Search

Les vaccins à ARN messagers ont joué un rôle majeur dans la lutte contre la pandémie de SARS-CoV-2 grâce à une excellente efficacité et sécurité clinique. Ces vaccins ont été développés suite à des années de recherche fondamentale, dont l'une des étapes cruciales a été de remplacer l'uridine de l'ARNm par de la 1-méthyl-pseudo-uridine afin d'éviter la reconnaissance par les récepteurs de l'immunité innée, notamment le toll-like-receptor (TLR) 7. Une hypothèse, très fréquemment défendue mais jamais étayée expérimentalement, est que cet ARN modifié garde une activité immunostimulatrice à bas bruit permettant la production d'interféron de type I, agissant comme un adjuvant du vaccin. Les interférons de type I sont des cytokines antivirales essentielles et les patients ayant un déficit dans les voies de l'interféron de type I sont à haut risque de COVID-19 sévère. Dans ce travail, nous avons analysé la réponse lymphocytaire B au vaccin à ARNm de patients présentant l'absence de signalisation par les interférons de type I. Ceci nous a permis de savoir si les vaccins par ARNm permettaient d'établir une réponse lymphocytaire B robuste en l'absence d'interféron de type I. Nous avons constitué trois cohortes de patients (i) des patients avec des déficits génétiques sur les voies de l'interféron de type I : 2 patients avec une mutation homozygote d'IRF7 (facteur de transcription responsable de la production d'interférons de Type I, notamment en aval de TLR7) et un patient avec une déficit hémizygote de TLR7 (ii) des patients ayant des auto-anticorps neutralisant les interférons alpha et oméga, dans le cadre d'une polyendocrinopathie auto-immune de type I (APS-1, n = 14) (iii) des patients ayant des auto-anticorps neutralisant les interféron, associés à l'âge, une entité récemment décrite et particulièrement fréquente chez les sujets âgés (n = 8). Ces sujets ont été comparés à 29 contrôles sains. Tous étaient naïfs du COVID-19 et ont reçu 2 doses de vaccin à ARNm (BNT162n2 ou mRNA1273). Les patients ont été prélevés à différents point de temps, dans les 3 premiers mois et entre 3 et 7 mois après la seconde dose. La réponse sérologique a été évaluée par ELISA anti-IgG et IgA RBD (receptor binding domain de la Spike) et la neutralisation sérique a été testée in vitro contre le D614G-SARS-CoV-2. Les lymphocytes B (LB) mémoires CD19 + IgD-CD27± spécifiques du RBD ont été analysés en cytométrie en flux et triés en cellule unique pour séquençage des régions variables de la chaîne lourde de l'immunoglobuline. La réponse sérologique anti-RBD IgG et IgA était comparable aux temps précoces et tardifs de la réponse vaccinale, évoluant de façon similaire chez les patients déficients en interféron de type I et les sujets sains. La capacité de neutralisation des sérums contre le SARS-CoV-2 était également identique dans tous les groupes, et corrélait fortement avec le taux d'IgG anti-RBD, suggérant que le RBD était également la cible de la réponse neutralisante chez les patients déficients en interféron de type I. Des LB mémoires circulants spécifiques du RBD étaient retrouvés dans toutes les cohortes de patients déficients en interféron de type I au cours des 3 mois suivant la vaccination. Ceux-ci se maintenaient dans le temps et étaient encore présents entre 3 et 7 mois après la vaccination (0,18 % des LB IgD-CD27+ chez les sujets sains, 0,24 % chez les sujets avec déficit génétiques, 0,16 % chez les APS-1 et 0,26 % chez les AAB, pas de différence statistiquement significative). Le séquençage de la chaîne lourde des régions variables de l'immunoglobuline des LB mémoires spécifiques du RBD révélait l'accumulation progressive des mutations jusqu'à 7 mois chez les sujets sains, témoignant d'une réaction des centres germinatifs permettant la maturation d'affinité et la génération de lymphocytes B mémoires à longue durée de vie. Chez les patients IRF7 déficients, les LB mémoires spécifiques du RBD acquerraient progressivement des mutations de M1 à M6, et les LB mémoires spécifiques du