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Our genome, which may be considered as the program of each cell and organism, is constantly threatened by multiple endogenous and exogenous agents that damage the DNA biomolecule. These lesions, that show a wide array of structures, are particularly involved in cell aging, carcinogenesis and cell death. To thwart these negative effects, organisms have developed various DNA repair pathways that take in charge the alterations in a specific manner. Among them, the base excision repair (BER) removes every day dozens of thousands of damages, including alkylated, oxidized or deaminated bases, abasic sites or single strand breaks. In this study, we present the development of a new biosensor for the detection of BER enzymatic activities. The tool is characterized by a set of (pro)fluorescent hairpin-shaped DNA probes, immobilized on paramagnetic beads. Each probe is modified by the selective insertion of a lesion, substrate for the targeted repair enzyme (DNA glycosylase, AP-endonuclease). The excision/incision activity of the lesion leads to the cleavage of the probe together with the dehybridization of the structure. The analysis and quantification of the repair process is carried out by direct fluorescence measurements from the supernatant, or by analysis of the functionalized beads by flow cytometry. This device allows the multiplexed enzymatic activities detection of purified proteins or within nuclear extracts. Applications to the screening of DNA repair inhibitors have been successfully initiated. Finally, the adaptation of these in vitro tests to in cellulo detection of DNA repair activities was investigated in preliminary studies.; Notre génome, véritable mode d'emploi de chaque cellule et organisme, est constamment menacé par de multiples agents endogènes ou exogènes qui endommagent la biomolécule d'ADN. Ces lésions résultantes, de nature diverse, sont notamment impliquées dans les processus de vieillissement cellulaire, de cancérogénèse et de mort cellulaire. Afin de contrer ces effets néfastes, les organismes ont développé différents systèmes de réparation de l'ADN capables de prendre en charge spécifiquement chaque type de dommages. Parmi ces voies métaboliques, la réparation par excision de base (BER) répare chaque jour des dizaines de milliers de dommages, incluant les bases alkylées, oxydées ou désaminées, les sites abasiques ou encore certaines cassures de brin. Dans le présent travail, nous exposons la mise au point d'un nouveau biocapteur pour la détection des activités enzymatiques du BER. L'outil se caractérise par un set de sondes nucléiques autocomplémentaires, fluorescentes ou pro-fluorescentes, immobilisées sur microbilles paramagnétiques. Chaque sonde est modifiée par l'introduction sélective d'une lésion, substrat d'une activité enzymatique ciblée (ADN N-glycosylase, AP-endonucléase). L'activité d'excision/incision de la lésion, conduit à la coupure de la sonde et à la déshybridation de la structure. L'analyse et la quantification du clivage spécifique est réalisée en fluorescence, soit à partir du surnageant par spectrofluorimétrie, soit des billes par cytométrie en flux. Ce dispositif permet la détection multiplexée des activités enzymatiques de protéines purifiées ou au sein d'extraits nucléaires. Egalement, des applications dans le criblage d'inhibiteurs de la réparation de l'ADN sont envisageables dans le cadre de recherches pré-cliniques. L'adaptation de ces tests in vitro à la détection de la réparation de l'ADN in cellulo a fait l'objet de développements préliminaires.

