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Antibiotics, and particularly ß- lactams, have long been considered the ultimate weapon for the treatment of bacterial infections, because of their effectiveness, good tolerance and low cost. However, bacteria have developed mechanisms of resistance, including against β- lactams with the broadest spectrum of activity, carbapenems. The latter are considered as last resort antibiotics for the treatment of severe infections due to Gram negative bacilli in hospital. This emerging resistance to carbapenems in Enterobacteriaceae is mainly due to the expression of enzymes called carbapenemases capable of inactivating carbapenems. The worldwide exponential spread of these carbapenemase-producing enterobacteria (CPE) represents a major public health issue. Currently, the most common carbapenemases in the world are KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase) and OXA-48 (Oxacillinase). The first KPC was identified in 1996 in the United States, NDM-1 in 2009 in Sweden in a patient from India and OXA-48 in 2003 in Turkey. In France, OXA-48- type are the most abundant carbapenemases with nearly 70% of the EPCs. Thus, the repercussion of their dissemination and the development of new inhibitors capable of inactivating carbapenemases is becoming more and more urgent.The aims of this thesis were to better understand the mode of action of the 3 main carbapenemases from a molecular and biochemical point of view, in order to identify the structural elements necessary for their functioning, but also to lay the basis for the development of "pan-inhibitors" and noveldiagnostic tools. For this purpose, the biochemical characterization of carbapenemases of the KPC, NDM and OXA-48 type, their natural variants and mutants generated in vitro has been undertaken.We could highlight the involvement of specific residues and structural elements necessary for the hydrolysis of carbapenems. The crystallographic and NMR study as well as the in silico (modeling) studies of these enzymes and their respective mutants, allowed us to better understand the enzyme-substrate interaction mode. We could thus understand the basis of the impressive capacity of these carbapenemases to adapt and therefore to evolve according to the selection pressures exerted.In collaboration with several chemists we participated in the development of different series of "pan-inhibitors" that were able to inhibit the 3 classes of carbapenemases. Thus we could show the inhibitory properties of some compounds of the family of flavonoids including myricetin, the most active molecule. We have also been able to identify a series of compounds, imidazolines, possessing a pan- inhibitory effect with sub-micromolar IC50 values and therefore compatible with in vivo use. Finally, we participated in the development (in collaboration with the CEA) of a rapid diagnostic tool based on theimmunochromatographic, allowing the detection of EPCs in less than 15 minutes.; Les antibiotiques, et plus particulièrement les β-lactamines, furent pendant longtemps considérés comme l’arme absolue pour le traitement des infections bactériennes, du fait de leur efficacité, leur bonne tolérance et de leur faible coût. Cependant, les bactéries ont développé des mécanismes de résistance, y compris vis-à-vis des β-lactamines possédant le spectre d’activité le plus large, les carbapénèmes. Ces derniers sont considérés comme les antibiotiques de derniers recours pour le traitement des infections sévères à bacilles à Gram négatif en milieu hospitalier. Chez les entérobactéries, cette résistance émergente aux carbapénèmes est principalement due à l’expression d’enzymes appelées les carbapénèmases capables d’inactiver les carbapénèmes. L’émergence exponentielle à l’échelle mondiale de ces entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) constitue un problème majeur de santé publique. Actuellement, les carbapénémases les plus répandues dans le monde sont les KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase), NDM-1 (New Delhi metallo- β- lactamase) et OXA-48 (Oxacillinase). La première KPC a été identifiée en 1996 aux Etats- Unis, NDM-1 en 2009 en Suède chez une patiente en provenance d’Inde et OXA-48 en 2003 en Turquie. En France, les carbapénèmases de type OXA-48 sont largement majoritaires et représentent près de 70% des EPC. Ainsi, le retentissement de leur dissémination et le besoin de développer de nouveaux inhibiteurs capables d’inactiver les carbapénèmases se fait de plus en plus pressante.Cette thèse a pour objectif de mieux comprendre le mode d’ action de ces 3 carbapénèmases d’un point de vue moléculaire et biochimique, afin d’ identifier les éléments structuraux nécessaires à leur fonctionnement, mais aussi de poser les bases du développement de « pan-inhibiteurs » et de nouveaux outils de diagnostics. Pour cela, la caractérisation biochimique des carbapénèmases de type KPC, NDM et OXA-48, de leurs variants naturels et de mutants générés in vitro a été entreprise. Il a pu être mis en exergue l’implication de résidus spécifiques et d’éléments structuraux nécessaires à l’ hydrolyse des carbapénèmes. L ’ étude cristallographique et RMN ainsi que l’étude in silico (modélisation) de ces enzymes et de leurs mutants respectifs, nous a permis de mieux comprendre le mode d’ interaction enzyme- substrat. Nous avons ainsi pu comprendre les bases de la capacité impressionnante de ces carbapénèmases à s’adapter et à évoluer en fonction des pressions de sélections exercées.En collaborations avec différentes équipes de chimistes nous avons développés différentes séries de molécules « pan-inhibiteurs » capables d’inhiber les 3 classes de carbapénèmases. Ainsi nous avons montré un effet inhibiteur de certains composés de la famille des flavonoïdes dont la myrécétine, molécule la plus active. Nous avons également identifié une série de composés, les imidazolines, possédant un effet pan-inhibiteur avec des valeurs de CI50 sub-micromolaires et donc compatible avec une utilisation in vivo.Enfin, nous avons participé au développement (en collaboration avec le CEA) d’ un outil de diagnostic rapide basé sur l’immunochromatographie, permettant détection des EPC en moins de 15 minutes.

Worldwide spread of antimicrobial resistance among community-acquired enterobacterales, especially ESBL, leads to a worrying consumption of last resort antibiotics like carbapenem. Derivative of ticarcillin, temocillin may be an attractive carbapenem-sparing agent including against some carbapenemase-producing enterobacterales (CPE). Nevertheless, there is still uncertainty regarding clinical breakpoints with 3 different values depending on countries (8 mg/L, 16 mg/L, 32 mg/L), moreover international consensus about this issue is awaited. In this context, three original studies were conducted along with a literature review. First, in vitro susceptibility to temocillin of 762 enterobacterales from community-acquired urinary tract infection was studied. In this area of low prevalence of ESBL and no CPE, the three routine susceptibility methods (disk diffusion, automate, Etest) were very accurate, epidemiological cut-off was set to 8 mg/L. Then, temocillin efficacy against enterobacterales producing or not producing ß-lactamase (ESBL or CPE) was assessed by two complementary murine models. We demonstrated that temocillin exposure reproducing 2 g q12h regimen showed efficacy against strains with temocillin MIC of 8 mg/L. This regimen exhibited a lower, even though significant, efficacy against strain with temocillin MIC of 16 mg/L. On the over hand, it was not observed significant efficacy against strain with temocillin MIC of 32 mg/L whatever the regimen used (2 g q12h or q8h). All together this results and the literature review support a clinical breakpoints of 8 mg/L for2 g q12h regimen, and 16 mg/L for 2 g q8h regimen. This last proposition correspond to the new susceptibility category : “Intermediate – Susceptible, increase exposure” from the last EUCAST recommendations.; Dans le monde entier l’antibiorésistance des entérobactérales communautaires, notamment par production de ß-lactamase à spectre étendu (E-BLSE), conduit à une consommation préoccupante d’antibiotique de dernier recours tels les carbapénèmes. Dérivé de la ticarcilline la témocilline pourrait représentée une alternative y compris sur certaines entérobactérales productrices de carbapénèmase (EPC). Néanmoins, il existe une incertitude concernant les concentrations critiques distinguant les entérobactérales sensibles des résistantes avec trois valeurs selon les pays utilisateurs de témocilline (8 mg/L, 16 mg/L ou 32 mg/L) tandis qu’une harmonisation internationale reste en attente. En ce contexte trois travaux originaux ont été poursuivi ainsi qu’une revue de la littérature. Il fut d’abord étudié in vitro la sensibilité à la témocilline de 762 entérobactérales responsables d’infection urinaire communautaire. Dans un contexte de prévalence faible des E-BLSE (5%) et nulle des EPC, les trois méthodes de routine (disque, automate, Etest) se sont révélées très fiables, la borne épidémiologique pour la témocilline s’établissant à 8 mg/L. Ensuite, l’efficacité de la témocilline vis-à-vis d’entérobactérales productrices ou non de ßlactamases (E-BLSE ou EPC) a été évaluée dans deux modèles murins complémentaires. Il a été montré l’efficacité de la témocilline à un schéma reproduisant la posologie humaine de 2 g toutes 12 h vis-à-vis d’entérobactérales pour lesquels la CMI de la témocilline était de 8 mg/L. L’efficacité de ce schéma posologique, bien que significative, était moindre vis-à-vis des isolats pour lesquels la CMI de la témocilline était de 16 mg/L. Par contre, il ne fut pas observé d’efficacité significative de la témocilline vis-à-vis des isolats avec une CMI à 32 mg/L quelques soit le schéma posologique (2 g toutes les 8 ou 12 h). L’ensemble de ces résultats, ainsi qu’une revue exhaustive des données de la littérature, conduisent à proposer une concentration critique de 8 mg/L pour le schéma posologique de 2 g toutes les 12 h, et de 16 mg/L pour celui de 2 g toutes les 8h. Cette dernière proposition correspondrait au « sensible à forte exposition », nouvelle définition de la catégorisation « intermédiaire » selon les dernières recommandations de l’EUCAST.

