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P2X7, a ligand-gated ion channel activated by extracellular ATP, is a major feature of purinergic signaling. Its functions is yet to be elucidated, notably in the central nervous system homeostasis balance. Its neuropathological implications are numerous and highly related to inflammation and its propagation. We are currently lacking selective tools to decipher the fine neuropathological dynamic on this protein. The current work here presents the development and application of an innovative chemical approach base on affinity to covalently decorate this receptor with a biotin. The final reagent, called LNASAB, allows us to perform super-resolution in microglia in different pro-inflammatory conditions and explore the dynamics of nanodomain form by P2X7., Le récepteur ionotrope activé par l’ATP extracellulaire P2X7 est un acteur central de la signalisation purinergique. Il exerce un rôle encore mal compris, notamment dans le maintien de l’homéostasie du système nerveux central. Ses implications neuropathologiques sont nombreuses et liées à l’inflammation à et la propagation de cette dernière. Aucun outil d’étude robuste n’a montré une sélectivité suffisante pour étudier la fine dynamique pathophysiologique de cette protéine. Ces travaux de thèses proposent le développement et l’application d’une approche de marquage covalent d’affinité afin de greffer une molécule d’intérêt sur le récepteur endogène. Le réactif de marquage issu de ces travaux, appelé LNASAB, nous a permis d’explorer l’organisation nanométrique du récepteur P2X7 microgliale par microscopie super-résolutive, ainsi que la dynamique des nanodomaines qu’il compose en conditions pro-inflammatoires

In recent decades, the study of complex biological systems has been a growing field. Thus, biomolecules ligation tools with chemical reporters were set up in order to have a better and fine understanding of the living. Ligations are biocompatible chemical reactions that link two synthetic or biological entities one antother. These ligations are generally gathered into two categories, bioconjugation reactions, using chemical functions naturally present in the biomolecules, and bio-orthogonal reactions which does not interfere with these function, but require a prior engineering of the biological partner. However, it is necessary to distinguish a third category, the chemoselective conjugation reactions, which implement functions not naturally present on biomolecules. In this sense, they are therefore closer to bio-orthogonal reactions, but the functions or conditions involved are not sufficiently bioorthogonal or the reactions are not fast enough to be carried out in any biological systems. These ligations are, however, widely used for biomolecular constructions ranging from the small molecule (for example modified oligopeptides) to the biomacromolecule (protein modification) and are distinguished by their ease of implementation and purification of the conjugates, which is not always feasible with the arsenal of bio-orthogonal reactions that leads to the formation of multiple isomers. Thus, my PhD work focused on the discovery and / or the study of chemoselective ligations as well as their use in the preparation of fluorescent or fluorogenic probes. The study of the Kondrat'eva ligation previously developed within the laboratory, highlighted its fluorogenic behaviour, and was exploited for the fluorescent labelling of molecules through a single fluorescence-ligation step. Then, the development of a ligation using the tetrazine / pyrazolone system was developed in order to overcome the lack of selectivity of the reactions based on the tetrazine scaffold which often lead to the formation of bioconjugates as a mixture of isomers. This approach has been illustrated by the fluorescent labelling of a human protein. Finally, the development of a new access route to quinoxalinones allowed to study their photophysical properties and to highlight their fluorogenic properties which were leveraged in particular for the synthesi s of a bioprobe., Depuis quelques décennies, l’étude de systèmes biologiques complexes est un domaine en plein essor. Ainsi, des outils de ligation des biomolécules avec des reporters chimiques ont été mis en place afin d’avoir une compréhension toujours fine du vivant. Les ligations sont des réactions chimiques biocompatibles permettant de lier deux entités synthétiques ou biologiques entre elles. On regroupe généralement ces ligations en deux catégories, les réactions de bioconjuguaison, qui font intervenir des fonctions chimiques naturellement présentes dans les biomolécules, et les réactions bio-orthogonales qui n’interfèrent pas avec les fonctions chimiques présentes dans ces milieux, mais nécessitent en amont une modification des partenaires de réaction. Cependant, il convient de faire la distinction avec une troisième catégorie, les réactions de conjugaison chimiosélectives, qui mettent en oeuvre des fonctions non naturellement présentes sur les biomolécules. En ce sens, elles se rapprochent donc des réactions bio-orthogonales, mais les fonctions ou conditions mises en jeu ne sont pas suffisamment bio-orthogonales ou les réactions ne sont pas suffisamment rapides pour pouvoir être réalisées dans les systèmes biologiques. Ces ligations sont toutefois très utilisées pour de la construction biomoléculaire allant de la petite molécule (par exemple oligopeptide modifié) à la biomacromolécule (type protéine modifiée) et se distinguent par une facilité de mise en oeuvre et purification des conjugués, ce qui n’est pas toujours réa lisable avec l’arsenal des réactions bio-orthogonales qui conduisent à la formation de multiple isomères. Ainsi, mes travaux de thèse se sont orientés vers la découverte et/ou l’étude de ligations chimiosélectives ainsi qu’à leur utilisation dans la préparation de sondes fluorescentes voire fluorogéniques. L’étude de la ligation Kondrat’eva préalablement développée au sein du laboratoire, a permis de mettre en évidence son caractère fluorogénique, et a été exploitée pour le marquage fluorescent de molécules via une étape unique de ligation fluorogénique. Puis, le développement d’une ligation utilisant le système tétrazine/pyrazolone a été développée afin de pallier le manque de sélectivité des réactions basées sur le motif tétrazine proposées jusqu’alors, qui conduisent aux bioconjugués sous la forme d’un mélange de produits. Cette approche a été illustrée par le marquage fluorescent d’une protéine humaine. Enfin, le développement d’une nouvelle voie d’accès aux quinoxalinones a permis leur étude photophysique et la mise en évidence de propriétés fluorogéniques utilisées notamment pour la synthèse d’une biosonde.