RBD de patients TLR7 et APS-1 arboraient un nombre élevé de mutation dès M4, témoignant que même en l'absence de réponse à l'interféron de type I, le vaccin permettait la génération des LB mémoire issus des centres germinatifs, comme chez les sujets sains. Enfin, des clones partagés étaient retrouvés entre les sujets sains et les patients déficient en interféron de type I témoignant d'une réponse qualitativement normale. Notre travail apporte des données rassurantes sur la vaccination de ces patients à haut risque de forme de grave de COVID-19 et suggère que l'ARNm contenu dans les vaccins n'a pas de rôle adjuvant intrinsèque. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Introduction Nous avons mis en évidence que la déplétion lymphocytaire B par l’anti-CD20 induisait un processus de différenciation plasmocytaire dans la rate chez l’homme et chez la souris dans le modèle AID-Cre-EYFP. Nous avons donc souhaité déterminer les mécanismes sous-jacents responsables de la différenciation et/ou du maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B chez la souris. Nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après injection de tamoxifène. Les PC qui se sont différenciés à partir de ces cellules B conservent le marquage EYFP, permettant de les identifier, de les dater et de les suivre in vivo. Résultats Les plasmocytes de longue durée de vie résident dans une niche spécifique contenant des facteurs de survie favorables à leur maintien. En situation normale, les PLDV résident dans la moelle qui contient des cellules stromales, des éosinophiles et des facteurs solubles tels que CXCL12, a proliferation-inducing ligand (APRIL) et IL-6, qui agissent de façon synergique pour assurer le maintien des PLDV. Dans le contexte de déplétion B, nous avons pu identifier plusieurs facteurs nécessaires à la survie des PC dans la rate. De même que chez l’homme, nous avons observé une augmentation du taux de B-cell activating factor (BAFF), un facteur essentiel à la survie des cellules B, à la fois dans le sérum et les surnageants spléniques après traitement par anti-CD20. In vivo, la combinaison des anticorps anti-CD20 et anti-BAFF a permis d’obtenir une diminution drastique (fold > 5, p < 0,001) du nombre de plasmocytes de longue vie EYFP+ dans la rate comparé à la condition anti-CD20 seule, signifiant un rôle majeur de BAFF dans le maintien des PC dans la niche splénique dans le contexte de déplétion B. Au niveau de la moelle, le nombre de PC EYFP+ était aussi diminué d’un facteur deux, mais portant majoritairement sur les IgM+, nous n’avons pas observé d’hypogammaglobulinémie IgG. Les granuleux Gr1+ co-localisent dans la pulpe rouge de la rate avec les PC EYFP+. Leur nombre, ainsi que leurs interactions avec les PC EYFP+, augmentent dans le contexte de déplétion B. De plus, nous avons identifié les neutrophiles Gr1 + Ly6G+ comme la principale source de production de BAFF dans la rate, suggérant un possible rôle dans la niche de survie plasmocytaire. Enfin, les T CD4+ interagissent également de façon étroite avec les PC EYFP+ de la rate. En les déplétant spécifiquement in vivo, associé à la déplétion B, nous avons observé une diminution (fold > 2, p < 0,05) du nombre de PC EYFP+ spléniques, signifiant leur participation au maintien des PC dans la niche splénique. Les tests de déplétion des T CD4+ seuls in vivo et de co-culture in vitro des PC avec les T CD4+ suggèrent que les T CD4+ dans le contexte de déplétion B ont un meilleur effet sur la survie des PC que les T CD4+ issus de rate de souris non traitées. Ceci signifierait que les T CD4+ reçoivent des signaux différents provenant du milieu splénique après traitement par anti-CD20, confortant l’observation de modifications de l’environnement induites par la déplétion B. Conclusion En conclusion, nos résultats suggèrent qu’inhiber les facteurs de survie de la niche plasmocytaire, en particulier en utilisant l’anticorps anti-BAFF, dans le contexte du traitement par anti-CD20 permet d’interférer sur le processus de différenciation paradoxale des plasmocytes. Dans cette optique, la combinaison anti-CD20 + anti-BAFF pourrait être bénéfique dans le traitement des cytopénies auto-immunes, voire plus largement au cours des maladies auto-immunes. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Introduction L’anticorps (Ac) monoclonal anti-CD20 (rituximab) est largement utilisé dans le traitement des maladies auto-immunes, avec pourtant des résultats hétérogènes selon les indications, voire même décevants au cours du lupus. De précédentes études au cours du purpura thrombopénique immunologique (PTI) et de l’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) ont suggéré que l’Ac anti-CD20 induisait de façon paradoxale la différenciation des plasmocytes (PC) de la rate en plasmocytes de longue durée de vie (PLDV), proches des plasmocytes de longue vie naturels de la moelle osseuse. Certains de ces PLDV sont auto-réactifs, pouvant expliquer l’échec au rituximab et le succès de la splénectomie. Nous avons souhaité explorer les mécanismes qui sous-tendent ce processus de différenciation plasmocytaire paradoxale dans un modèle murin. Pour ce faire, nous avons utilisé le modèle de souris transgénique AID-Cre-ERT2 × Rosa26-loxP-EYFP qui permet de marquer irréversiblement par la protéine EYFP les cellules B lors de leur passage dans un centre germinatif au cours d’une réponse immune après injection de tamoxifène, puis de les suivre in vivo. Les plasmocytes EYFP ont été générés suite à 2 immunisations avec des globules rouges de mouton. Grâce à ce modèle, nous avons pu identifier les PC avec les seuls marqueurs EYFP + B220−, sans nécessité des autres marqueurs tels que le CD138 dont l’expression est hétérogène au niveau de la rate. Résultats Dans un premier temps, nous avons réalisé une analyse transcriptomique des PC EYFP+ de la rate dits « matures » car analysés plusieurs mois après immunisation. Nous les avons comparés aux PC EYFP+ nouvellement générés de la rate, analysés 6 jours après une 3 e immunisation. Parmi les 224 gènes surexprimés (fold > 4, p < 0,05) par les PC matures, nous avons identifié des facteurs anti-apoptotiques (Tnfaip3, Bcl2), des facteurs de transcription (Nfkb2, Runx2, Tox2), des récepteurs membranaires (Tnfrsf17, IcosL) et de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme cellulaire (Mt2, Anxa2, Cox15, Atp1b1). Nous avons ensuite analysé le programme des PC EYFP+ par RT-PCR multiplex sur cellules uniques. À partir des données de notre transcriptome, et complétées avec les données de la littérature, nous avons sélectionné des gènes permettant d’établir les signatures plasmablastiques (Chek1, Bcl2l11, CXCR3, Mki67, Bub1, Aurka, Ccnd2 et Rrm2b) et plasmocytaires (Tnfaip3, Bcl2, Runx2, Nfkb2, Tox2, Mt2, Tesc, PerP, Tnfrsf17, Tmem176b, Fos et Klf6). Nous avons comparé le programme des PC EYFP+ de la rate de souris traitées par anti-CD20 à celui des plasmablastes EYFP+ (analysés 3 jours après une 3 e immunisation), des PC EYFP+ de rates contrôles générés de la même façon et analysés au même temps que les PC EYFP+ des souris traitées par anti-CD20 et des PC EYFP+ de la moelle osseuse. Les souris traitées par anti-CD20 (3 injections) avaient un taux résiduel de cellules B dans la rate de l’ordre de 2 % au nadir de la déplétion B, soit à j50 de la première injection d’anti-CD20. Par cette analyse, nous avons pu établir des différences claires entre le programme des PC anti-CD20 et celui des PC de la rate des souris contrôles. Les PC contrôles de la rate présentent un profil intermédiaire, n’exprimant quasiment plus de gènes de prolifération mais un petit nombre de gènes de plasmocytes de longue vie par cellule individuelle ; les PC de la rate des souris traitées par anti-CD20 composent par contre une population homogène exprimant de nombreux gènes de PC, se rapprochant du programme des PLDV de la moelle osseuse. Non seulement le nombre de PC EYFP+ ne diminue pas de façon significative dans la rate avec le traitement anti-CD20, mais surtout le programme diffère