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A main requirement of the cell cycle is a tight coordination between the completion of the replication process and entry into mitosis in order to maintain genetic integrity and the identity and survival of cell progeny. All somatic cells reproducibly execute an intermediate G2 phase of constant duration during successive cell divisions in a given cell type. However the molecular mechanisms controlling precisely its duration during unperturbed cell cycle remains poorly characterized. In this context, the main objective of my PhD project was to decipher signaling pathways controlling entry into mitosis during normal cell cycles as well as their spatiotemporal regulation. CyclinB1-Cdk1, the universal master mitotic driver, is under the control of direct inhibitors (Wee1 and Myt1) and activators (Cdc25A, B and C). Previously, it was determined that CyclinB1-Cdk1 is suddenly activated in very late G2 phase, suggesting that a rapid modification in the equilibrium between its opposite regulators is reproducibly taking place in late G2 by poorly elucidated mechanisms. During my PhD, I investigated the potential role of Polo-like kinase 1 (Plk1) in the initial activation of CyclinB1-Cdk1. Even though its roles during mitosis are well characterized, its contribution for the regulation of entry into mitosis remains controversial. At the molecular level, Plk1 was shown to phosphorylate at least in vitro, several regulators of CyclinB1-Cdk1 including Cdc25B&C, and Wee1 and Myt1. However, it remains largely unknown if these phosphorylation events are taking place in vivo and whether they significantly contribute to the activation process of CyclinB1-Cdk1 leading to mitotic entry.; L'exigence principale du cycle cellulaire est une coordination étroite entre l'achèvement du processus de réplication et l'entrée des cellules en mitose, afin de maintenir l'intégrité génétique, l'identité et à la survie cellulaire. Toutes les cellules somatiques exécutent de manière reproductible une phase G2 intermédiaire, d'une durée constante pendant les divisions cellulaires successives au sein d'un type cellulaire donné. Cependant, les mécanismes moléculaires qui contrôlent précisément sa durée au cours d'un cycle cellulaire non perturbé, restent mal caractérisés. La kinase Cycline B1-Cdk1, facteur universel permettant l'entrée en mitose, est sous le contrôle, chez les mammifères, d'un ensemble de régulateurs directs, les kinases inhibitrices Wee1 et Myt1 et les phosphatases activatrices Cdc25A, B et C. Son activation soudaine, en fin de phase G2, révèle qu'une modification rapide de l'équilibre entre ses régulateurs opposés prend place par des mécanismes moléculaires qui restent à élucider. Dans ce cadre, j'ai étudié le rôle potentiel de la kinase Polo-like kinase 1 (Plk1) pour l'initiation de l'activation de Cycline B1-Cdk1. Bien que les rôles de Plk1 au cours de la mitose soient bien caractérisés, sa contribution dans la régulation de l'entrée des cellules en mitose reste controversée. Au niveau moléculaire, Plk1 phosphoryle au moins in vitro, plusieurs régulateurs de Cycline B1-Cdk1, tels que Cdc25B & C, et Wee1 et Myt1. Cependant, il reste largement inconnu si ces événements de phosphorylation se produisent in vivo et s'ils contribuent de manière significative au processus de l'activation de Cycline B1-Cdk1 permettant l'entrée en mitose.

One of the major properties of the thyroid is iodine uptake from the bloodstream through an iodide transporter (NIS for Natrium Iodide Symporter). This capacity plays a key role in the thyroid hormones synthesis, but also in both diagnosis and treatment of thyroid cancer. However, due to a decrease or absence of the NIS expression in some tumors and metastases, patients become refractory to the metabolic radiotherapy and present a radioresistance, which cause a public health problem.The BRAFV600E oncogene, a potent activator of the MAP kinase pathway, is detected in 40-60% of papillary thyroid cancer (PTC), which represent 80% of total thyroid cancers. The BRAFV600E mutation is associated with the more aggressive thyroid tumors. However, the pharmacological inhibition of the MAP kinase pathway, constitutively induced by the BRAFV600E oncogene, is not able to restore alone the expression of NIS in patients with BRAFV600E mutated thyroid cancer. This suggests that other compensatory mechanisms may contribute to the radioresistance. A recent study in a mouse model demonstrated that downregulation of NIS by BRAFV600E oncogene is mediated through the TGF beta activation. An other showed that the expression of NIS is dependent on the redox status of the cell, suggesting a role for the reactive oxygen species (ROS). In cells, ROS can be produced by the NADPH oxidases (NOX/DUOX). The Thyroid gland expresses three of them: DUOX2, which is necessary for the thyroid hormones synthesis, but also DUOX1 and NOX4 whose the physiological role remains unknown. NOX4, which is overexpressed in the PTCs, has been shown to be a new key effector of the TGF beta pathway.In my thesis project, I was interested in studying the role of NOX4 in the negative regulation of NIS in BRAFV600E mutated CPT. The study of the mechanism, made from two human cell lines derived from BRAF-mutated papillary thyroid cancers (BCPAP and 8505C), has revealed that the oncogene BRAFV600E controls the expression of NOX4 at the transcriptional level via the TGF-beta/Smad3 pathway. These results were validated on both a rat thyroid cell line conditionnaly expressing BRAFV600E and on human thyrocytes in primary culture. Importantly, the use of antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) or specific inhibition of NOX4 expression by RNA interference allow reinduction of NIS expression. These results, which show that ROS produced by NOX4 inhibit the expression of iodine transporter (NIS), establish a link between the oncogene BRAFV600E and NOX4. A comparative analysis of the NOX4 expression, made from 500 papillary thyroid cancers mutated or not for BRAF (TCGA data), confirms that NOX4 is significantly increased in BRAF-mutated cancers and that this is correlated with a decrease of NIS mRNA. Furthermore, the level of NOX4 is inversely related to thyroid differentiation score, suggesting that NOX4 might be involved in the dedifferentiation process. This study opens a new opportunity for optimizing the use of metabolic radiotherapy in the treatment of thyroid cancers refractory to radioiodine I131and makes NOX4 as a potential therapeutic target.; Une des propriétés majeures de la thyroïde est de capter l’iode de la circulation sanguine grâce à la présence d’un transporteur d’iodure (NIS pour Natrium Iodide Symporter). Cette capacité d’accumulation d’iode par les thyrocytes joue un rôle clé dans la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi dans le diagnostic et le traitement des cancers de la thyroïde. Cependant, en raison d’une diminution ou de l’absence de l’expression du NIS dans certaines tumeurs et métastases, des patients deviennent réfractaires à la radiothérapie métabolique et présentent une radiorésistance, causant ainsi un problème de santé publique.L’oncogène BRAFV600E, un puissant activateur de La voie MAP kinase, est détecté dans 40 - 60% des cancers thyroïdiens de type papillaires (CPT) qui représentent 80% de la totalité des cancers thyroïdiens. La mutation BRAFV600E est associée aux tumeurs thyroïdiennes les plus agressives. Cependant l’inhibition pharmacologique de la voie MAP kinase induite constitutivement par l’oncogène BRAFV600E ne permet pas, à elle seule, de rétablir l’expression du NIS chez des patients atteints d’un cancer de la thyroïde muté BRAFV600E. Ceci suggère que d’autres mécanismes compensatoires peuvent contribuer à la radiorésistance. Une étude récente menée sur un modèle murin a montré que la régulation négative du NIS par l’oncogène BRAFV600E est médiée par la voie du TGF beta. Une autre a montré que l’expression du NIS serait dépendante de l’état redox de la cellule, suggérant un rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans les cellules les ROS peuvent être produites par les NADPH oxydases (NOX/DUOX). La thyroïde en exprime trois : DUOX2 nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi que DUOX1 et NOX4 dont le rôle physiologique reste inconnu. NOX4, surexprimé dans les CPTs, a été montré être un nouvel effecteur clé de la voie du TGF beta dans d’autres cancers.Dans mon projet de thèse, je me suis intéressée à l’étude du rôle de NOX4 dans la régulation négative du NIS dans les CPT mutés BRAFV600E. L’étude du mécanisme, réalisée à partir de deux lignées humaines issues de cancers papillaires mutés pour BRAF (BCPAP et 8505C), a permis d’établir que l’oncogène BRAFV600E contrôle l’expression de NOX4 au niveau transcriptionnel via la voie TGF-beta/Smad3. Ces résultats ont été validés sur une lignée de rat exprimant de manière conditionnelle BRAFV600E ainsi que sur des thyrocytes humains en culture primaire. De manière importante, l’utilisation d’antioxydants tels que le N-acetyl cystéine (NAC) ou l’inhibition spécifique de l’expression de NOX4 par ARN interférence permet de réinduire l’expression du NIS. Ces résultats qui montrent que les ROS produites par NOX4 inhibent l’expression du transporteur de l’iode (NIS) établissent un lien entre l’oncogène BRAFV600E et NOX4. Une analyse comparative de l'expression de NOX4 effectuée à partir de 500 cancers papillaires de la thyroïdes mutés ou non pour BRAF (données TCGA) confirme que NOX4 est significativement augmenté dans les cancers porteurs de la mutation BRAF et que ceci est corrélé à une diminution de l’ARNm du NIS. Par ailleurs, le niveau de NOX4 est inversement corrélé au score de différenciation thyroïdien, suggérant que NOX4 pourrait être impliqué dans le processus de dédifférenciation. Cette étude ouvre une nouvelle opportunité pour l’optimisation de l’utilisation de la radiothérapie métabolique dans le traitement des cancers thyroïdiens réfractaires à l’iode I131 et présente NOX4 comme une cible thérapeutique potentielle.