The preparation of targeted imaging agents suitable for cancer diagnostic involves the coupling of an imaging probe to a vector, generally a protein, able to specifically target cancerous tissues. Unfortunately, this bioconjugation step is often problematic. Indeed, proteins present a large variety of reactive functions that can potentially interfere with the coupling reaction. The purpose of this work is the design of innovative selective bioconjugation strategies that can facilitate the synthesis of molecular imaging agents.Our research led to the development of a simple and efficient approach allowing the modification of a protein with a fluorophore by using a site-specific bioconjugation reaction. Thanks to this technique, it is possible to obtain near infrared fluorescent agents in a single step.We also focused our work on the design of bimodal nuclear/fluorescent imaging tracers based on protein vectors. These bimodal imaging agents show high potential for numerous medical applications. However, their synthesis requires the coupling of two distinct imaging molecules to the protein, which makes the bioconjugation step even more challenging. In this context, we developed different strategies suitable for the site-specific dual-modification of proteins. These approaches are based on a highly modular trifunctional platform, dichlorotetrazine. Several bimodal nuclear/optical imaging agents were obtained and shown convenient in vivo diagnostic properties.This thesis also presents the elaboration of a new PSMA-specific radiotracer able to detect prostate cancer. The promising results obtained during the preclinical evaluation of this compound labeled with copper-64, make it an interesting candidate for the diagnosis of prostate cancer by positron emission tomography in human., L’élaboration d’agents de ciblage pour le diagnostic du cancer repose sur le couplage d’une molécule imageante à un vecteur, souvent une protéine, capable de cibler spécifiquement les tissus cancéreux. Cette étape de bioconjugaison peut se révéler complexe et très délicate à contrôler. En effet, les protéines vectrices sont constituées d’un grand nombre de fonctions chimiques, potentiellement réactives, qui peuvent interférer lors du greffage. Ces travaux de thèse ont pour finalité l’élaboration de stratégies de bioconjugaison sélective innovantes afin de faciliter la préparation des agents d’imagerie moléculaire.Nos efforts ont notamment abouti à la mise au point d’une approche simple et efficace permettant la modification d’une protéine par un fluorophore, au moyen d’une réaction de bioconjugaison site-spécifique. Grâce à cette technique, il est possible d’obtenir des agents fluorescents proche infrarouge en une seule étape.Nous nous sommes également intéressés à la conception d’agents imageants bimodaux nucléaires/fluorescents vectorisés. Cette génération de traceurs possède un fort potentiel dans le domaine de l’imagerie médicale. Cependant, leur synthèse requiert le couplage de deux molécules imageantes à la protéine, ce qui rend l’étape de bioconjugaison particulièrement critique. Nous avons répondu à cette problématique par la mise au point de stratégies permettant la double modification site-spécifique de protéines. Les approches développées sont basées sur l’utilisation d’une plateforme trifonctionnelle, la dichlorotétrazine, et sont ainsi très versatiles. Nous avons pu obtenir et tester en préclinique, plusieurs agents imageants bimodaux nucléaires/optiques.Ce mémoire présente également l’élaboration d’un radiotraceur capable de détecter le cancer de la prostate par ciblage spécifique de la PSMA. Les résultats prometteurs obtenus lors de l’évaluation préclinique de ce composé, métallé au cuivre-64, en font un candidat intéressant pour le diagnostic du cancer de la prostate par tomographie par émission de positons chez l’homme.

