirus cytotoxic T cells in GMP (Good Manufacturing Practice) conditions, thanks to the system CliniMACS and the Cytokine Capture System, to propose an adoptive immunotherapy to the recipient.We describe afterwards three clinical experiments of treatment of an ADV infection after HSCT.Finally, we present the preliminary results of the anti-ADV and -CMV bi-specific CTL production., L'allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement efficace des Hémopathies malignes. Cependant, les complications des allogreffes parmi lesquelles les infections virales sont associées parfois à une morbidité et une mortalité importantes. Ces infections surviennent en l'absence de reconstitution immunitaire. Un monitoring régulier de la charge virale des principaux agents infectieux impliqués est réalisé mais amène parfois à la mise en oeuvre abusive de traitements anti-viraux qui ne sont pas dénués de toxicité.Dans ce travail, nous proposons d'associer à ce monitoring un suivi régulier de la reconstitution immunitaire spécifique afin de cibler parmi les patients présentant une réactivation ceux qui nécessitent un traitement curatif de ceux qui pourront maîtriser l'infection par leur système immunitaire. Nous illustrons ce propos avec le virus d'Epstein Barr (EBV) et avons en cours une étude sur l'Adénovirus (ADV).Dans certains cas parfaitement ciblés, les traitements anti-viraux s'avèrent inefficaces. C'est pourquoi dans ce travail, nous présentons la mise au point d'une technique de grade clinique de production de lymphocytes T cytotoxiques anti-ADV (CTL anti-ADV) en condition GMP (Good Manufacturing Practice), grâce au système CliniMACS et au Cytokine Capture System de Miltenyi, afin de proposer une immunothérapie adoptive.Nous décrivons par la suite trois expériences cliniques de traitement compassionnel d'une infection ADV post-allogreffe de CSH. Enfin, nous présentons les résultats préliminaires de la production de CTL bispécifique anti-ADV et CMV.

Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a key factor for chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). Mechanical loading has also been shown to be important in MSC differentiation, but mechanisms by which mechanotransduction occurs remain largely elusive. The aim of our work was to define the short-time effect of cyclic tensile strain (CTS, 0.5 Hz or 1 Hz, 5% equibiaxial strain) on the hMSCs. Firstly, we investigated the culture parameters for the isolation of hMSCs and by which the initial expansion was influenced. We chose the opitimal culture conditions for hMSCs. Secondly, we studied the effect of TGF-ß1 on the hMSCs and chondrocytes. We found that Smad3 phosphorylation (Smad3p) was increased after 1 hour by the stimulation of TGF-ß1, but decreased after 3 hours, Smad3p translocation to the nucleus was observed too, and the effect was dose-dependent. At the same time, TGF-ß1 increased the expression of the gene of Sox9. Finally, we studied the effect of CTS on the hMSCs and chondrocytes. Results showed that CTS had the same effect that TGF-ß1 on the Smad3 phosphorylation and the expression of the gene of Sox9: CTS increases the latent TGF-ß1 in the medium, increases the internalisation of the type II TGF-ß receptor and changes the form of hMSCs. Moreover a synergy effect between CTS and TGF-ß1 was observed. We conclude that CTS could stimulate MSC differentiation by the activation of endogenous TGF-ß signaling pathway. It seems that the mechanisms of mechanotransduction are controlled by multiple factors., Le TGF-ß (Transforming growth factor-ß) joue un rôle très important dans la différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMs) en chondrocytes. La contrainte mécanique joue un rôle important aussi dans la différenciation des CSMs, mais, le mécanisme de mécanotransduction reste obscur. Le but de nos travaux a été de définir l'effet; a des temps courts de l'étirement équibiaxial (0,5 Hz ou 1 Hz, 5%) sur les CSMs. Dans un premier temps, nous avons étudié les conditions de culture pour l?isolement et l'expansion des CSMs, et nous avons choisi les conditions de culture optimales pour ces CSMs. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'effet du TGF-ß1 sur les CSMs et les chondrocytes. Nous avons trouvé que la phosphorylation de Smad3 est augmentée après 1 heure de stimulation avec du TGF-ß1, mais diminuée après 3 heures: Au même temps, Smad3p s'est translocalisée dans le noyau. C?est un effet dépendant de la concentration. L'expression du gène de Sox9 est augmentée également après stimulation avec du TGF-ß1. Dans un troisième temps, nous avons étudié l'effet de la contrainte d'étirement sur les CSMs et les chondrocytes. Nous avons trouvé que la contrainte d'étirement avait le même effet que le TGF-ß1 sur la phosphorylation de Smad3 et l'expression du gène de Sox9. En plus, avec l'étirement, le TGF-ß1 latent est activé, le RII est internalisé et les CSMs sont plus allongées. De plus, il y avait un effet synergique entre l'étirement et le TGF-ß1. En conclusion, la contrainte d'étirement active la différenciation des CSMs par l'activation de la voie du TGF-ß. Il semble que le mécanisme de mécanotransduction est contrôlé par plusieurs facteurs.