One of the major properties of the thyroid is iodine uptake from the bloodstream through an iodide transporter (NIS for Natrium Iodide Symporter). This capacity plays a key role in the thyroid hormones synthesis, but also in both diagnosis and treatment of thyroid cancer. However, due to a decrease or absence of the NIS expression in some tumors and metastases, patients become refractory to the metabolic radiotherapy and present a radioresistance, which cause a public health problem.The BRAFV600E oncogene, a potent activator of the MAP kinase pathway, is detected in 40-60% of papillary thyroid cancer (PTC), which represent 80% of total thyroid cancers. The BRAFV600E mutation is associated with the more aggressive thyroid tumors. However, the pharmacological inhibition of the MAP kinase pathway, constitutively induced by the BRAFV600E oncogene, is not able to restore alone the expression of NIS in patients with BRAFV600E mutated thyroid cancer. This suggests that other compensatory mechanisms may contribute to the radioresistance. A recent study in a mouse model demonstrated that downregulation of NIS by BRAFV600E oncogene is mediated through the TGF beta activation. An other showed that the expression of NIS is dependent on the redox status of the cell, suggesting a role for the reactive oxygen species (ROS). In cells, ROS can be produced by the NADPH oxidases (NOX/DUOX). The Thyroid gland expresses three of them: DUOX2, which is necessary for the thyroid hormones synthesis, but also DUOX1 and NOX4 whose the physiological role remains unknown. NOX4, which is overexpressed in the PTCs, has been shown to be a new key effector of the TGF beta pathway.In my thesis project, I was interested in studying the role of NOX4 in the negative regulation of NIS in BRAFV600E mutated CPT. The study of the mechanism, made from two human cell lines derived from BRAF-mutated papillary thyroid cancers (BCPAP and 8505C), has revealed that the oncogene BRAFV600E controls the expression of NOX4 at the transcriptional level via the TGF-beta/Smad3 pathway. These results were validated on both a rat thyroid cell line conditionnaly expressing BRAFV600E and on human thyrocytes in primary culture. Importantly, the use of antioxidants such as N-acetyl cysteine (NAC) or specific inhibition of NOX4 expression by RNA interference allow reinduction of NIS expression. These results, which show that ROS produced by NOX4 inhibit the expression of iodine transporter (NIS), establish a link between the oncogene BRAFV600E and NOX4. A comparative analysis of the NOX4 expression, made from 500 papillary thyroid cancers mutated or not for BRAF (TCGA data), confirms that NOX4 is significantly increased in BRAF-mutated cancers and that this is correlated with a decrease of NIS mRNA. Furthermore, the level of NOX4 is inversely related to thyroid differentiation score, suggesting that NOX4 might be involved in the dedifferentiation process. This study opens a new opportunity for optimizing the use of metabolic radiotherapy in the treatment of thyroid cancers refractory to radioiodine I131and makes NOX4 as a potential therapeutic target.; Une des propriétés majeures de la thyroïde est de capter l’iode de la circulation sanguine grâce à la présence d’un transporteur d’iodure (NIS pour Natrium Iodide Symporter). Cette capacité d’accumulation d’iode par les thyrocytes joue un rôle clé dans la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi dans le diagnostic et le traitement des cancers de la thyroïde. Cependant, en raison d’une diminution ou de l’absence de l’expression du NIS dans certaines tumeurs et métastases, des patients deviennent réfractaires à la radiothérapie métabolique et présentent une radiorésistance, causant ainsi un problème de santé publique.L’oncogène BRAFV600E, un puissant activateur de La voie MAP kinase, est détecté dans 40 - 60% des cancers thyroïdiens de type papillaires (CPT) qui représentent 80% de la totalité des cancers thyroïdiens. La mutation BRAFV600E est associée aux tumeurs thyroïdiennes les plus agressives. Cependant l’inhibition pharmacologique de la voie MAP kinase induite constitutivement par l’oncogène BRAFV600E ne permet pas, à elle seule, de rétablir l’expression du NIS chez des patients atteints d’un cancer de la thyroïde muté BRAFV600E. Ceci suggère que d’autres mécanismes compensatoires peuvent contribuer à la radiorésistance. Une étude récente menée sur un modèle murin a montré que la régulation négative du NIS par l’oncogène BRAFV600E est médiée par la voie du TGF beta. Une autre a montré que l’expression du NIS serait dépendante de l’état redox de la cellule, suggérant un rôle des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Dans les cellules les ROS peuvent être produites par les NADPH oxydases (NOX/DUOX). La thyroïde en exprime trois : DUOX2 nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes ainsi que DUOX1 et NOX4 dont le rôle physiologique reste inconnu. NOX4, surexprimé dans les CPTs, a été montré être un nouvel effecteur clé de la voie du TGF beta dans d’autres cancers.Dans mon projet de thèse, je me suis intéressée à l’étude du rôle de NOX4 dans la régulation négative du NIS dans les CPT mutés BRAFV600E. L’étude du mécanisme, réalisée à partir de deux lignées humaines issues de cancers papillaires mutés pour BRAF (BCPAP et 8505C), a permis d’établir que l’oncogène BRAFV600E contrôle l’expression de NOX4 au niveau transcriptionnel via la voie TGF-beta/Smad3. Ces résultats ont été validés sur une lignée de rat exprimant de manière conditionnelle BRAFV600E ainsi que sur des thyrocytes humains en culture primaire. De manière importante, l’utilisation d’antioxydants tels que le N-acetyl cystéine (NAC) ou l’inhibition spécifique de l’expression de NOX4 par ARN interférence permet de réinduire l’expression du NIS. Ces résultats qui montrent que les ROS produites par NOX4 inhibent l’expression du transporteur de l’iode (NIS) établissent un lien entre l’oncogène BRAFV600E et NOX4. Une analyse comparative de l'expression de NOX4 effectuée à partir de 500 cancers papillaires de la thyroïdes mutés ou non pour BRAF (données TCGA) confirme que NOX4 est significativement augmenté dans les cancers porteurs de la mutation BRAF et que ceci est corrélé à une diminution de l’ARNm du NIS. Par ailleurs, le niveau de NOX4 est inversement corrélé au score de différenciation thyroïdien, suggérant que NOX4 pourrait être impliqué dans le processus de dédifférenciation. Cette étude ouvre une nouvelle opportunité pour l’optimisation de l’utilisation de la radiothérapie métabolique dans le traitement des cancers thyroïdiens réfractaires à l’iode I131 et présente NOX4 comme une cible thérapeutique potentielle.