National audience; INTRODUCTION/OBJECTIF DU TRAVAILUn nombre de 65 cas cliniques à Pseudomonas aeruginosa producteurs de carbapènémases de type VIM-2 (pyoVIM2) ont été notifiées dans notre établissement entre 2011 et 2018, et ce, malgré les précautions prises (dépistage des patients, isolement contact et procédure spécifique d’entretien des locaux). Cela nous a amené à évaluer l’activité bactéricide des détergents-désinfectants (DD) utilisés dans notre établissement sur des souches Pseudomonas de notre écologie hospitalière.MATÉRIEL & MÉTHODESLa détermination de l’activité bactéricide de sept DD de surfaces a été effectuée sur 12 souches de Pseudomonas :- deux souches de référence (PAO1 et ATCC15442)- trois souches de pyoVIM2 cliniques ou environnementales en 2018- Six souches de Pseudomonas autre que aeruginosa et productrices de VIM-2 (putida, oleovorans, nitroreducens, monteilii, pleicoglossicida)- Deux transconjugants (TC) obtenus par conjugaison, en utilisant une souche donneuse de plasmide VIM-2 et la souche receveuse PAO1. - L’activité bactéricide in vitro a été évaluée selon le protocole de filtration sur membrane en conditions de propreté (NF EN 13727 + A2). Par ailleurs, 5 souches parmi elles ont été séquencées en génome entier afin d’étudier le contenu en gènes de résistance aux biocides (antibiotiques et ammonium quaternaire).RÉSULTATSSix DD sur sept présentent une activité bactéricide aux dilutions d’usage préconisées par le fabricant sur ces souches. Un seul DD ayant la particularité de ne contenir qu’un seul ammonium quaternaire ne retrouve son activité bactéricide qu’à double dose sur les souches pyoVIM2 (souches cliniques, environnementales et TC). Après analyse des génomes, il a été mis en évidence la co-localisation plasmidique de gènes de résistance à de nombreuses classes antibiotiques (béta-lactamines incluant les carbapénèmes, les aminosides et les fluoroquinolones) ainsi que du gène qacEdelta connu pour conférer la résistance aux ammoniums quaternaires.CONCLUSIONL’utilisation de ce protocole a permis de révéler une sensibilité diminuée à un DD largement utilisé pour l’entretien des locaux dans les établissements de santé en France. Ce constat nous a fait préconiser l’utilisation de ce DD à double dose pour l’entretien des surfaces dans les services où circulait le pyoVIM-2. L’acquisition de cette résistance semble liée à celle du plasmide VIM-2. Nous allons poursuivre la compréhension du mécanisme de la résistance aux biocides et étendre l’étude de sensibilité à d’autres bactéries multi-résistantes aux antibiotiques.

