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Acoustic signals are encoded into electrical nerve impulses at the ribbon synapses of the cochlear inner hair cells (IHC). Exocytosis of the synaptic glutamatergic vesicles at these ribbon synapses is triggered by the activation of the voltage-dependent calcium channels CaV1.3 and required a specific calcium sensor: otoferlin. In the first part of my thesis, we studied the role of clarin-2, a newly identified tetraspan protein paralog of clarin-1, in these synapses. We know from previous studies that clarin-1, by forming a complex associating CaV1.3 channels, harmonin-b and actin-F, is essential for a compact spatial organization of the Ca1.3 channels at the active zone of the IHC ribbons. We show that clarin-2 is essential for a normal voltage-dependent activation of the IHC calcium channels and is likely part of the clarin-1 complex at the ribbon synapses. In the second part of my thesis, we studied the role of SNAP-25, a protein of the SNARE complex implicated in the docking, priming and fusion of the synaptic vesicles at neuronal central synapses but whose implication at the ribbon hair cell synapses remain still under debate. We show that mutant mice specifically deleted for SNAP-25 in hair cells are profoundly deaf and have a severe vestibular deficit. Electrophysiological patch-clamp recordings in IHCs and utricular hair cells indicated a severe defect in fast exocytosis. This synaptic functional defect was associated with a progressive degeneration of the ribbon synapses and the hair cells themselves, suggesting that SNAP-25 is also essential for the release of important neurotrophic factors. In the third part of my thesis, we investigated the functional changes of the aging ribbon synapses in C57BL/6J mice. We found that the aging synaptic IHC ribbons, while progressively degenerating, become larger with enlarged Ca2+ microdomains to produce a more sustained exocytosis of synaptic vesicles. The expression and the voltage dependence of the fast BK channels, essential for fast IHC repolarization, were also severely affected with aging. All these results suggested that the IHC ribbon synapses become potentiated with aging, a process that may partly explain the paradoxical hyperacusis phenomenon in presbyacusis., Les signaux acoustiques sont encodés en impulsions électriques nerveuses au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée. L'exocytose des vésicules synaptiques glutamatergiques des CCIs est déclenchée par l'activation des canaux calciques voltage-dépendent CaV1.3 et requiert un senseur calcique particulier : l'otoferline. Ces canaux calciques CaV1.3 s’organisent de façon spatialement resserrée autour des rubans synaptiques en formant un complexe avec l’harmonine et la clarin-1 associées à l’actine-F. Dans la première partie de notre étude, nous avons étudié le rôle possible du nouvellement identifié paralogue de la clarine-1, la clarine-2, dans les synapses à ruban des CCI. Nous démontrons que la clarine-2 est impliquée dans la régulation du potentiel d'activation des canaux calciques des CCIs et en conséquence de l’exocytose synaptique. Dans une deuxième partie de notre travail nous avons étudié le rôle de la SNAP-25 dans l’exocytose des CCI. La SNAP-25 est une protéine essentielle du complexe SNARE qui permet l'amarrage des vésicules synaptiques à la membrane et leur fusion dans les synapses neuronales centrales mais dont le rôle au niveau des CCI est encore largement débattu. En utilisant des souris dont la SNAP-25 est sélectivement supprimée dans les cellules ciliées, nous montrons que la SNAP-25 est essentielle à la fonction auditive et vestibulaire, du fait d’une perte de l’exocytose rapide des cellules ciliées, suivi par une dégénérescence progressive des synapses et des cellules ciliées elles-mêmes. Dans une troisième partie, nous avons étudié la dégénérescence des synapses à ruban des CCI au cours du vieillissement. Nous observons chez les souris C57BL/6J âgées que les synapses à rubans des CCIs restantes, qui n’ont pas encore dégénérées, présentent des rubans agrandis, une augmentation des microdomaines calciques autour des rubans et une plus grande capacité à soutenir l’exocytose suggérant une potentialisation de ces synapses. Cette potentialisation des synapses à ruban âgées pourrait en partie expliquer l’hyperacousie paradoxalement observée dans la presbyacousie.