DNA polymerase zeta (Polζ) is a key player in Translesion DNA synthesis (TLS). Polζ is unique among TLS polymerases in mammalian cells, because inactivation of the gene encoding its catalytic subunit (Rev3L) leads to embryonic lethality in the mouse. However little is known about its biological functions under normal growth conditions.Here we show that S phase progression is impaired in Rev3L-/- MEFs with a delay in mid and late S phase. Genome-wide profiling of replication timing revealed that Rev3L inactivation induces changes in the temporal replication program, mainly in particular genomic regions in which the replication machinery propagates a slower velocity. We also highlighted a global enrichment of repressive histone modifications as well as hypermethylation of major satellites DNA repeats in Rev3L-deficient cells, suggesting that fork movements can slow down or stall in specific locations, and a delay in restarting forks could promote heterochromatin formation in Rev3L-depleted cells. As a direct or indirect consequence, we found that several genes involved in growth and development are down-regulated in Rev3L-/- MEFs, which might potentially explain the embryonic lethality observed in Rev3L KO mice. Finally we discovered that HP1α directly interacts and recruits Rev3L to pericentromeric heterochromatin. We therefore propose that Polζ has been co-opted by evolution to assist DNA polymerase ε and δ in duplicating condensed chromatin domains during mid and late S phase.; La synthèse translésionnelle (TLS) est un processus important pour franchir des lésions de l’ADN au cours de la duplication du génome dans les cellules humaines. Le modèle « d’échange de polymérases » suggère que la polymérase réplicative est transitoirement remplacée par une polymérase spécialisée, qui va franchir le dommage et permettre de continuer la synthèse d’ADN. Ces ADN polymérases spécialisées appelées Pol êta (η), iota (ι), kappa (κ), zêta (ζ), et Rev1 ont été bien caractérisées pour leur capacité à franchir différents types de lésions in vitro. Un concept en émergence est que ces enzymes pourraient également être requises pour répliquer des zones spécifiques du génome qui sont « difficiles à répliquer ». Polζ est constituée d’au moins 2 sous-unités : Rev3 qui est la sous-unité catalytique et Rev7 sous-unité augmentant l’activité de Rev3L. Jusqu'ici, la fonction la mieux caractérisée de Polζ était de sa capacité à catalyser l'extension d'un mésappariement en face d'une lésion d'ADN. Cependant, il a été montré que la sous unité catalytique Rev3 de levure et humaine interagissent avec les deux sous-unités accessoires de Polδ que sont pol31 et pol32 chez la levure et p50 et p66 chez l’humain. Il a aussi été mis en évidence que Rev3L est importante pour la réplication des sites fragiles (SFCs) dans les cellules humaines, zones connues pour être à l’origine d’une instabilité génétique et pour être répliquées de manière tardive (en G2/M). Tout ceci suggère que Polζ pourrait jouer un rôle dans la réplication du génome non endommagé, et plus spécifiquement lorsque des barrières naturelles (e.g. ADN non-B) entravent la progression normale des fourches de réplication.Chez la levure S. cerevisiae, l’inactivation du gène rev3 est viable et conduit à une diminution de la mutagenèse spontanée ou induite par des agents génotoxiques suggérant que Polζ est impliquée dans le franchissement mutagène des lésions endogènes ou induite. En revanche, l’inactivation du gène Rev3L chez la souris est embryonnaire létale alors que la plupart des autres ADN polymérases spécialisées ne sont pas vitales. Ceci suggère que Polζ a acquis des fonctions essentielles au cours de l’évolution qui restent inconnues à ce jour. Les fibroblastes embryonnaires murins (MEF) Rev3L-/- présente une grande instabilité génétique spontanée associée une forte augmentation de cassures et de translocations chromosomiques indiquant que Polζ est directement impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Afin de clarifier le rôle de cette polymérase spécialisée au cours de la réplication du génome, nous avons entrepris de procéder à une étude sur les relations structure/fonction/localisation de la protéine Rev3. Notre étude met en évidence que la progression en phase S des cellules Rev3L-/- est fortement perturbée, notamment en fin de phase S. Dans ces cellules invalidées pour Rev3L, on constate des changements dans le programme de réplication et plus particulièrement dans des régions de transition (TTR) répliquées à partir du milieu de la phase S. Nous montrons aussi un enrichissement global en marques épigénétiques répressives (marques associées à l’hétérochromatine et méthylation de l’ADN) suggérant qu’un ralentissement de la progression de la fourche de réplication à des loci particuliers peut promouvoir une hétérochromatinisation lorsque Rev3L est invalidé. De manière intéressante, nous constatons une diminution de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement qui pourrait peut-être expliquer la létalité embryonnaire constatée en absence de Rev3L. Enfin, nous mettons en évidence une interaction directe entre la protéine d’organisation de l’hétérochromatine HP1α et Rev3L via un motif PxVxL. Tout ceci nous suggère fortement que Polζ pourrait assister les ADN polymérases réplicatives Polδ et Polε dans la réplication des domaines compactés de la chromatine en milieu et fin de phase S.

DNA polymerase zeta (Polζ) is a key player in Translesion DNA synthesis (TLS). Polζ is unique among TLS polymerases in mammalian cells, because inactivation of the gene encoding its catalytic subunit (Rev3L) leads to embryonic lethality in the mouse. However little is known about its biological functions under normal growth conditions.Here we show that S phase progression is impaired in Rev3L-/- MEFs with a delay in mid and late S phase. Genome-wide profiling of replication timing revealed that Rev3L inactivation induces changes in the temporal replication program, mainly in particular genomic regions in which the replication machinery propagates a slower velocity. We also highlighted a global enrichment of repressive histone modifications as well as hypermethylation of major satellites DNA repeats in Rev3L-deficient cells, suggesting that fork movements can slow down or stall in specific locations, and a delay in restarting forks could promote heterochromatin formation in Rev3L-depleted cells. As a direct or indirect consequence, we found that several genes involved in growth and development are down-regulated in Rev3L-/- MEFs, which might potentially explain the embryonic lethality observed in Rev3L KO mice. Finally we discovered that HP1α directly interacts and recruits Rev3L to pericentromeric heterochromatin. We therefore propose that Polζ has been co-opted by evolution to assist DNA polymerase ε and δ in duplicating condensed chromatin domains during mid and late S phase., La synthèse translésionnelle (TLS) est un processus important pour franchir des lésions de l’ADN au cours de la duplication du génome dans les cellules humaines. Le modèle « d’échange de polymérases » suggère que la polymérase réplicative est transitoirement remplacée par une polymérase spécialisée, qui va franchir le dommage et permettre de continuer la synthèse d’ADN. Ces ADN polymérases spécialisées appelées Pol êta (η), iota (ι), kappa (κ), zêta (ζ), et Rev1 ont été bien caractérisées pour leur capacité à franchir différents types de lésions in vitro. Un concept en émergence est que ces enzymes pourraient également être requises pour répliquer des zones spécifiques du génome qui sont « difficiles à répliquer ». Polζ est constituée d’au moins 2 sous-unités : Rev3 qui est la sous-unité catalytique et Rev7 sous-unité augmentant l’activité de Rev3L. Jusqu'ici, la fonction la mieux caractérisée de Polζ était de sa capacité à catalyser l'extension d'un mésappariement en face d'une lésion d'ADN. Cependant, il a été montré que la sous unité catalytique Rev3 de levure et humaine interagissent avec les deux sous-unités accessoires de Polδ que sont pol31 et pol32 chez la levure et p50 et p66 chez l’humain. Il a aussi été mis en évidence que Rev3L est importante pour la réplication des sites fragiles (SFCs) dans les cellules humaines, zones connues pour être à l’origine d’une instabilité génétique et pour être répliquées de manière tardive (en G2/M). Tout ceci suggère que Polζ pourrait jouer un rôle dans la réplication du génome non endommagé, et plus spécifiquement lorsque des barrières naturelles (e.g. ADN non-B) entravent la progression normale des fourches de réplication.Chez la levure S. cerevisiae, l’inactivation du gène rev3 est viable et conduit à une diminution de la mutagenèse spontanée ou induite par des agents génotoxiques suggérant que Polζ est impliquée dans le franchissement mutagène des lésions endogènes ou induite. En revanche, l’inactivation du gène Rev3L chez la souris est embryonnaire létale alors que la plupart des autres ADN polymérases spécialisées ne sont pas vitales. Ceci suggère que Polζ a acquis des fonctions essentielles au cours de l’évolution qui restent inconnues à ce jour. Les fibroblastes embryonnaires murins (MEF) Rev3L-/- présente une grande instabilité génétique spontanée associée une forte augmentation de cassures et de translocations chromosomiques indiquant que Polζ est directement impliquée dans le maintien de la stabilité du génome. Afin de clarifier le rôle de cette polymérase spécialisée au cours de la réplication du génome, nous avons entrepris de procéder à une étude sur les relations structure/fonction/localisation de la protéine Rev3. Notre étude met en évidence que la progression en phase S des cellules Rev3L-/- est fortement perturbée, notamment en fin de phase S. Dans ces cellules invalidées pour Rev3L, on constate des changements dans le programme de réplication et plus particulièrement dans des régions de transition (TTR) répliquées à partir du milieu de la phase S. Nous montrons aussi un enrichissement global en marques épigénétiques répressives (marques associées à l’hétérochromatine et méthylation de l’ADN) suggérant qu’un ralentissement de la progression de la fourche de réplication à des loci particuliers peut promouvoir une hétérochromatinisation lorsque Rev3L est invalidé. De manière intéressante, nous constatons une diminution de l’expression de plusieurs gènes impliqués dans le développement qui pourrait peut-être expliquer la létalité embryonnaire constatée en absence de Rev3L. Enfin, nous mettons en évidence une interaction directe entre la protéine d’organisation de l’hétérochromatine HP1α et Rev3L via un motif PxVxL. Tout ceci nous suggère fortement que Polζ pourrait assister les ADN polymérases réplicatives Polδ et Polε dans la réplication des domaines compactés de la chromatine en milieu et fin de phase S.