Multidrug resistant bacteria and in particular carbapenemase-producing Enterobacteriaceae remain a major health public challenge. Some successful clones are emerging globally, due to their high transmissibility and their ability to colonize and persist in patients over time. Genomic analyses revealed that the dissemination of KPC carbapenemase is closely related to the spread of Klebsiella pneumoniae of the sequence-type (ST) 258 and to few successful plasmids linked to IncFIIk family. However, the reasons of the association between K. pneumoniae ST258, IncFIIk plasmids and KPC that led to the rapid spread of this clone are currently unknown.Furthermore, there is no correlation between expression level of a carbapenemase-encoding gene, in vitro susceptibility to carbapenems and efficiency of a carbapenem-based treatment. Most of the time, KPC-producing K. pneumoniae exhibit a heteroresistant phenotype with carbapenems, but its clinical impact remains unknown. The mechanisms underlying the regulation of carbapenemases expression remain to be explored.The objectives of the thesis are to obtain deeper insights into genomic plasticity of carbapenemase–producing clones, and into the expression of their β-lactamases.The first part of this work was dedicated to the in vivo evolution of a single strain of KPC-producing K. pneumoniae ST258 that colonized a patient for almost 5 years. Genomic comparison of 17 isolates revealed a remarkable diversification with occurrence of several mutations with impact on bacterial virulence and susceptibility to antibiotics.Several studies extensively described the genetic structures of blaKPC-carrying plasmids, but information regarding gene expression at the whole plasmid level are lacking. Accordingly, we performed RNA-seq on Escherichia coli TOP10 transformed with an IncFIIk-IncFI blaKPC-2-carrying plasmid, with or without imipenem exposure. In both conditions, plasmid-encoded genes related to antimicrobial resistance and involved in plasmid replication were the most expressed. Imipenem exposure led to a more general response with overexpression of E. coli numerous chromosome-encoded genes involved in oxidative stress response. In addition, analysis of blaKPC-2 gene expression in several species using 5’RACE revealed the presence of several promoters whose strength depends on the bacterial genetic background. This could promote higher expression of blaKPC-2 gene and explain the association of some isoforms of Tn4401 in different species. The tools developed in the frame of this work were also applied to study a single Enterobacter kobei ST125 clone whose natural cephalosporinase (ACT-28) has increased hydrolytic activity towards imipenem. Finally, genomic analysis of the first ESBL-producing Shewanella sp. was performed. It revealed the presence of blaCTX-M-15 and blaSHV-2 genes carried on an IncA/C plasmid and a new chromosomally-encoded oxacillinase variant of OXA-48 with carbapenemase activity, called OXA-535. OXA-535 was found to be closely related to OXA-436, another carbapenemase which has recently spread in Enterobacteriaceae. Analysis of the genetic environment of both blaOXA-48-like genes confirmed the role of Shewanella spp. as progenitors of class D carbapenemases.Overall, this work contributes to a better comprehension of the diffusion of multi-drug resistant clones and of the mechanisms implicated in β-lactamase expression.; Le combat contre les infections bactériennes reste un enjeu majeur de santé publique notamment avec la dissémination des Entérobactéries productrices de carbapénèmases, capables d’hydrolyser l’ensemble des β-lactamines. On assiste à l’émergence de certains clones épidémiques, se distinguant par leur distribution mondiale, leur forte transmissibilité et leur capacité à persister chez les patients. L’exemple le plus parlant est le cas du clone de Klebsiella pneumoniae appartenant au « sequence type » (ST) 258 et responsable de la diffusion mondiale de la carbapénèmase KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) portée majoritairement par des plasmides de la famille InFIIk. Les raisons du succès de ce clone et de l’association KPC/IncFIIk/ST258 ne sont pas encore totalement élucidées. Par ailleurs, il n’existe pas de corrélation entre le niveau d’expression d’une carbapénèmase, la sensibilité in vitro de la souche vis à vis des carbapénèmes et l’efficacité clinique d’un traitement par ces molécules. Les phénomènes d’héterorésistance aux carbapénèmes sont fréquents chez les souches produisant KPC, mais l’impact clinique est inconnu. Les mécanismes de régulation de l’expression des carbapénèmases ne sont pas élucidés.Les objectifs de cette thèse résident dans l’analyse des facteurs génétiques associés à la diffusion et la persistance de clones