DNA is a molecule, which integrity is crucial for correct functioning of all the living organisms. However, it is regularly submitted to different stresses coming from endogenous or exogenous sources, which are able to generate various damages in its structure. Each damage may be recognized by multiple proteins, among which one can find repair proteins, inhibitors of DNA repair, transcription factors or proteins of chromatin remodelling. All these proteins constitute the interactome of a given DNA lesion.Cyclonucleosides are complex damages of DNA, which imply the base and the sugar residue at the same time, since an additional covalent bond is generated between these two. The consequence of the presence of this bond is the deformation of the double helix. For this reason, cyclonucleosides are not recognized by the base excision repair system, as the majority of the oxidative lesions are, but rather by the nucleotide excision repair system, which takes in charge bulky lesions.The objective of this thesis is to study the interactome of the cyclonucleosides, by using different biological models: eucaryotes, bacteries and archaea. By using the technique that enables trapping of proteins on the probes holding these lesions, we realised a screening of interactions between cyclonucleosides and proteins issued from the HeLa extracts. We identified the negative influence of cyclonucleosides on the recognition of its target sequence by the transcription factor DREF, as well as on the PARP1 interactions with DNA. These results were then confirmed by complementary techniques.We have also analysed the interactions between the bacterial glycosylase Fpg and cyclonucleosides: this enzyme possesses an affinity for these lesions, without however exerting an excision activity. This affinity is lower than the Fpg affinity for abasic sites, but it is higher than its affinity for non-damaged DNA. The role that could play cyclonucleosides in DNA is discussed following these results.Finally, a radioresistant archaea Thermococcus gammatolerans was studied. First, the formation of simple and complex oxidative lesions at the high radiation doses (2500 and 5000 Gy) was evaluated. 8-oxo-deoxyguanosine, which is an example of simple oxidative lesions, is formed in great quantity at high irradiation dose, and is rapidly repaired once the cells are put in their optimal culture conditions. As for cyclonucleosides, they are not detected even at very high doses of radiation, which raises questions concerning the formation of these damages. Next, two new glycosylases isolated from Thermococcus gammatolerans were studied: their mechanism of action, as well as their specificity against the substrates, were elucidated.The work accomplished during this thesis contributed to the better understanding of the interactions between cyclonucleosides and the proteins that interact with them. Also, the development of the protein trapping techniques on the damaged probes, which constituted an important part of this work, can be applied to study the interactome of other complex DNA lesions.; L’ADN est une molécule dont l’intégrité est cruciale pour le bon fonctionnement de tous les organismes vivants. Cependant, il est régulièrement soumis à différents stress provenant de sources endogènes ou exogènes, et qui sont capables de générer dans sa structure des dommages de nature variée. Chaque dommage peut être reconnu par une panoplie de protéines, parmi lesquelles nous pouvons retrouver les protéines de réparation, les inhibiteurs de réparation, les facteurs de transcriptions ou encore les protéines de remodelage chromatinien. Ces protéines constituent l’interactome d’une lésion donnée.Les cyclonucléosides sont des dommages complexes de l’ADN qui ont pour particularité d’impliquer à la fois la base et le résidu de sucre, entre lesquels une liaison covalente supplémentaire est créée. La présence de cette liaison a pour conséquence de déformer la double hélice de l’ADN. Ainsi, ces lésions ne sont pas prises en charge par le système de réparation par excision de bases, comme la plupart des dommages d’oxydation, mais elles seraient plutôt reconnues par le système de réparation par excision de nucléotides, ce dernier prenant en charge les lésions volumineuses.L’objectif de cette thèse est d’étudier l’interactome des cyclonucléosides en utilisant différents modèles biologiques : eucaryotes, bactéries ou archées. En utilisant une technique de piégeage de protéines sur des sondes comportant ces lésions, nous avons effectué un screening des interactions entre les cyclonucléosides et des protéines issues d’extraits protéiques HeLa. Nous avons ainsi identifié l’influence négative des cyclonucléosides sur la reconnaissance de sa séquence cible par un facteur de transcription DREF, ainsi que sur les interactions de PARP1 avec l’ADN. Ces résultats ont été confirmés par l’usage des techniques complémentaires.Nous avons également analysé les interactions entre la glycosylase bactérienne Fpg et les cyclonucléosides : cette enzyme possède une affinité pour ces lésions, sans pourtant exercer d’activité d’excision. Cette affinité est inférieure à l’affinité de la Fpg pour les sites abasiques mais reste supérieure à son affinité pour l’ADN non-endommagé. Le rôle que pourraient jouer les cyclonucléosides dans l’ADN est alors discuté suite aux résultats obtenus.Enfin, une archée radiorésistante Thermococcus gammatolerans a été étudiée. Dans un premier temps, la formation des lésions d’oxydation simples et complexes à forte dose d’irradiation (2500 et 5000 Gy) a été évaluée. La 8-oxo-désoxyguanosine, exemple des lésions simples d’oxydation, est formée en grande quantité suite à une forte dose d’irradiation, et rapidement réparée dans les cellules remises dans des conditions optimales de culture. Les cyclonucléosides, quant à eux, ne sont pas détectés même à de très fortes doses d’irradiation, ce qui soulève des questions sur la formation de ces dommages. Ensuite, deux nouvelles glycosylases isolées de Thermococcus gammatolerans ont été étudiées : leur mécanisme d’action ainsi que leur spécificité vis-à-vis des substrats ont été élucidés.Les travaux effectués au cours de cette thèse ont contribué à la meilleure compréhension des interactions entre les cyclonucléosides et les protéines interagissant avec eux. Le développement des techniques de piégeage des protéines sur les sondes lésées, qui a constitué une partie importante des travaux, pourra également servir à étudier l’interactome d’autres lésions complexes de l’ADN.