Cochlear inner hair cells (IHCs) encode acoustic signals into nerve impulses at their ribbon synapses formed with the auditory afferent fibers. The exocytosis of glutamatergic vesicles is triggered by voltage activation of Cav1.3 channels and requires otoferlin, the putative intracellular Ca2+ sensor. The precise molecular mechanisms of exocytosis still remain elusive, notably the mechanisms allowing the temporal precision, the high rates of vesicular fusion (high frequency phase-locking with sound) and the indefatigability of the process. We show here that exocytosis in auditory and vestibular hair cells relies on a specific tight spatial organization of Cav1.3 channels at the active zones. Auditory IHCs use different Cav1.3isoforms, notably short C-terminal isoforms (Cav1.343S et Cav1.342A). These short Cav1.3isoforms essentially trigger the RRP exocytosis (Readily Releasable Pool of vesicles) and are at the origin of its fast adaptation. This fast exocytotic adaptation is based both on an intracellularCa2+ dependant inactivation of the Ca2+ current and on its extracellular block by exocytosed protons. Long Cav1.3 isoforms (Cav1.342L et Cav1.3∆44) regulate the vesicular recruitment at the active zones. Furthermore, our results show that a synaptic actin cytoskeleton is essential for the tight spatial organization of the Cav1.3 channels at the ribbons. Clarin 1 (Usher IIIA protein),through its interactions with the F-actin network, harmonin (PDZ protein, Usher IC) and the Ca2+channel β2 subunit, is required to maintain the tight organization of Cav1.3 channels at the ribbon synapses., Les cellules ciliées internes (CCIs) de la cochlée encodent les signaux acoustiques en impulsions électriques au niveau des synapses à ruban formées avec les fibres afférentes du nerf auditif. L'exocytose des vésicules glutamatergiques par les CCIs est déclenchée par l'activation des canaux calciques Cav1.3 et par l'otoferline, le senseur calcique intracellulaire présumé. Les mécanismes moléculaires précis régulant cette exocytose restent encore mal compris, notamment ceux à l’origine de sa précision temporelle, sa vitesse élevée en phase avec le signal acoustique("phase-locking" jusqu'à 1-2 kHz) et son infatigabilité. Nous montrons que la spécificité des synapses à ruban auditive et vestibulaire passe par une organisation spatiale spécifique des canaux Cav1.3 dans les zones actives. Les CCIs utilisent différentes isoformes de canaux Cav1.3, notamment des isoformes courtes tronquées dans leur partie C-terminale. Ces isoformes courtes (Cav1.343S et Cav1.342A) sont essentiellement impliquées dans le déclenchement et dans l'adaptation rapide de l'exocytose. Cette adaptation se réalise au niveau des canaux Cav1.3 à la fois en intracellulaire par le Ca2+ et en extracellulaire parles protons secrétés lors de l'exocytose. Les isoformes longues (Cav1.342L et Cav1.3∆44),positionnées en périphérie du ruban, réguleraient le recrutement vésiculaire. Par ailleurs, nous montrons que l'organisation spatiale des canaux Cav1.3 est dépendante d'un cytosquelette d'actine-F au ruban synaptique. La clarine 1 (protéine Usher IIIA) interagirait avec l'actine-F, l'harmonine (protéine PDZ, Usher IC) et la sous-unité β2 des canaux calciques pour organiser les canaux Cav1.3 dans les zones actives.

The dynamical behaviour of a hair bundle – the mechanosensitive organelle of the hair cells found in the inner ear – is rich. A hair bundle can oscillate spontaneously, “twitch” or simply relax in response to a force step.Using iontophoresis to affect the Ca2+ concentration near a hair bundle from the bullfrog’s sacculus and displacement-clamp measurements of the bundle’s force-displacement relations, we were able to reconcile these contrasting manifestations of active hair-bundle motility. We used Ca2+ and offsets of the bundle’s mean position to control the fraction of open transduction channels at steady state and thus the bundle’s operating point. In the case of non oscillatory hair bundles, we found that the polarity and kinetics of active hair-bundle movement evoked by a step stimulus depended on the bundle’s operating point in the nonlinear force- displacement relation. When the force-displacement relation displayed a region of negative stiffness, spontaneous hair-bundle oscillations arose when the hair bundle was required to operate within this unstable region.Only two ingredients are necessary to account for the various incarnations of active hair-bundle motility: non-linear gating compliance of the transduction apparatus and the Ca2+-regulated activity of the myosin-based adaptation motor. Numerical simulations successfully reproduced a wide range of observations from different experimental situations and animal species, thereby suggesting that only one force-generating mechanism is needed to describe the seemingly opposite movements that the hair-bundle can produce.; Le comportement dynamique d’une touffe ciliaire (l’organelle mécano-sensible des cellules ciliées de l’oreille interne) est très varié. Une touffe ciliaire peut osciller spontanément, avoir une réponse de type « excitable » ou simplement relaxer en réponse à un échelon de force.En utilisant la iontophorèse pour modifier la concentration en calcium à proximité d’une touffe ciliaire du saccule de la grenouille taureau, et en mesurant les relations force/déplacements de cette organelle, nous sommes parvenus à réconcilier ces manifestations contrastées de sa motilité active. Nous utilisons le calcium et/ou des biais statiques appliqués à la position de la touffe ciliaire pour contrôler la probabilité d’ouverture au repos et par là, son point de fonctionnement. Dans le cas de touffes ciliaires non oscillantes, nous montrons que la polarité et la cinétique des mouvements ciliaires actifs observés en réponse à un échelon de stimulation dépendent du point de fonctionnement de la cellule. Lorsque la relation force/déplacement de la touffe ciliaire possède une région de raideur négative, des oscillations spontanées peuvent être déclenchées lorsque le point de fonctionnement est placé au sein de cette région instable.Seuls deux ingrédients sont nécessaires pour interpréter ces manifestations de la motilité ciliaire active : l’existence d’une relation force/déplacement non linéaire conséquence de l’activation mécanique directe des canaux de transduction, et l’activité du moteur d’adaptation, fondé sur les myosines et dépendant du calcium. Des simulations numériques reproduisent avec succès un grand nombre d’observations expérimentales, dans des conditions différentes et sur des animaux variés, suggérant qu’un seul mécanisme actif est nécessaire pour décrire toute la gamme des mouvements actifs observés sur les touffes ciliaires des cellules ciliées.

The dynamical behaviour of a hair bundle – the mechanosensitive organelle of the hair cells found in the inner ear – is rich. A hair bundle can oscillate spontaneously, “twitch” or simply relax in response to a force step.Using iontophoresis to affect the Ca2+ concentration near a hair bundle from the bullfrog’s sacculus and displacement-clamp measurements of the bundle’s force-displacement relations, we were able to reconcile these contrasting manifestations of active hair-bundle motility. We used Ca2+ and offsets of the bundle’s mean position to control the fraction of open transduction channels at steady state and thus the bundle’s operating point. In the case of non oscillatory hair bundles, we found that the polarity and kinetics of active hair-bundle movement evoked by a step stimulus depended on the bundle’s operating point in the nonlinear force- displacement relation. When the force-displacement relation displayed a region of negative stiffness, spontaneous hair-bundle oscillations arose when the hair bundle was required to operate within this unstable region.Only two ingredients are necessary to account for the various incarnations of active hair-bundle motility: non-linear gating compliance of the transduction apparatus and the Ca2+-regulated activity of the myosin-based adaptation motor. Numerical simulations successfully reproduced a wide range of observations from different experimental situations and animal species, thereby suggesting that only one force-generating mechanism is needed to describe the seemingly opposite movements that the hair-bundle can produce.; Le comportement dynamique d’une touffe ciliaire (l’organelle mécano-sensible des cellules ciliées de l’oreille interne) est très varié. Une touffe ciliaire peut osciller spontanément, avoir une réponse de type « excitable » ou simplement relaxer en réponse à un échelon de force.En utilisant la iontophorèse pour modifier la concentration en calcium à proximité d’une touffe ciliaire du saccule de la grenouille taureau, et en mesurant les relations force/déplacements de cette organelle, nous sommes parvenus à réconcilier ces manifestations contrastées de sa motilité active. Nous utilisons le calcium et/ou des biais statiques appliqués à la position de la touffe ciliaire pour contrôler la probabilité d’ouverture au repos et par là, son point de fonctionnement. Dans le cas de touffes ciliaires non oscillantes, nous montrons que la polarité et la cinétique des mouvements ciliaires actifs observés en réponse à un échelon de stimulation dépendent du point de fonctionnement de la cellule. Lorsque la relation force/déplacement de la touffe ciliaire possède une région de raideur négative, des oscillations spontanées peuvent être déclenchées lorsque le point de fonctionnement est placé au sein de cette région instable.Seuls deux ingrédients sont nécessaires pour interpréter ces manifestations de la motilité ciliaire active : l’existence d’une relation force/déplacement non linéaire conséquence de l’activation mécanique directe des canaux de transduction, et l’activité du moteur d’adaptation, fondé sur les myosines et dépendant du calcium. Des simulations numériques reproduisent avec succès un grand nombre d’observations expérimentales, dans des conditions différentes et sur des animaux variés, suggérant qu’un seul mécanisme actif est nécessaire pour décrire toute la gamme des mouvements actifs observés sur les touffes ciliaires des cellules ciliées.