multi-résistants ainsi que l’analyse de l’expression des β-lactamases associées.La première partie de ce travail porte sur l’analyse de l’évolution in vivo d’une souche de K. pneumoniae ST258 produisant KPC ayant persisté chez un patient pendant près de 5 ans. L’analyse comparative des génomes provenant de 17 isolats a permis de mettre en évidence une diversification génétique importante ainsi que la sélection de mutations modifiant la virulence de la souche et sa sensibilité aux antibiotiques. Afin de caractériser les raisons du succès de certains plasmides portant KPC, une analyse transcriptomique d’une souche de Escherichia coli TOP10 transformée par un plasmide multi-réplicon IncFIIk-IncFIB exprimant KPC-2, a été réalisée en présence ou non d’imipénème. Les gènes les plus exprimés dans ces conditions sont les gènes de résistance aux antibiotiques et certains gènes essentiels à la réplication du plasmide. La présence d’imipénème affecte peu la transcription des gènes plasmidiques mais induit un stress oxydatif important dans l’ensemble de la souche.Par ailleurs, l’analyse de l’expression du gène blaKPC-2 dans différentes espèces par 5’-RACE a permis de révéler que ce gène de résistance est sous la dépendance de plusieurs promoteurs, dont la force diffère selon le fond génétique. Cette caractéristique pourrait expliquer le succès de certains isoformes du transposon Tn4401 permettant une meilleure expression du gène blaKPC-2, dans certaines espèces.Les outils développés dans cette thèse ont également été appliqués à l’analyse d’un clone d’Enterobacter kobei ST125 dont la céphalosporinase naturelle ACT-28 possède une activité d’hydrolyse accrue vis à vis de l’imipénème. Enfin, l’analyse du génome de la première souche Shewanella sp. produisant une BLSE de type CTX-M-15 a permis de révéler la présence d’un nouveau variant oxacillinase chromosomique avec activité carbapénèmase, appelé OXA-535. OXA-535 est proche d’OXA-436, un autre variant carbapénèmase porté par un plasmide ayant déjà disséminé chez les Entérobactéries. L’analyse de l’environnement génétique des gènes blaOXA-535 et blaOXA-436 confirme le rôle du genre Shewanella comme progéniteur des carbapénèmases de classe D.Ce travail contribue à une meilleure compréhension de la diffusion de certains clones multi-résistants et des mécanismes contrôlant l’expression des gènes de résistance aux β-lactamines.

Multidrug resistant bacteria and in particular carbapenemase-producing Enterobacteriaceae remain a major health public challenge. Some successful clones are emerging globally, due to their high transmissibility and their ability to colonize and persist in patients over time. Genomic analyses revealed that the dissemination of KPC carbapenemase is closely related to the spread of Klebsiella pneumoniae of the sequence-type (ST) 258 and to few successful plasmids linked to IncFIIk family. However, the reasons of the association between K. pneumoniae ST258, IncFIIk plasmids and KPC that led to the rapid spread of this clone are currently unknown.Furthermore, there is no correlation between expression level of a carbapenemase-encoding gene, in vitro susceptibility to carbapenems and efficiency of a carbapenem-based treatment. Most of the time, KPC-producing K. pneumoniae exhibit a heteroresistant phenotype with carbapenems, but its clinical impact remains unknown. The mechanisms underlying the regulation of carbapenemases expression remain to be explored.The objectives of the thesis are to obtain deeper insights into genomic plasticity of carbapenemase–producing clones, and into the expression of their β-lactamases.The first part of this work was dedicated to the in vivo evolution of a single strain of KPC-producing K. pneumoniae ST258 that colonized a patient for almost 5 years. Genomic comparison of 17 isolates revealed a remarkable diversification with occurrence of several mutations with impact on bacterial virulence and susceptibility to antibiotics.Several studies extensively described the genetic structures of blaKPC-carrying plasmids, but information regarding gene expression at the whole plasmid level are lacking. Accordingly, we performed RNA-seq on Escherichia coli TOP10 transformed with an IncFIIk-IncFI blaKPC-2-carrying plasmid, with or without imipenem exposure. In both conditions, plasmid-encoded genes related to antimicrobial resistance and involved in plasmid replication were the most expressed. Imipenem exposure led to a more general response with overexpression of E. coli numerous chromosome-encoded genes involved in oxidative stress response. In addition, analysis of blaKPC-2 gene expression in several species using 5’RACE revealed the presence of several promoters whose strength depends on the bacterial genetic background. This could promote