DNA replication is a physiological process, essential for genetic information transmission but DNA replication is also an important source of endogenous stress. Replicative stress can lead to genomic instability and has been reported in early-stage malignancies and senescence.Homologous recombination is a repair process which can handle replicative stress. Therefore, a defect in homologous recombination could reveal endogenous replicative stresses. Consistently, a slow down in replication fork progression has been observed in homologous recombination deficient (HR-) cells, in absence of any exogenous treatment (Daboussi et al. 2008). In addition, several studies have shown the presence of mitotic defects in HR- cells, in absence of any exogenous treatment (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier et al. 2011; Rodrigue 2013). The origin of these spontaneous mitotic defects is still unclear. Indeed, homologous recombination is preferentially active in S and G2 phases thus, the link with mitosis remains to be elucidated.The aim of this thesis is to understand the impact of a low or endogenous replicative stress on post-replicative phases.First, I studied the impact of a low or endogenous replicative stress on mitosis. Control cells were treated with very low hydroxyurea doses, that did not affected cell cycle progression but did slow down the replication fork progression to the same level than unchallenged HR- cells. Importanntly, exposure of the control cells to these low hydroxyurea doses generated the same mitotic defects, notably extra centrosomes, and to the same extent than in untreated HR- cells. Reciprocally, supplying nucleotide precursors to HR- cells suppressed both their replication deceleration and mitotic extra centrosome phenotypes. Therefore, subtle replication stress that does not impact S and G2 phase progression nor the entry in mitosis, nevertheless causes severe mitotic defects. Importantly, mitotic extra centrosome can lead to multipolar mitosis and then impact the whole genome stability. These data highlight the crosstalk between chromosome replication and segregation.Secondly, I studied the impact of low or endogenous replicative stress on G2 phase. This study was done using HR- cells as well as control cells treated with very low HU doses to induce a very low replicative stress. In both of these models, the presence of pRPA-Ser33 foci was observed in G2 phase, highlighting replicative stress regions. After very low HU treatement, we observed 53BP1 and RAD51 foci in G2 phase. These foci partially colocalized with pRPA-Ser33 foci in G2 phase. Mass spectrometry analyse after 53BP1 coimmunoprecipitation allowed to etablish a link between proteins involved in mitotic spindle assembly control and in mitotic checkpoint. These data support the link between replicative stress and mitotic defects. Lastly, the immmunoprecipitation of the chromatin interacting with pRPA-Ser33 in G2 phase, followed by sequencing (ChIPseq) allowed to reveal the absence of common fragile site enrichment and to highlight an enrichment at promoter regions of genes involved in cell cycle and cell death regulation. These data underline the link between very low or endogenous replicative stress and chromosomal instability, which can lead to tumorigenesis.; La réplication de l’ADN est un phénomène physiologique essentiel à la transmission du patrimoine génétique mais est aussi une source importante de stress endogène. Le stress réplicatif peut conduire à une instabilité génomique et a été mis en évidence à une étape très précoce du développement tumoral et de la sénescence. La recombinaison homologue (RH) est un processus de réparation qui permet la prise en prise en charge du stress réplicatif. De ce fait, un défaut de RH devrait permettre de révéler les stress réplicatifs endogènes. Ainsi, une progression ralentie des fourches de réplication a été observée dans des cellules déficientes pour la RH (RH-), et ce en absence de tout traitement exogène (Daboussi 2008). De plus, de nombreux travaux ont mis en évidence la présence de défauts mitotiques dans les cellules RH-, en absence de tout traitement exogène (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier 2011; Rodrigue 2013). L’origine de ces défauts mitotiques spontanés reste peu claire. En effet, la RH étant un processus préférentiellement actif au cours des phases S et G2, le lien avec la mitose reste à éclaircir. Cette thèse a pour but de comprendre l’impact du stress réplicatif très faible ou endogène sur les phases post-réplicatives du cycle cellulaire. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l’impact de ce stress sur la mitose. Les résultats obtenus montrent que le traitement des cellules contrôle à de très faibles doses d’hydroxyurée (HU) n’affecte pas la progression dans le cycle cellulaire mais induit cependant une diminution de la vitesse de réplication, comparable à celle observée dans les cellules RH-. De plus le traitement des cellules contrôle à des faibles doses d’HU induit l’apparition de défauts mitotiques, notamment des centrosomes surnuméraires, à la même fréquence que dans les cellules RH- non traitées. Inversement, l’ajout de précurseurs de nucléotides dans les cellules RH- permet de supprimer la diminution de la vitesse de réplication ainsi que les centrosomes mitotiques surnuméraires. Ainsi, un stress réplicatif subtil, qui n’impacte pas de façon détectable la progression dans les phases S et G2 du cycle cellulaire, ni l’entrée en mitose, cause cependant des défauts mitotiques sévères. De façon importante, les centrosomes mitotiques surnuméraires peuvent entrainer des mitoses multipolaires, impactant ainsi l’ensemble du génome. Ces données mettent en évidence la connexion qui existe entre la réplication des chromosomes et leur ségrégation. Dans un second temps, j’ai étudié l’impact du stress réplicatif faible ou endogène en phase G2. Cette étude a été réalisée en utilisant des cellules RH-, ainsi qu’un modèle d’induction de faible stress réplicatif après traitement à très faible dose d’HU. La présence de foyers pRPA-Ser33 en phase G2 a été observée dans ces deux modèles, mettant en évidence des zones de stress réplicatif. Après traitement à très faible dose d’HU, nous observons également la présence en phase G2 de foyers 53BP1 et RAD51 qui colocalisent partiellement avec les foyers pRPA-Ser33. L’analyse en spectrométrie de masse après co-immunoprécipitation de la protéine 53BP1 en phase G2 a permis d’établir un lien avec des protéines impliquées dans le contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique ainsi que dans le points de contrôle mitotique, étayant ainsi le lien entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques. Pour finir, l’immunoprécipitation de la chromatine liée à la protéine pRPA-Ser33 en phase G2, suivie d’un séquençage (ChIPseq), a permis de révéler l’absence d’enrichissement au niveau des sites fragiles communs et de mettre en évidence un enrichissement au niveau des régions promotrices de certains gènes, notamment de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent le lien entre le stress réplicatif très faible ou endogène et l’instabilité chromosomique, qui peut mener à l’initiation tumorale.