Transforming growth factor-ß (TGF-ß) is a key factor for chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells (hMSCs). Mechanical loading has also been shown to be important in MSC differentiation, but mechanisms by which mechanotransduction occurs remain largely elusive. The aim of our work was to define the short-time effect of cyclic tensile strain (CTS, 0.5 Hz or 1 Hz, 5% equibiaxial strain) on the hMSCs. Firstly, we investigated the culture parameters for the isolation of hMSCs and by which the initial expansion was influenced. We chose the opitimal culture conditions for hMSCs. Secondly, we studied the effect of TGF-ß1 on the hMSCs and chondrocytes. We found that Smad3 phosphorylation (Smad3p) was increased after 1 hour by the stimulation of TGF-ß1, but decreased after 3 hours, Smad3p translocation to the nucleus was observed too, and the effect was dose-dependent. At the same time, TGF-ß1 increased the expression of the gene of Sox9. Finally, we studied the effect of CTS on the hMSCs and chondrocytes. Results showed that CTS had the same effect that TGF-ß1 on the Smad3 phosphorylation and the expression of the gene of Sox9: CTS increases the latent TGF-ß1 in the medium, increases the internalisation of the type II TGF-ß receptor and changes the form of hMSCs. Moreover a synergy effect between CTS and TGF-ß1 was observed. We conclude that CTS could stimulate MSC differentiation by the activation of endogenous TGF-ß signaling pathway. It seems that the mechanisms of mechanotransduction are controlled by multiple factors.; Le TGF-ß (Transforming growth factor-ß) joue un rôle très important dans la différenciation des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMs) en chondrocytes. La contrainte mécanique joue un rôle important aussi dans la différenciation des CSMs, mais, le mécanisme de mécanotransduction reste obscur. Le but de nos travaux a été de définir l'effet; a des temps courts de l'étirement équibiaxial (0,5 Hz ou 1 Hz, 5%) sur les CSMs. Dans un premier temps, nous avons étudié les conditions de culture pour l?isolement et l'expansion des CSMs, et nous avons choisi les conditions de culture optimales pour ces CSMs. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'effet du TGF-ß1 sur les CSMs et les chondrocytes. Nous avons trouvé que la phosphorylation de Smad3 est augmentée après 1 heure de stimulation avec du TGF-ß1, mais diminuée après 3 heures: Au même temps, Smad3p s'est translocalisée dans le noyau. C?est un effet dépendant de la concentration. L'expression du gène de Sox9 est augmentée également après stimulation avec du TGF-ß1. Dans un troisième temps, nous avons étudié l'effet de la contrainte d'étirement sur les CSMs et les chondrocytes. Nous avons trouvé que la contrainte d'étirement avait le même effet que le TGF-ß1 sur la phosphorylation de Smad3 et l'expression du gène de Sox9. En plus, avec l'étirement, le TGF-ß1 latent est activé, le RII est internalisé et les CSMs sont plus allongées. De plus, il y avait un effet synergique entre l'étirement et le TGF-ß1. En conclusion, la contrainte d'étirement active la différenciation des CSMs par l'activation de la voie du TGF-ß. Il semble que le mécanisme de mécanotransduction est contrôlé par plusieurs facteurs.