higher expression of blaKPC-2 gene and explain the association of some isoforms of Tn4401 in different species. The tools developed in the frame of this work were also applied to study a single Enterobacter kobei ST125 clone whose natural cephalosporinase (ACT-28) has increased hydrolytic activity towards imipenem. Finally, genomic analysis of the first ESBL-producing Shewanella sp. was performed. It revealed the presence of blaCTX-M-15 and blaSHV-2 genes carried on an IncA/C plasmid and a new chromosomally-encoded oxacillinase variant of OXA-48 with carbapenemase activity, called OXA-535. OXA-535 was found to be closely related to OXA-436, another carbapenemase which has recently spread in Enterobacteriaceae. Analysis of the genetic environment of both blaOXA-48-like genes confirmed the role of Shewanella spp. as progenitors of class D carbapenemases.Overall, this work contributes to a better comprehension of the diffusion of multi-drug resistant clones and of the mechanisms implicated in β-lactamase expression., Le combat contre les infections bactériennes reste un enjeu majeur de santé publique notamment avec la dissémination des Entérobactéries productrices de carbapénèmases, capables d’hydrolyser l’ensemble des β-lactamines. On assiste à l’émergence de certains clones épidémiques, se distinguant par leur distribution mondiale, leur forte transmissibilité et leur capacité à persister chez les patients. L’exemple le plus parlant est le cas du clone de Klebsiella pneumoniae appartenant au « sequence type » (ST) 258 et responsable de la diffusion mondiale de la carbapénèmase KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase) portée majoritairement par des plasmides de la famille InFIIk. Les raisons du succès de ce clone et de l’association KPC/IncFIIk/ST258 ne sont pas encore totalement élucidées. Par ailleurs, il n’existe pas de corrélation entre le niveau d’expression d’une carbapénèmase, la sensibilité in vitro de la souche vis à vis des carbapénèmes et l’efficacité clinique d’un traitement par ces molécules. Les phénomènes d’héterorésistance aux carbapénèmes sont fréquents chez les souches produisant KPC, mais l’impact clinique est inconnu. Les mécanismes de régulation de l’expression des carbapénèmases ne sont pas élucidés.Les objectifs de cette thèse résident dans l’analyse des facteurs génétiques associés à la diffusion et la persistance de clones multi-résistants ainsi que l’analyse de l’expression des β-lactamases associées.La première partie de ce travail porte sur l’analyse de l’évolution in vivo d’une souche de K. pneumoniae ST258 produisant KPC ayant persisté chez un patient pendant près de 5 ans. L’analyse comparative des génomes provenant de 17 isolats a permis de mettre en évidence une diversification génétique importante ainsi que la sélection de mutations modifiant la virulence de la souche et sa sensibilité aux antibiotiques. Afin de caractériser les raisons du succès de certains plasmides portant KPC, une analyse transcriptomique d’une souche de Escherichia coli TOP10 transformée par un plasmide multi-réplicon IncFIIk-IncFIB exprimant KPC-2, a été réalisée en présence ou non d’imipénème. Les gènes les plus exprimés dans ces conditions sont les gènes de résistance aux antibiotiques et certains gènes essentiels à la réplication du plasmide. La présence d’imipénème affecte peu la transcription des gènes plasmidiques mais induit un stress oxydatif important dans l’ensemble de la souche.Par ailleurs, l’analyse de l’expression du gène blaKPC-2 dans différentes espèces par 5’-RACE a permis de révéler que ce gène de résistance est sous la dépendance de plusieurs promoteurs, dont la force diffère selon le fond génétique. Cette caractéristique pourrait expliquer le succès de certains isoformes du transposon Tn4401 permettant une meilleure expression du gène blaKPC-2, dans certaines espèces.Les outils développés dans cette thèse ont également été appliqués à l’analyse d’un clone d’Enterobacter kobei ST125 dont la céphalosporinase naturelle ACT-28 possède une activité d’hydrolyse accrue vis à vis de l’imipénème. Enfin, l’analyse du génome de la première souche Shewanella sp. produisant une BLSE de type CTX-M-15 a permis de révéler la présence d’un nouveau variant oxacillinase chromosomique avec activité carbapénèmase, appelé OXA-535. OXA-535 est proche d’OXA-436, un autre variant carbapénèmase porté par un plasmide ayant déjà disséminé chez les Entérobactéries. L’analyse de l’environnement génétique des gènes blaOXA-535 et blaOXA-436 confirme le rôle du genre Shewanella comme progéniteur des carbapénèmases de classe D.Ce travail contribue à une meilleure compréhension de la diffusion de certains clones multi-résistants et des mécanismes contrôlant l’expression des gènes de résistance aux β-lactamines.