DNA replication is a physiological process, essential for genetic information transmission but DNA replication is also an important source of endogenous stress. Replicative stress can lead to genomic instability and has been reported in early-stage malignancies and senescence.Homologous recombination is a repair process which can handle replicative stress. Therefore, a defect in homologous recombination could reveal endogenous replicative stresses. Consistently, a slow down in replication fork progression has been observed in homologous recombination deficient (HR-) cells, in absence of any exogenous treatment (Daboussi et al. 2008). In addition, several studies have shown the presence of mitotic defects in HR- cells, in absence of any exogenous treatment (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier et al. 2011; Rodrigue 2013). The origin of these spontaneous mitotic defects is still unclear. Indeed, homologous recombination is preferentially active in S and G2 phases thus, the link with mitosis remains to be elucidated.The aim of this thesis is to understand the impact of a low or endogenous replicative stress on post-replicative phases.First, I studied the impact of a low or endogenous replicative stress on mitosis. Control cells were treated with very low hydroxyurea doses, that did not affected cell cycle progression but did slow down the replication fork progression to the same level than unchallenged HR- cells. Importanntly, exposure of the control cells to these low hydroxyurea doses generated the same mitotic defects, notably extra centrosomes, and to the same extent than in untreated HR- cells. Reciprocally, supplying nucleotide precursors to HR- cells suppressed both their replication deceleration and mitotic extra centrosome phenotypes. Therefore, subtle replication stress that does not impact S and G2 phase progression nor the entry in mitosis, nevertheless causes severe mitotic defects. Importantly, mitotic extra centrosome can lead to multipolar mitosis and then impact the whole genome stability. These data highlight the crosstalk between chromosome replication and segregation.Secondly, I studied the impact of low or endogenous replicative stress on G2 phase. This study was done using HR- cells as well as control cells treated with very low HU doses to induce a very low replicative stress. In both of these models, the presence of pRPA-Ser33 foci was observed in G2 phase, highlighting replicative stress regions. After very low HU treatement, we observed 53BP1 and RAD51 foci in G2 phase. These foci partially colocalized with pRPA-Ser33 foci in G2 phase. Mass spectrometry analyse after 53BP1 coimmunoprecipitation allowed to etablish a link between proteins involved in mitotic spindle assembly control and in mitotic checkpoint. These data support the link between replicative stress and mitotic defects. Lastly, the immmunoprecipitation of the chromatin interacting with pRPA-Ser33 in G2 phase, followed by sequencing (ChIPseq) allowed to reveal the absence of common fragile site enrichment and to highlight an enrichment at promoter regions of genes involved in cell cycle and cell death regulation. These data underline the link between very low or endogenous replicative stress and chromosomal instability, which can lead to tumorigenesis.; La réplication de l’ADN est un phénomène physiologique essentiel à la transmission du patrimoine génétique mais est aussi une source importante de stress endogène. Le stress réplicatif peut conduire à une instabilité génomique et a été mis en évidence à une étape très précoce du développement tumoral et de la sénescence. La recombinaison homologue (RH) est un processus de réparation qui permet la prise en prise en charge du stress réplicatif. De ce fait, un défaut de RH devrait permettre de révéler les stress réplicatifs endogènes. Ainsi, une progression ralentie des fourches de réplication a été observée dans des cellules déficientes pour la RH (RH-), et ce en absence de tout traitement exogène (Daboussi 2008). De plus, de nombreux travaux ont mis en évidence la présence de défauts mitotiques dans les cellules RH-, en absence de tout traitement exogène (Griffin 2000; Kraakman-van der Zwet 2002; Bertrand 2003; Daboussi 2005; Laulier 2011; Rodrigue 2013). L’origine de ces défauts mitotiques spontanés reste peu claire. En effet, la RH étant un processus préférentiellement actif au cours des phases S et G2, le lien avec la mitose reste à éclaircir. Cette thèse a pour but de comprendre l’impact du stress réplicatif très faible ou endogène sur les phases post-réplicatives du cycle cellulaire. Dans un premier temps, je me suis intéressée à l’impact de ce stress sur la mitose. Les résultats obtenus montrent que le traitement des cellules contrôle à de très faibles doses d’hydroxyurée (HU) n’affecte pas la progression dans le cycle cellulaire mais induit cependant une diminution de la vitesse de réplication, comparable à celle observée dans les cellules RH-. De plus le traitement des cellules contrôle à des faibles doses d’HU induit l’apparition de défauts mitotiques, notamment des centrosomes surnuméraires, à la même fréquence que dans les cellules RH- non traitées. Inversement, l’ajout de précurseurs de nucléotides dans les cellules RH- permet de supprimer la diminution de la vitesse de réplication ainsi que les centrosomes mitotiques surnuméraires. Ainsi, un stress réplicatif subtil, qui n’impacte pas de façon détectable la progression dans les phases S et G2 du cycle cellulaire, ni l’entrée en mitose, cause cependant des défauts mitotiques sévères. De façon importante, les centrosomes mitotiques surnuméraires peuvent entrainer des mitoses multipolaires, impactant ainsi l’ensemble du génome. Ces données mettent en évidence la connexion qui existe entre la réplication des chromosomes et leur ségrégation. Dans un second temps, j’ai étudié l’impact du stress réplicatif faible ou endogène en phase G2. Cette étude a été réalisée en utilisant des cellules RH-, ainsi qu’un modèle d’induction de faible stress réplicatif après traitement à très faible dose d’HU. La présence de foyers pRPA-Ser33 en phase G2 a été observée dans ces deux modèles, mettant en évidence des zones de stress réplicatif. Après traitement à très faible dose d’HU, nous observons également la présence en phase G2 de foyers 53BP1 et RAD51 qui colocalisent partiellement avec les foyers pRPA-Ser33. L’analyse en spectrométrie de masse après co-immunoprécipitation de la protéine 53BP1 en phase G2 a permis d’établir un lien avec des protéines impliquées dans le contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique ainsi que dans le points de contrôle mitotique, étayant ainsi le lien entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques. Pour finir, l’immunoprécipitation de la chromatine liée à la protéine pRPA-Ser33 en phase G2, suivie d’un séquençage (ChIPseq), a permis de révéler l’absence d’enrichissement au niveau des sites fragiles communs et de mettre en évidence un enrichissement au niveau des régions promotrices de certains gènes, notamment de gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire et de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent le lien entre le stress réplicatif très faible ou endogène et l’instabilité chromosomique, qui peut mener à l’initiation tumorale.

DNA double-strand breaks (DSBs) repair is essential for genome stability/diversity, but can also generate genome rearrangements. Although non-homologous end-joining (NHEJ) is required for genome stability maintenance, the joining of distant double strand ends (DSE) should inexorably lead to genetic rearrangements. We analyzed the efficiency and accurency of close or distal EJ repair. Our data show that global end-joining is more efficient on close ends (34bp) compared to distal ends (3200bp) and that C-NHEJ is favored on close ends, resulting in more accurate outcome, compared to distal ends where more mutagenic A-EJ events takes place. In addition, the joining of distal ends favors the insertion/capture of DNA sequences. These data show only few kb distances between two DSEs are sufficient to jeopardize DSB repair efficiency and accuracy, leading to complex scars at the re-sealed junctions, and cell response is sufficiently sensitive to differently process such distal ends. We next addressed the question of the mechanisms preventing the joining of distant DSE. We show that depletion of the cohesin complex proteins specifically stimulates the end-joining of I-SceI-induced DSBs distant of 3200bp, while the joining of close DSEs (34bp) remained unaffected. Consistently, exome sequencing and cytogenetic analysis revealed that RAD21 ablation generates large chromosome rearrangements and a strong induction of replication stress-induced chromosome fusions. These data reveal a role for the cohesin complex in the protection against profound genome rearrangements arising through ligation of distant DSEs.; Au cours de la réplication, la réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homologue (RH), basée sur la synthèse d’ADN à partir de la chromatide sœur, permet le maintien de la stabilité du génome. La religature d’extrémités (EJ) éloignées de CDB peut quant à elle générer des réarrangements menaçant son intégrité. Nous avons étudié le mécanisme de réparation par EJ en fonction de la distance séparant deux cassures double brin. En utilisant des substrats intra-chromosomiques permettant la mesure de l’efficacité et de la fidélité du EJ après ligature d’extrémités éloignées ou proximales, nous avons mis en évidence l’implication du complexe de cohésion dans l’inhibition du EJ d’extrémités distales. Le complexe de cohésion joue donc un rôle central dans l’interface réplication/réparation ; la cohésion des chromatides sœurs favorise la réparation par RH et permet l’inhibition spécifique du EJ d’extrémités éloignées, probablement en limitant la mobilité de la chromatine endommagée et la formation d’une synapse propice au rapprochement des extrémités. La religature d’extrémités éloignées est également nécessaire aux mécanismes de diversification des gènes des immunoglobulines tels que la recombinaison V(D)J et la commutation de classe. L’étude de souris Rad21+/- a également démontré une implication du complexe de cohésion dans ces mécanismes essentiels à la diversité de l’information génétique. Le complexe de cohésion étant impliqué dans ces mécanismes et dans l’inhibition des réarrangements complexes tels que les translocations et insertions il est un acteur essentiel de la diversité et de la stabilité génomique.