Interactions of polymers with the biological environments Polymers have gradually entered into the composition of biomaterials or drug formulations with respect to their biocompatible and biodegradable features, but also to their structural versatility. A new era in the biomedical fields has nevertheless begun, where polymers are no longer passive components but actors that interact directly with the biological environments. This article covers the cases of polymers that are intrinsically bioactive, but also those coupled to ligands or biomolecules, or responding to endo-or exogenous stimuli. Then a new approach to the synthesis of polymers with high added value by biotechnology is mentioned., Les polymères sont progressivement entrés dans la composition des biomatériaux ou des formulations médicamenteuses au regard de leurs caractères biocompatibles, biodégradables mais également de leur polyvalence structurelle. Une nouvelle ère dans les domaines biomédicaux est néanmoins largement amorcée, où les polymères ne sont plus des composants passifs, mais de véritables acteurs pour interagir directement avec les interlocuteurs des milieux biologiques. Cet article aborde les cas des polymères intrinsèquement bioactifs, mais aussi des polymères couplés à des ligands ou des biomolécules, ou encore de ceux répondant à des stimuli endo-ou exogènes. Puis une nouvelle approche de synthèse de polymères à haute valeur ajoutée par voie biotechnologique est mentionnée.

The aim of this study was the design of nanoparticles for three different biologicalapplications: magnetic nanoparticles cluster for magnetic extraction of biological materials,multimodal contrast agents (MRI and near infrared fluorescence imaging) for atherosclerosisdiagnosis, and fluorescent silica nanoparticles with two different dyes for in vitro and in vivo tumorlabeling. One part of the project dealt with the developement of a new grafting method ofpoly(ethylene oxide) macromolecules onto nanoparticle’s silica surfaces (PEGylation) in order toobtain a high grafting densities. The obtained results have shown that this PEGylation reduces the nonspecificprotein adsorption allowing a better extraction and sorting efficiency, and also permitsnanoparticles to escape the surveillance of the immune system for in vivo tumor labeling. Therefore,the biomolecular recognition of the nanoparticles has been optimized by controlling the number ofconjugated biomolecules and by studying this biomolecular recognition using biophysical methods(SPR, QCM-D). Finally, the different nano-objects were evaluated in the context of their respectiveapplication., Cette étude porte sur le développement de nanoparticules pour différentes applicationsbiologiques. Trois systèmes de nanoparticules ont été mis au point : des clusters de nanoparticulesmagnétiques pour l’extraction par magnétophorèse d’objets biologiques, des agents de contrastemultimodaux (IRM, fluorescence dans le proche infrarouge) pour le diagnostic de l’athérosclérose etdes nanoparticules de silice fluorescentes doublement marquées pour la détection de tumeurs in vivo.Au cours de cette étude, une stratégie de greffage de surface de silice par des macromolécules depoly(oxyde d’éthylène) (PEG) permettant d’atteindre de hautes densités de greffage. Cette PEGylationpermet, d’annuler les interactions non spécifiques dans le cadre de l’extraction magnétique rendantainsi ce système plus efficace, et de conférer aux nanoparticules des propriétés de furtivité vis-à-vis dusystème immunitaire dans le cadre du marquage de tumeurs. Le contrôle du nombre de biomoléculesgreffées régiosélectivement sur les nanoparticules (Annexine A5, ou fragments d’anticorps) ainsi quel’étude des interactions biomoléculaires par des techniques de biophysique (SPR, QCM-D) ont permisd’optimiser la propriété de reconnaissance des nano-objets pour leurs cible respective. Enfin, les nanoobjetsont été évalués dans le cadre de leur application.

The goal of green chemistry is to promote the research and the development of innovative chemical technologies in order to reduce the contamination of environment. Significant progress in this field has been made by using relatively non toxic transition metal and chiral ligands to catalyze enantioselective transformations. In this work, we have reported the combination of hydrogen peroxide as environmentally benign and atom-economically oxidant with water-soluble metalloporphyrins (Fe, Mn) for the asymmetric oxidation of sulfides, alkenes and C-H bonds. These catalytic systems widely studied as models of cytochrome P450, gave high enantiomeric excesses (ee up to 82%). In the other hand, we have developed carbene transfer reactions in water as « green » solvent catalyzed by water soluble iron porphyrins. This metal (Fe) has been found to overcome many limitations related to the use of other metals (Ru, Rh) in aqueous media. As an application of N-H insertion reaction, the regioselective bio-conjugation of insulin has been demonstrated with high conversion (90%).; La mission centrale de la chimie verte est d'inventer de nouveaux procédés non polluants pour remplacer les technologies peu favorables à l'environnement. L'emploi de métaux de transition relativement non toxiques en quantités catalytiques associés à des ligands chiraux a permis de réaliser une avancée dans le domaine de la synthèse asymétrique. Dans ce travail, nous avons mis en évidence la possibilité de l'utilisation du peroxyde d'hydrogène, un oxydant vert et économique, en association avec des métalloporphyrines hydrosolubles (Fe, Mn) pour effectuer des réactions d'oxydation asymétrique (sulfoxydation, époxydation et hydroxylation). Ces systèmes représentatifs d'un modèle de l'effet « shunt » des enzymes monooxygénases dérivées de la famille cytochrome P450 sont très efficaces. Ils conduisent dans certains cas à des excès énantiomériques élevés (82%). D'autre part, nous avons développé les réactions de transfert de carbènes dans l'eau (insertion N-H et cyclopropanation asymétrique) catalysées par des porphyrines de fer. L'utilisation du fer comme métal a permis de surmonter plusieurs limites souvent rencontrées avec d'autres métaux (Ru, Rh) lors des réactions de transfert de carbènes dans l'eau. Comme application de la réaction d'insertion N-H, nous avons réalisé la bio-conjugaison régiosélective de l'insuline avec une conversion très élevée (90%).