Acinetobacter spp are opportunistic bacteria widely involved in nosocomial infections. The aim of this work was to study the epidemiology and the ecology of these bacteria in Lebanon. First, we have analyzed 119 clinical strains of A.baumannii. 76.5% of them were resistant to carbapenems and the production of OXA-23 was the main mechanism. Multi-locus sequence typing revealed the predominance of international clone II. Pulsed field gel electrophoresis showed that 72.6% of strains belonging to ST2 were classified in the same cluster which appeared to be predominant in Beirut and Tripoli. On the other hands, Acinetobacter reservoirs were investigated on 2361 samples collected in Lebanon. A total number of 171 strains have been isolated in the environment, food, humans and animals. The majority of these strains was identified as non baumannii Acinetobacter and was susceptible to antibiotics. Besides, typing of A.baumannii revealed the presence of 14 STs including 10 new ones. Finally, we have described a novel species called “Acinetobacter lebanonensis” by conducting a taxonomic study on several strains isolated in Lebanon and other countries. Although the data may be limited, this work has shown the endemic situation of carbapenem resistant A.baumannii circulating in the Lebanese hospitals while the extra hospital ones were different. However, further studies are needed to elucidate the origin of these emerging multidrug resistant strains., Les Acinetobacter sont des bactéries opportunistes impliquées dans les infections nosocomiales.Le but de ce travail était d’étudier leur épidémiologie et écologie au Liban.Tout d’abord, nous avons analysé 119 souches d’A.baumannii isolées de plusieurs hôpitaux. 76.5 % étaient résistantes aux carbapénèmes et le gène OXA-23 était le plus fréquemment trouvé. Le typage par Multilocus sequence typing a montré que le clone international II était majoritairement détecté. L’électrophorèse en champ pulsé a révélé que 72.6% des souches appartenant au ST2 ont été classées dans un même cluster qui semble être prédominant à Beirut et Tripoli. Ensuite, les réservoirs extrahospitaliers ont été investigués sur 2361 prélèvements collectés au Liban. Au total, 171 souches ont été isolées dans l’environnement, les produits alimentaires ainsi que chez l’homme et les animaux. La majorité de ces souches, globalement sensibles aux antibiotiques, était des Acinetobacter non baumannii, Seuls 15 A.baumannii, de 14 STs différents dont 10 nouveaux ont été isolés. Enfin, nous avons conduit une étude taxonomique approfondie sur plusieurs souches d’Acinetobacter non identifiées au rang d’espèce et retrouvées dans notre étude. Nous avons ainsi caractérisé une nouvelle espèce, nommée « Acinetobacter lebanonensis ».Ce travail a montré que le Liban était un pays à forte endémie d’A.baumannii résistants aux carbapénèmes. Nous n’avons toutefois pas mis en évidence de lien entre les souches cliniques et extrahospitalières, les clones correspondants étant globalement différents. D’autres études sont nécessaires pour élucider l’origine des souches multi-résistantes émergeant dans les hôpitaux.