Medullary thyroid carcinoma (MTC) is a rare neuroendocrine tumor, arising from calcitonin-secreting cells. This cancer occurs in a family context in a third of cases. All inherited forms and nearly 40% of sporadic forms are caused by activating point-mutations in the RET oncogene, coding for a tyrosine-kinase receptor. Other oncogenic events causing sporadic cases remain unclear, but activating mutations of RAS oncogenes have been discovered recently.Prognosis of MTC is essentially linked to early lymph node occurrence. Initial surgery of metastatic forms is often insufficient and patients are considered in therapeutic dead-end. The recent advent of selective tyrosine-kinase inhibitors (TKIs) has brought a new impetus to the management of refractory tumors, some of them targeting the RET receptor. Optimization of these treatments require improving knowledge of the underlying molecular mechanisms of tumor development.In this context and helped by a large collection of human specimens, we have sought to deepen the description of genomic landscape of MTC.At first, we evaluated the structural and chromosomal abnormalities presented by MTC. We showed, by optimizing sequencing methods, that RET and RAS mutations are involved in over 96% of the cases, these events are mutually exclusives. These mutations can distinguish several groups of aggressiveness and of response to TKI treatments. We also observed, by comparative genomic hybridization techniques, recurrent abnormalities such as deletion of the short arm of chromosome 1 and loss of entire chromosomes 4 and 22. These losses appear to be early events of tumorigenesis MTC.In a second step, we determined - by a microarray approach – the microRNA expression profile of MTC. Some of these post-transcriptional regulators seem related to tumor invasiveness, such as miR-21, miR-199 and miR-129. We demonstrated the potential of microRNAs miR-21 and miR-199 as circulating diagnosis biomarkers of MTC. The functional impact of the precursor forms mir-21 and mir-129 was then evaluated by transfection in TT and MZ- CRC1 cellular models.Observations obtained pave the way for a lot of new potential studies. They allow the definition of tissue biomarkers distinguishing metastatic forms or refractory patients. Finally, they highlight new pathways for the discovery of additional therapeutic targets in this disease.; Le carcinome médullaire de la thyroïde (CMT) est une tumeur neuroendocrine rare, se développant à partir des cellules sécrétant la calcitonine. Cette tumeur survient dans un contexte familial dans un tiers des cas. Toutes les formes germinales et près de 40% des formes sporadiques sont causées par une mutation ponctuelle activatrice de l’oncogène RET, codant pour un récepteur membranaire à activité tyrosine kinase. Les événements oncogéniques à l’origine des formes sporadiques non mutées RET restent mal définis, à l’exception de mutations activatrices des oncogènes RAS découvertes récemment.Le pronostic péjoratif du CMT est essentiellement lié à un envahissement ganglionnaire précoce. A ce titre, la chirurgie initiale est souvent insuffisante et les formes métastatiques ont longtemps été considérées en impasse thérapeutique. L’avènement récent des inhibiteurs séléctifs de tyrosine kinases (ITK) a apporté un nouvel élan à la prise en charge des tumeurs réfractaires, certains d’entre eux incluant dans leur spectre d’action le récepteur RET. Mais l’optimisation de ces traitements requiert une connaissance préalable des mécanismes moléculaires sous-jacents au développement tumoral.Dans ce contexte et en nous appuyant sur une collection importante de prélèvements humains, nous avons cherché à approfondir la decription du ‘paysage génomique’ du CMT.Dans un premier temps, nous avons évalué les anomalies structurales ponctuelles et chromosomiques présentées par les CMT. Nous avons montré, par optimisation de méthodes de séquençage, que les mutations des gènes RET et RAS interviennent dans plus de 96% des cas et que ces évènements sont mutuellement exclusifs. Ces mutations permettent de distinguer plusieurs groupes d’agressivité et de réponse aux traitements par ITK. Nous avons également observé - par technique d’hybridation génomique comparative - des anomalies de grande ampleur récurrentes dans cette pathologie : les délétions du bras court du chromosome 1 et des chromosomes entiers 4 et 22 apparaissent comme étant des évènements précoces et indépendants de la tumorigenèse du CMT.Dans un second temps, nous avons déterminé - par approche de type biopuce - les profils d’expression de microARN dans les CMT. Certains de ces régulateurs post-transcriptionnels majeurs semblent liés au caractère invasif de la tumeur, et notamment les miR-21, miR-199 et miR-129. Nous avons également démontré le potentiel d’utilisation des microARN miR-21 et miR-199 en tant que biomarqueurs circulants du CMT. L’impact fonctionnel des formes précurseurs mir-21 et mir-129 a ensuite été évalué par transfection dans les modèles cellulaires TT et MZ-CRC1.Les observations ainsi obtenues offrent de nombreuses perspectives d’études. Elles permettent la définition de marqueurs tissulaires distinguant a priori les tumeurs métastatiques et/ou réfractaires aux thérapies. Enfin, elles mettent en lumière de nouvelles pistes pour la découverte de cibles thérapeutiques additionnelles dans cette pathologie.

DNA damages interfere with replication and transcription. They are normally eliminated by repair mechanisms, such as nucleotide excision repair (NER). They can also be tolerated by translesion DNA synthesis (TLS). During my PhD work, we studied the involvement of NER pathway and DNA polymerase η (Polη) associated with TLS in response to DNA damages induced by ultraviolet (UV) and a chemotherapeutic drug, doxorubicin.The main lesions induced by UV irradiation are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine (6-4) pyrimidones (6-4PPs) which are removed by NER. Data on the formation of single-stranded DNA regions and those of the cell cycle suggest that 6-4PPs lesions are tolerated by a post-replication repair mechanism in XP-C cells (xeroderma pigmentosum group C, deficient in NER). In a second time, my goal was to determine the contribution of Polη in the tolerance of lesions induced by UV in XP-C cells. Indeed, it is known that Polη is responsible for the replication of CPDs, but in the absence of Polη, NER-proficient cells are not hypersensitive to UV rays. In addition, it was suggested that Polη is also involved in the TLS of 6-4PPs. By knocking down (KD) the expression of the gene encoding Polη in XP-C cells with a shRNA, we established the first stable line of human fibroblasts deficient in both NER and Polη (XP-C/PolηKD). This functional reduction in the expression of Polη in XP-C cells irradiated with low UVC dose resulted in an irreversible cell cycle arrest, the generation of single- and double-strand DNA breaks and significant cell death. These data demonstrate a crucial role for Polη in the survival of NER-deficient cells after UV irradiation and suggest that Polη can also participate in the TLS of 6-4PPs.In addition, we showed that cells deficient in NER or Polη are sensitized by treatment with doxorubicin indicating that NER and Polη also participate in the response of DNA damages induced by this agent.In conclusion, during my PhD work, we highlighted the complex interconnections between Polη and NER pathway in response to different genotoxic agents.; Les dommages de l’ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l’implication de la voie NER et de l’ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l’ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d’ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l’absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l’expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j’ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l’expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d’UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l’ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques.; Os danos do DNA interferem com a sua replicação e transcrição. Eles são normalmente removidos por mecanismos de reparo, como o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Lesões não removidas também podem ser toleradas por processos específicos de síntese de translesão (TLS). Durante este trabalho de tese, estudamos a implicação da via NER e da DNA polimerase η (Polη), associada à TLS, na resposta aos danos no DNA provocados pela irradiação ultravioleta (UV) e por um agente quimioterápico, a doxorrubicina.As principais lesões provocadas pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e as pirimidinas (6-4) pirimidonas (6-4PPs) que são removidas pelo NER. Os resultados obtidos sobre a formação de regiões de DNA simples fita e os dados de ciclo celular indicam que as lesões 6-4PPs são toleradas por un mecanismo de reparo pós-replicativo em células XP-C deficientes em NER (xeroderma pigmentosum do grupo C). Em seguida, buscamos determinar a contribuição da Polη na tolerância de lesões UV em células XP-C. De fato, é conhecido que a Polη é responsável pela replicação dos CPDs, porém a ausência dessa em células proficientes em NER não as torna hypersensíveis à irradiação UV. Além disso, foi sugerido que Polη poderia estar envolvida na TLS dos 6-4PPs. A expressão do gene POLH, que codifica Polη, foi silenciada através de shRNA em células XP-C, sendo assim estabelecida a primeira linhagem estável de fibroblastos humanos deficientes em ambas proteínas XPC e Polη. Essa redução funcional da expressão de Polη em células XP-C provocou, em células irradiadas com doses baixas de luz UV, uma parada irreversível no ciclo celular, a formação de quebras no DNA (incluindo quebras simples e dupla fita) e morte celular. Esses resultados revelam um papel crucial da Polη na sobrevida das células deficientes em NER após irradiação UV e sugerem que Polη possa também participar da TLS de lesões tipo 6-4PP.Por outro lado, participei de trabalho no qual demonstramos que células deficientes em NER ou em Polη são sensibilizadas pelo tratamento com doxorrubicina, o que indica que o NER e a Polη participam da resposta aos danos induzidos por esse agente.Em conclusão, ao longo do meu trabalho de tese, eu coloquei em evidência interconexões complexas entre a Polη e o NER em resposta a diferentes agentes genotóxicos.