The goal of green chemistry is to promote the research and the development of innovative chemical technologies in order to reduce the contamination of environment. Significant progress in this field has been made by using relatively non toxic transition metal and chiral ligands to catalyze enantioselective transformations. In this work, we have reported the combination of hydrogen peroxide as environmentally benign and atom-economically oxidant with water-soluble metalloporphyrins (Fe, Mn) for the asymmetric oxidation of sulfides, alkenes and C-H bonds. These catalytic systems widely studied as models of cytochrome P450, gave high enantiomeric excesses (ee up to 82%). In the other hand, we have developed carbene transfer reactions in water as « green » solvent catalyzed by water soluble iron porphyrins. This metal (Fe) has been found to overcome many limitations related to the use of other metals (Ru, Rh) in aqueous media. As an application of N-H insertion reaction, the regioselective bio-conjugation of insulin has been demonstrated with high conversion (90%)., La mission centrale de la chimie verte est d'inventer de nouveaux procédés non polluants pour remplacer les technologies peu favorables à l'environnement. L'emploi de métaux de transition relativement non toxiques en quantités catalytiques associés à des ligands chiraux a permis de réaliser une avancée dans le domaine de la synthèse asymétrique. Dans ce travail, nous avons mis en évidence la possibilité de l'utilisation du peroxyde d'hydrogène, un oxydant vert et économique, en association avec des métalloporphyrines hydrosolubles (Fe, Mn) pour effectuer des réactions d'oxydation asymétrique (sulfoxydation, époxydation et hydroxylation). Ces systèmes représentatifs d'un modèle de l'effet « shunt » des enzymes monooxygénases dérivées de la famille cytochrome P450 sont très efficaces. Ils conduisent dans certains cas à des excès énantiomériques élevés (82%). D'autre part, nous avons développé les réactions de transfert de carbènes dans l'eau (insertion N-H et cyclopropanation asymétrique) catalysées par des porphyrines de fer. L'utilisation du fer comme métal a permis de surmonter plusieurs limites souvent rencontrées avec d'autres métaux (Ru, Rh) lors des réactions de transfert de carbènes dans l'eau. Comme application de la réaction d'insertion N-H, nous avons réalisé la bio-conjugaison régiosélective de l'insuline avec une conversion très élevée (90%).

Three polymer architectures containing blocked isocyanate functionalities were developed during this work, based on 2-isocyanatoethyl methacrylate (IEM). A -NH-C(=O)-SO3- functionalized hydrogel was synthesized from IEM and potassium metabisulfite. This hydrogel features significant functionalization degree, acceptable storage under dry condition, as well as considerable swelling when immersed in water. Direct protection of the IEM monomer was made possible via an alternative blocking agent, yielding a hydrosoluble monomer that was polymerized in water under free-radical conditions. The reactivity of the obtained polymer towards primary amines in water was substantiated. Finally, IEM blocking using phenol or acetone oxime led to divinylbenzene-based microspheres containing reactive blocked isocyanates., L'utilisation du méthacrylate de 2-isocyanatoéthyle (IEM), dérivé commercial, a permis le développement de trois architectures polymères fonctionnalisées par un isocyanate bloqué. Un hydrogel fonctionnalisé par des groupements -NH-C(=O)-SO3- a été synthétisé à partir de l'IEM et du métabisulfite de potassium. Cet hydrogel présente un dégré de fonctionnalisation important, un bon comportement au stockage sous voie sèche ainsi qu'une très bonne capacité au gonflement dans l'eau. Le recours à un agent de blocage alternatif a permis la protection de l'IEM et l'obtention d'un monomère hydrosoluble qui a été polymérisé par voie radicalaire dans l'eau. La réactivité de ce polymère vis-à-vis d'amines aliphatiques dans l'eau a été démontrée. Enfin, le blocage de l'IEM par le phénol ou l'acétone oxime a permis l'obtention de microsphères à base de divinylbenzène, fonctionnalisées par un isocyanate bloqué.