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Complete and accurate DNA replication is crucial to transfer correct genetic information to the daughter cells. Various obstacles can interfere with the progression of the replication machinery, threatening genome integrity. Specialized error-prone translesion DNA polymerases (TLS polymerases) assist the replicative polymerases to replicate across DNA lesions. During my PhD I characterized the contribution of TLS pol eta (polη), best known for its role in preventing UV-induced mutagenesis, during unperturbed replication. Polη was shown to promote the stability of the common fragile sites and associates with the replisome in unchallenged S phase. However, the kind of replication barriers requiring pol eta and the consequences of its absence on the replication of these regions were unclear. My results show that polη is recruited at a subset of replication forks all along the S phase and that polη defect modifies the replication timing of genomic regions enriched in large transcribed genes, where transcription-replication conflicts (TRCs) are more likely to occur. Overall, I show that polη recruitment at the replication fork is transcription-dependent, and that pol eta plays a role in the coping with TRCs. Altogether, these results highlight a new role for an error-prone DNA polymerase in protecting the genome stability., La réplication complète et fidèle de l’ADN est cruciale pour transmettre l’information génétique de manière correcte aux cellules filles. Divers obstacles peuvent interférer avec la progression de la machinerie de réplication, et donc menacer l’intégrité du génome. Des ADN polymérases spécialisées, dites translésionnelles (polymérases TLS), assistent les ADN polymérases réplicatives pour la poursuite de la réplication malgré ces lésions. Elles peuvent répliquer de manière fidèle ou non ces entraves, mais sont mutagènes sur des séquences d’ADN non-endommagées. Au cours de ma thèse, j’ai pu caractériser davantage la contribution de l’ADN polymérase TLS eta (polη) au cours de la réplication non-perturbée. Cette polymérase permet principalement de prévenir la mutagénèse induite par les UV. Mais il a également été montré qu’elle promeut la stabilité des sites fragiles communs, et est associée au réplisome durant la phase S non-perturbée. Cependant, la nature des obstacles nécessitant polη et les conséquences de son absence pour la réplication de ces régions restaient à déterminer. Mes résultats montrent que polη est recrutée au niveau d’une fraction des fourches de réplication tout au long de la phase S et que l’absence de pol eta conduit à une modification du timing de réplication de régions génomiques riches en grands gènes transcrits, où les conflits entre réplication et transcription sont potentiellement plus fréquents. Plus généralement, je montre que le recrutement de pol eta à la fourche de réplication dépend de la transcription et qu’elle joue un rôle dans la prise en charge des conflits entre réplication et transcription. Ces résultats mettent en évidence un nouveau rôle de protection de la stabilité du génome pour cette ADN polymérase mutagène.

In all forms of life, DNA polymerases play a central role in genome replication, maintenance and repair. They are also valuable tools needed for many applications in molecular biology. All DNA polymerases were classified into seven distinct families based on their sequence homology: PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY and reverse transcriptases. The DNA polymerase family D, called PolD and whose structure has recently been resolved, remains the least well characterized. It has been discovered in thermophilic Archaea, and has interesting biochemical properties, exploitable by PCR (Polymerase Chain Reaction). It is an heterodimeric protein composed of a DP1 subunit responsible for the exonuclease activity, and a DP2 subunit responsible for the polymerization activity. The structures of DP1 and DP2 reveal that PolD is an atypical DNA polymerase. Indeed, the structure of the polymerase and exonuclease active sites differs from that of the other DNA polymerases characterized to date. PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) is a key player in the replication fork that dramatically improves the processivity of PolD both in vivo and in vitro. In this work, I was able to study the PolD and the PCNA of the Archaea Pyrococcus abyssi from several angles. At first, I worked on the PCNA alone to determine its structure by crystallography. Shortly after, I expressed and purified different PolD constructs in order to study the two proteins as part of their complexation using the bio-layer interferometry method. Crossing the data obtained allowed me to map their interactions and to propose a model of the ternary complex they form with DNA., Dans toutes les formes de la vie, les ADN polymérases jouent un rôle central dans la réplication du génome, sa maintenance et sa réparation. Ce sont également des outils précieux nécessaires à de nombreuses applications en biologie moléculaire. Toutes les ADN polymérases ont été classées en sept familles distinctes en se basant sur leur homologie de séquence : PolA, PolB, PolC, PolD, PolX, PolY et les reverse transcriptases. L’ADN polymérase de la famille D, appelée PolD et dont la structure a récemment été résolue, demeure la moins bien caractérisée. Elle a été découverte chez des Archées thermophiles, et présente des propriétés biochimiques intéressantes, exploitables en PCR (réaction de polymérisation en chaîne). C’est une protéine hétérodimérique composée d’une sous-unité DP1 responsable de l’activité de relecture exonucléase, et d’une sous-unité DP2 responsable de l’activité de polymérisation. Les structures de DP1 et DP2 révèlent que la PolD est une ADN polymérase atypique. En effet, la structure des sites actifs polymérase et exonucléase diffère de celle des autre ADN polymérases caractérisées à ce jour. Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) est un acteur clé de la fourche de réplication qui améliore considérablement la processivité de la PolD à la fois in vivo et in vitro. Au cours de mes travaux, j’ai pu étudier la PolD et le PCNA de l’Archée Pyrococcus abyssi sous plusieurs angles. Dans un premier temps, j’ai travaillé sur le PCNA seul pour déterminer sa structure par cristallographie. Peu après, j’ai exprimé et purifié différentes constructions de la PolD afin d’étudier les deux protéines dans le cadre de leur complexation en utilisant la méthode d’interférométrie à bio-couches. Le croisement des données obtenues m’a permis d’établir une cartographie de leurs interactions et de proposer un modèle du complexe ternaire qu’elles forment avec l’ADN.