clairement entre les 2 populations. Ces résultats signifient que le traitement anti-CD20 induit un processus de maturation plasmocytaire dans la rate et non une sélection de PLDV préexistants. Conclusion En conclusion, nos données suggèrent que la différenciation paradoxale plasmocytaire avec le traitement anti-CD20 est un mécanisme général, que ce soit chez l’homme ou chez la souris. Comprendre les mécanismes qui sous-tendent ce processus est donc un enjeu capital pour interférer sur la différenciation plasmocytaire et tenter d’obtenir de meilleures réponses cliniques avec le traitement anti-CD20 au cours des maladies auto-immunes chez l’homme. [ABSTRACT FROM AUTHOR]

Introduction Nous avons récemment mis en évidence que l’échec du rituximab dans le PTI était possiblement lié à l’émergence de plasmocytes à longue durée de vie (PLDV) spléniques autoréactifs (Mahévas, JCI 2013). De façon surprenante, les plasmocytes issus de rate de donneurs d’organes ou de patients non traité par le rituximab présentaient un programme transcriptionnel à plus courte durée de vie. Ceci suggérait que la déplétion induite par le rituximab favorisait la différentiation et/ou l’établissement des PLDV. Il restait néanmoins possible que cette observation soit due aux modifications du microenvironnement splénique créées par l’activation du système immunitaire observée dans le PTI. Pour répondre à cette question, nous avons choisi d’étudier le programme transcriptionnel des plasmocytes spléniques de patients atteints d’anémie hémolytique auto-immune (AHAI) à auto-anticorps chauds traités ou non par rituximab. Patients et méthodes Nous avons analysé à l’échelle unicellulaire les plasmocytes spléniques issus de la rate de patients atteints d’AHAI à auto-anticorps chauds traités ( n = 3) ou non par rituximab ( n = 3). Nous avons comparé les signatures génétiques de ces plasmocytes à ceux issus de rates de patients atteints de PTI traités ( n = 3) ou non par rituximab ( n = 3), de donneurs d’organes ( n = 3) et de plasmocytes de la moelle osseuse de donneurs d’organes ( n = 3). Nous avons utilisé une technique de single-cell PCR (Fluidigm, Biomark), permettant de discriminer le profil transcriptionnel de prolifération des plasmablastes du profil des plasmocytes à longue durée de vie. Résultats Les plasmocytes spléniques issus de rates de patients atteints d’AHAI à auto-anticorps chauds (traités [ n = 3] ou non par le rituximab [ n = 3]) sécrètent in vitro des IgG anti-globules rouges, expliquant pour une part l’échec des traitements. Nous avons mis en évidence que les plasmocytes spléniques des patients atteints d’AHAI traités par Rituximab expriment un programme transcriptionnel de plasmocytes à longue durée de vie (PLDV) et forment une population homogène. À l’inverse, les plasmocytes matures des donneurs sains et des patients AHAI non traités par rituximab présentent un profil intermédiaire, entre les plasmocytes à longue durée de vie et les plasmablastes à courte durée de vie. De façon intéressante, les PLDV des patients AHAI ségréguent avec les plasmocytes des patients PTI traités par le rituximab. Ils différent néanmoins par le niveau d’expression de certains gènes (TNAIP3, ATF3), ce qui est possiblement lié à l’imprégnation cortisonique dans l’AHAI. Il existe un gradient de maturation où les plasmocytes spléniques des patients traités par le rituximab (AHAI et PTI) se localisent entre les plasmablastes spléniques et les plasmocytes de la moelle osseuse. Les plasmocytes issus de rate de patients traités par rituximab constituent donc une population plasmocytaire splénique au programme unique. Conclusion Nos résultats confirment que la déplétion lymphocytaire induite par le rituximab crée au cours de l’AHAI les conditions favorables à la différentiation des plasmocytes en plasmocytes à longue durée de vie dans la rate, expliquant pour une part l’échec du traitement. Comprendre les mécanismes liés à cette différentiation pourrait permettre d’améliorer l’efficacité clinique [ABSTRACT FROM AUTHOR]