DNA damages interfere with replication and transcription. They are normally eliminated by repair mechanisms, such as nucleotide excision repair (NER). They can also be tolerated by translesion DNA synthesis (TLS). During my PhD work, we studied the involvement of NER pathway and DNA polymerase η (Polη) associated with TLS in response to DNA damages induced by ultraviolet (UV) and a chemotherapeutic drug, doxorubicin.The main lesions induced by UV irradiation are cyclobutane pyrimidine dimers (CPDs) and pyrimidine (6-4) pyrimidones (6-4PPs) which are removed by NER. Data on the formation of single-stranded DNA regions and those of the cell cycle suggest that 6-4PPs lesions are tolerated by a post-replication repair mechanism in XP-C cells (xeroderma pigmentosum group C, deficient in NER). In a second time, my goal was to determine the contribution of Polη in the tolerance of lesions induced by UV in XP-C cells. Indeed, it is known that Polη is responsible for the replication of CPDs, but in the absence of Polη, NER-proficient cells are not hypersensitive to UV rays. In addition, it was suggested that Polη is also involved in the TLS of 6-4PPs. By knocking down (KD) the expression of the gene encoding Polη in XP-C cells with a shRNA, we established the first stable line of human fibroblasts deficient in both NER and Polη (XP-C/PolηKD). This functional reduction in the expression of Polη in XP-C cells irradiated with low UVC dose resulted in an irreversible cell cycle arrest, the generation of single- and double-strand DNA breaks and significant cell death. These data demonstrate a crucial role for Polη in the survival of NER-deficient cells after UV irradiation and suggest that Polη can also participate in the TLS of 6-4PPs.In addition, we showed that cells deficient in NER or Polη are sensitized by treatment with doxorubicin indicating that NER and Polη also participate in the response of DNA damages induced by this agent.In conclusion, during my PhD work, we highlighted the complex interconnections between Polη and NER pathway in response to different genotoxic agents.; Les dommages de l’ADN interfèrent avec sa réplication et sa transcription. Ils sont en général éliminés par des mécanismes de réparation, en particulier par la réparation par excision de nucléotides (NER). Ils peuvent également être tolérés grâce à la synthèse translésionnelle (TLS). Au cours de mon travail de thèse, nous avons étudié l’implication de la voie NER et de l’ADN polymérase η (Polη) associée à la TLS dans la réponse aux lésions de l’ADN induites par les rayons ultraviolet (UV) et par une drogue chimiothérapeutique, la doxorubicine. Les principales lésions induites par les rayons UV sont les dimères de pyrimidine cyclobutane (CPDs) et les pyrimidines (6-4) pyrimidones (6-4PPs) qui sont éliminées par la NER. Les données obtenues sur la formation de régions d’ADN simple brin et celles du cycle cellulaire suggèrent que les lésions 6-4PPs sont tolérées par un mécanisme de réparation post-réplicative dans des cellules XP-C déficientes en NER (xeroderma pigmentosum du groupe C). Dans un second temps, mon objectif a été de déterminer la contribution de Polη dans la prise en charge des lésions induites par les rayons UV dans les cellules XP-C. En effet, il est connu que Polη est responsable de la réplication des CPDs, mais l’absence de Polη dans des cellules proficientes en NER ne les rend pas hypersensibles aux rayons UV. De plus, il a été suggéré que Polη soit impliquée dans la TLS des 6-4PPs. En réprimant par shARN l’expression du gène codant Polη dans les cellules XP-C, j’ai réussi à établir la première lignée stable de fibroblastes humains déficients à la fois en NER et en Polη (XP-C/PolηKD). Cette réduction fonctionnelle de l’expression de Polη dans les cellules XP-C irradiées à faible dose d’UV a entraîné un arrêt irréversible du cycle cellulaire, la génération de cassures simple- et double-brin de l’ADN et une mortalité cellulaire significative. Ces résultats montrent un rôle crucial de Polη dans la survie des cellules déficientes en NER après irradiation UV et suggèrent que Polη puisse participer aussi à la TLS des 6-4PPs.Par ailleurs, nous avons montré que les cellules déficientes en NER ou en Polη ont été sensibilisées par un traitement à la doxorubicine indiquant que la NER et Polη participent également de la prise en charge des lésions induites par cet agent. Donc au cours de mon travail de thèse, j’ai mis en évidence des interconnexions complexes entre Polη et la voie NER en réponses à différents agents génotoxiques.; Os danos do DNA interferem com a sua replicação e transcrição. Eles são normalmente removidos por mecanismos de reparo, como o reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Lesões não removidas também podem ser toleradas por processos específicos de síntese de translesão (TLS). Durante este trabalho de tese, estudamos a implicação da via NER e da DNA polimerase η (Polη), associada à TLS, na resposta aos danos no DNA provocados pela irradiação ultravioleta (UV) e por um agente quimioterápico, a doxorrubicina.As principais lesões provocadas pela luz UV são os dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs) e as pirimidinas (6-4) pirimidonas (6-4PPs) que são removidas pelo NER. Os resultados obtidos sobre a formação de regiões de DNA simples fita e os dados de ciclo celular indicam que as lesões 6-4PPs são toleradas por un mecanismo de reparo pós-replicativo em células XP-C deficientes em NER (xeroderma pigmentosum do grupo C). Em seguida, buscamos determinar a contribuição da Polη na tolerância de lesões UV em células XP-C. De fato, é conhecido que a Polη é responsável pela replicação dos CPDs, porém a ausência dessa em células proficientes em NER não as torna hypersensíveis à irradiação UV. Além disso, foi sugerido que Polη poderia estar envolvida na TLS dos 6-4PPs. A expressão do gene POLH, que codifica Polη, foi silenciada através de shRNA em células XP-C, sendo assim estabelecida a primeira linhagem estável de fibroblastos humanos deficientes em ambas proteínas XPC e Polη. Essa redução funcional da expressão de Polη em células XP-C provocou, em células irradiadas com doses baixas de luz UV, uma parada irreversível no ciclo celular, a formação de quebras no DNA (incluindo quebras simples e dupla fita) e morte celular. Esses resultados revelam um papel crucial da Polη na sobrevida das células deficientes em NER após irradiação UV e sugerem que Polη possa também participar da TLS de lesões tipo 6-4PP.Por outro lado, participei de trabalho no qual demonstramos que células deficientes em NER ou em Polη são sensibilizadas pelo tratamento com doxorrubicina, o que indica que o NER e a Polη participam da resposta aos danos induzidos por esse agente.Em conclusão, ao longo do meu trabalho de tese, eu coloquei em evidência interconexões complexas entre a Polη e o NER em resposta a diferentes agentes genotóxicos.

Radiotherapy is used alone or in combination with chemotherapy to treat over 50% of cancers. Despite much progress in order to improve the benefit / risk ratio, the radiation causes many side effects. One of the known origins of thyroid cancer is exposure during childhood to ionizing radiation, either accidentally or as a result of external radiation therapy for another disease. The mechanisms by which ionizing radiation causes the appearance of thyroid cancer are numerous and not yet fully known. Ionizing radiations are genotoxic agents that induce DNA damage such as breaks and chromosomal aberrations. Although the mechanisms underlying these effects are not completely understood, it is generally accepted that ionizing radiations induce DNA damage either directly or indirectly by generating reactive oxygen species (ROS). During my PhD, we studied the role of ROS produced during irradiation in the generation of DNA damage in thyroid cells. Our results show that ROS produced after irradiation participate in the formation of RET/PTC1 rearrangements found in 70% of radiation-induced papillary cancers. ROS generated by radiolysis of water have a very short lifetime that limits their diffusion. However, by redox mechanisms, they cause changes at the cellular level, which in turn lead to the activation of ROS generating systems, which include the NADPH oxidases. Our results show that irradiation induces the expression of NADPH oxidase DUOX1 via the secretion of IL-13, several days after exposure to ionizing radiation. Inactivation of DUOX1 by interfering RNAs significantly reduces the DNA damage observed several days after irradiation. These results suggest a role DUOX1 in chronic oxidative stress that contributes to genetic instability.; La radiothérapie est utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie dans le traitement de plus de 50% des cancers. En dépit des nombreux progrès dans le but d’améliorer le rapport bénéfice/risque, l’irradiation est à l’origine de nombreux effets secondaires. Une des origines connues des cancers de la thyroïde est l’exposition pendant l’enfance aux radiations ionisantes, soit accidentelles, soit suite à un traitement par radiothérapie externe pour une autre pathologie. Les mécanismes par lesquels les radiations ionisantes provoquent l’apparition d’un cancer de la thyroïde sont nombreux et encore incomplètement connus. Les radiations ionisantes sont des agents génotoxiques qui induisent des dommages au niveau de l’ADN telles que des cassures et des aberrations chromosomiques. Bien que les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne soient pas complètement compris, il est généralement admis que les radiations ionisantes induisent des dommages à l’ADN soit de manière directe soit de manière indirecte en générant des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Durant ma thèse, nous avons étudié le rôle des ROS produit lors de l’irradiation dans la génération des dommages à l’ADN dans les cellules thyroïdiennes. Nos résultats montrent que les ROS produites après irradiation participent à la formation des réarrangements chromosomiques RET/PTC1 retrouvés dans 70% des cancers papillaires radioinduits. Les ROS engendrées par la radiolyse de l’eau ont une durée de vie extrêmement courte ce qui limite leur diffusion. Néanmoins, par des mécanismes redox, ils provoquent des modifications au niveau cellulaire qui conduisent à leur tour à l’activation de systèmes générateurs de ROS, parmi lesquels on trouve les NADPH oxydases. Nos résultats montrent que l’irradiation induit l’expression de la NADPH oxydase DUOX1 via la sécrétion d’IL-13, plusieurs jours après l’exposition aux radiations ionisantes. L’inactivation de DUOX1 par ARNs interférents diminue de manière significative les dommages de l’ADN observés plusieurs jours après irradiation. Ces résultats suggèrent un rôle de DUOX1 dans le stress oxydatif chronique qui contribue à l’instabilité génétique.