AAA+ ATPases are involved in numerous molecular complexes. These proteins form homomeric or heteromeric hexamers and constitute molecular motors. During my Ph. D., I focused my work on two macromolecular complexes composed of AAA+ ATPases: the 26S proteasome regulatory particle and the Mcm2-7 helicase of the replisome. These complexes are implicated in the development of cancers and constitute interesting therapeutic targets. The 26S proteasome is the main machinery responsible for the regulated degradation of poly-ubiquitinated proteins and the helicase Mcm2-7 is responsible for the unwinding of the DNA during replication. These two complexes are composed of a heterohexameric ring of six AAA+ ATPases called Rpt1 to 6 for the 26S proteasome regulatory particle and Mcm2 to 7 for the replisome. I have studied the role of Hsm3/S5b in the assembly mechanism of the proteasome and the specific role of the subunit Mcm2 in the intergenerational transfer of the epigenetic information. X-ray structures of the complexes Hsm3-Rpt1 and S5b-Rpt1 allowed us to elucidate the dual functions of the assembly chaperone Hsm3/S5b which mediates the assembly of the subcomplex Rpt1-Rpt2-Rpn1 during the assembly of the regulatory particle. In addition, hsm3/S5b inhibits the association of a premature regulatory particle onto the core particle and protects the HbYX motif of Rpt1. Other AAA+ ATPases, like the replisome subunits, possess additional domains which confer specific roles. I also studied the interaction between the N-terminal domain of Mcm2 and the tetrameric form of histones H3-H4 by several methods like X-ray crystallography, NMR and SEC-MALS. I propose a model of the intergenerational transfer of histones H3-H4 in which Mcm2 plays a crucial role of molecular histones chaperone directly integrated in the replication machinery., Les protéines de la famille des AAA+ ATPases sont présentes dans de nombreux complexes moléculaires. Ces protéines sont capables de s’assembler en anneaux héxamériques (homomères ou hétéromères) pour former des moteurs moléculaires. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à deux complexes macromoléculaires à AAA+ ATPases présentant un grand intérêt thérapeutique contre différents cancers : la particule régulatrice du protéasome 26S et l’hélicase du réplisome, Mcm2-7. Le protéasome 26S est la principale machinerie moléculaire impliquée dans la dégradation régulée des protéines poly-ubiquitinées tandis que l’hélicase mcm 2-7 est responsable du désappariement des brins de l’ADN chromosomique lors de la réplication de l’ADN. Ces deux complexes comprennent un anneau hétérohéxamérique de sous-unités AAA+ ATPases appelé Rpt1 à Rpt6 dans le cas du protéasome 26S et Mcm2 à Mcm7 dans le cas de l’hélicase mcm2-7. J’ai focalisé mes travaux sur l’étude du rôle du chaperon Hsm3/S5b dans l’assemblage du protéasome 26S d’une part, et le rôle spécifique de la sous-unité Mcm2 dans le transfert intergénérationnel des histones d’autre part. Le chaperon Hsm3/S5b se lie avec la sous-unité Rpt1. L’étude des complexes de levure Hsm3-Rpt1 et humain S5b-Rpt1 par cristallographie aux rayons X m’a permis de proposer que le chaperon d’Hsm3/S5b pourrait jouer un rôle de médiateur entre les sous-unités Rpt1, Rpt2 et Rpn1 lors de l’assemblage de la particule régulatrice. De plus, ce chaperon pourrait jouer également un rôle d’inhibiteur pour l’assemblage entre la particule régulatrice 19S et la particule cœur 20S du protéasome 26S. Certaines sous-unités AAA+ ATPase, telles que celles du réplisome, possèdent des domaines additionnels, leur conférant un rôle secondaire spécifique et indépendant de leur rôle principal de moteur moléculaire. C’est le cas de Mcm2, qui lie les histones H3-H4 par son domaine N-terminal. J’ai mis en évidence et caractériser cette interaction par différentes techniques biophysiques, en particulier la cristallographie aux rayons X, la RMN et le SEC-MALS. Ces résultats m’ont permis de proposer un modèle pour le transfert intergénérationnel des histones dans lequel Mcm2 joue un rôle crucial de chaperon moléculaire des histones directement intégré dans la machinerie de réplication.