Radiotherapy is used alone or in combination with chemotherapy to treat over 50% of cancers. Despite much progress in order to improve the benefit / risk ratio, the radiation causes many side effects. One of the known origins of thyroid cancer is exposure during childhood to ionizing radiation, either accidentally or as a result of external radiation therapy for another disease. The mechanisms by which ionizing radiation causes the appearance of thyroid cancer are numerous and not yet fully known. Ionizing radiations are genotoxic agents that induce DNA damage such as breaks and chromosomal aberrations. Although the mechanisms underlying these effects are not completely understood, it is generally accepted that ionizing radiations induce DNA damage either directly or indirectly by generating reactive oxygen species (ROS). During my PhD, we studied the role of ROS produced during irradiation in the generation of DNA damage in thyroid cells. Our results show that ROS produced after irradiation participate in the formation of RET/PTC1 rearrangements found in 70% of radiation-induced papillary cancers. ROS generated by radiolysis of water have a very short lifetime that limits their diffusion. However, by redox mechanisms, they cause changes at the cellular level, which in turn lead to the activation of ROS generating systems, which include the NADPH oxidases. Our results show that irradiation induces the expression of NADPH oxidase DUOX1 via the secretion of IL-13, several days after exposure to ionizing radiation. Inactivation of DUOX1 by interfering RNAs significantly reduces the DNA damage observed several days after irradiation. These results suggest a role DUOX1 in chronic oxidative stress that contributes to genetic instability., La radiothérapie est utilisée seule ou en association avec la chimiothérapie dans le traitement de plus de 50% des cancers. En dépit des nombreux progrès dans le but d’améliorer le rapport bénéfice/risque, l’irradiation est à l’origine de nombreux effets secondaires. Une des origines connues des cancers de la thyroïde est l’exposition pendant l’enfance aux radiations ionisantes, soit accidentelles, soit suite à un traitement par radiothérapie externe pour une autre pathologie. Les mécanismes par lesquels les radiations ionisantes provoquent l’apparition d’un cancer de la thyroïde sont nombreux et encore incomplètement connus. Les radiations ionisantes sont des agents génotoxiques qui induisent des dommages au niveau de l’ADN telles que des cassures et des aberrations chromosomiques. Bien que les mécanismes qui sous-tendent ces effets ne soient pas complètement compris, il est généralement admis que les radiations ionisantes induisent des dommages à l’ADN soit de manière directe soit de manière indirecte en générant des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Durant ma thèse, nous avons étudié le rôle des ROS produit lors de l’irradiation dans la génération des dommages à l’ADN dans les cellules thyroïdiennes. Nos résultats montrent que les ROS produites après irradiation participent à la formation des réarrangements chromosomiques RET/PTC1 retrouvés dans 70% des cancers papillaires radioinduits. Les ROS engendrées par la radiolyse de l’eau ont une durée de vie extrêmement courte ce qui limite leur diffusion. Néanmoins, par des mécanismes redox, ils provoquent des modifications au niveau cellulaire qui conduisent à leur tour à l’activation de systèmes générateurs de ROS, parmi lesquels on trouve les NADPH oxydases. Nos résultats montrent que l’irradiation induit l’expression de la NADPH oxydase DUOX1 via la sécrétion d’IL-13, plusieurs jours après l’exposition aux radiations ionisantes. L’inactivation de DUOX1 par ARNs interférents diminue de manière significative les dommages de l’ADN observés plusieurs jours après irradiation. Ces résultats suggèrent un rôle de DUOX1 dans le stress oxydatif chronique qui contribue à l’instabilité génétique.

Proteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan chains (GAGs), play a major role in the architecture of extracellular matrices and are implicated in numerous cell events. The impairment of GAG synthesis and sulfation is involved in degenerative, tumor and genetic diseases, such as the progeroid form of Ehlers-Danlos (ED) syndrome. This inherited disorder is due to mutations of human [bêta]4GalT7 ([bêta]4GalT7) causing a defect in GAG synthesis, associated with severe musculo-skeletal alterations. Indeed, this enzyme catalyzes a key step in GAG synthesis linked to the core protein of PGs and from exogenous xylosides. Our work has been focused on the structural and functional characterization of human recombinant [bêta]4GalT7 enzyme. We combined in vitro and ex vivo approaches to explore the role of amino acids located in 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 and 257HLH259 motifs, which are highly conserved within [bêta]4GalTs. The study of the consequences of site-directed mutations on kinetic and functional properties of the [bêta]4GalT7 enzyme allowed us to identify key active site amino acids. Our results indicate that D165 and H257 residues form coordination bonds with Mn2+ divalent cations. Furthermore, we suggested a catalytic role for D228 residue and highlighted a central role of W224 residue via interactions with the donor and acceptor substrates. We also determined the molecular basis of [bêta]4GalT7 mutations associated with ED syndrome. Finally, the study of epigenetic regulation mechanisms by DNA methylation of GAG biosynthesis in human chondrosarcoma cells (H-EMC-SS) revealed the specific hypermethylation of the 3-O-sulfotransferase gene family, associated with the invasive phenotype of these cells. Together, this work paves the way towards innovative strategies in the treatment of arthropathies; Les chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) des protéoglycanes (PGs) jouent un rôle majeur dans la régulation de multiples événements cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus. Des perturbations de la synthèse des GAGs sont impliquées dans des pathologies d'origine dégénérative, tumorale et génétique, tel que le syndrome progéroïde d'Ehlers-Danlos (ED). Ce déficit résulte de mutations de la [bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([bêta]4GalT7) humaine associées à des atteintes sévères du système musculo-squelettique. En effet, cette enzyme catalyse une étape essentielle de l?initiation de la synthèse des GAGs à partir de la protéine "core" des PGs et de xylosides exogènes. Notre travail a porté sur l'étude structure-fonction de la [bêta]4GalT7 recombinante humaine. Nous avons associé des approches in vitro et ex vivo afin d?explorer le rôle des acides aminés des motifs 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 et 257HLH259, strictement conservés au sein des [bêta]4GalTs. L'étude des conséquences de mutations systématiques sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [bêta]4GalT7 recombinante a permis d'identifier des acides aminés essentiels du site actif. Nous avons montré que les résidus D165 et H257 forment des liaisons de coordination avec le cation Mn2+ et proposé le rôle du résidu D228 dans la catalyse. Nous avons mis en évidence un rôle central du résidu W224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nous avons également établi les bases moléculaires des mutations de la [bêta]4GalT7 associées au syndrome ED. Enfin, l'étude de mécanismes de régulation épigénétique des voies de biosynthèse des GAGs dans les cellules H-EMC-SS de chondrosarcome humain a mis en évidence une hyperméthylation spécifique des gènes de la famille des 3-O-sulfotransférases, associée à un phénotype invasif. L'ensemble de ce travail ouvre des perspectives vers de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des arthropathies