L’émergence et la diffusion de la résistance aux antibiotiques au sein des bactéries à Gram négatif (BGN) sont aujourd’hui des enjeux de Santé Publique nationaux et internationaux. La multi-résistance aux antibiotiques concerne non seulement des espèces fréquemment responsables d’infections nosocomiales mais aussi des espèces hautement virulentes comme Yersinia pestis, agent de la peste et du bioterrorisme. Dans ce contexte, la mise au point de nouvelles molécules actives sur d’autres cibles bactériennes est primordiale. La métallo-enzyme LpxC catalyse la première étape irréversible de la biosynthèse du lipide A, constituant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Des inhibiteurs de LpxC sont ainsi développés depuis une vingtaine d’années mais leur spectre sur les BGN était initialement limité aux entérobactéries et leur activité partielle sur P. aeruginosa. Dans ce travail nous avons participé à l’optimisation de la structure chimique de ces molécules grâce à une approche dynamique des interactions enzymes/inhibiteurs utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique a permis l’élaboration d’un nouvel inhibiteur de LpxC, le LPC-058, caractérisé par une forte affinité pour l’enzyme (Ki = 3,5 ± 0,2 pM). Nous avons évalué in vitro l’activité antibiotique du LPC-058 et de trois autres composés (CHIR-090, LPC-011 et LPC-087) vis-à-vis de 369 souches cliniques responsables d’infections nosocomiales aux profils de résistance variés. Le LPC-058 présentait le plus large spectre d’activité en particulier sur A. baumannii et les valeurs de CMI les plus basses (CMI90 = 0,12 mg/L pour les entérobactéries et 0,5 mg/L pour P. aeruginosa). Il était bactéricide vis-à-vis de souches multi-résistantes et son action était synergique avec les C3G, l’imipénème, l’amikacine et la ciprofloxacine vis-à-vis de souches de K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii productrice de carbapénémases, respectivement KPC-2, VIM-1 et OXA-23. Le LPC-058 présentait néanmoins une forte fixation protéique et, in vivo, son volume de distribution était limité au compartiment sanguin (Vd = 1,1 L/kg). Nous avons évalué son activité in vivo dans un modèle murin de peste bubonique car il s’agit de l’une des infections les plus virulentes pour l’homme. Nous avons obtenu une survie de 87 % après 5 jours de traitement à la posologie de 10 mg/kg q8h par voie veineuse. Le LPC-058 occasionnant des diarrhées chez le rongeur, nous avons évalué un de ses dérivés, le LPC-B, caractérisé par une moindre fixation protéique, un plus grand volume de distribution et l’absence d’effets secondaires chez la souris, même à fortes doses. Nous avons démontré qu’à la posologie de 200 mg/kg par voie veineuse, cet antibiotique était aussi efficace que la doxycycline (traitement de référence de la peste). L’ensemble de ces travaux souligne le rôle potentiel des inhibiteurs de LpxC dans la prise en charge des infections par des bactéries multi-résistantes ou hautement virulentes. Antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria (GNB) has become a national and international public health concern. Resistant strains are involved in nosocomial diseases and in highly virulent infections, such as plague caused by Yersinia pestis, a potential biological terrorism agent. In this context the development of new antimicrobial compounds efficient on new bacterial targets is critical. LpxC metallo-enzyme catalyzes the first commitment step of the lipid A biosynthesis, a major component of the Gram negative cell wall. LpxC inhibitors have been developed for twenty years but their activity was restricted to enterobacteria and weak against Pseudomonas aeruginosa. In this study, we have collaborated in the chemical optimization of the compounds thanks to a dynamic approach of enzyme/inhibitor interactions brought by nuclear magnetic resonance (NMR). This technology enabled the development of LPC-058, a new inhibitor, showing a high potency against LpxC (Ki = 3.5 ± 0.2 pM). We studied the in vitro efficacy of LPC-058 and three other compounds (CHIR-090, LPC-011 and LPC-087) against 369 clinical strains responsible for nosocomial infections with various antibiotic resistance profiles. In this part, LPC-058 displayed the broadest spectrum of efficacy, even on Acinetobacter baumannii with the lowest MIC values (MIC90 = 0.12 mg/L against enterobacteria and 0.5 mg/L against P. aeruginosa). It showed bactericidal activity against multi-resistant strains and synergistic activity in association with third generation cephalosporins, imipenem, amikacin and ciprofloxacin against carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii strains (respectively KPC-2, VIM-1 and OXA-23). However, LPC-058 was constrained by strong protein interactions and a small volume of distribution (Vd = 1.1 L/kg). In vivo efficacy was studied in a murine model of bubonic plague. A 87% survival rate was obtained after five days of 10 mg/kg q8h intravenous administration. As LPC-058 treatment was associated to diarrheas in mice, we evaluated another derivate, LPC-B, characterized by a larger volume of distribution, minor protein fixation and less side effects, even for a high dose posology. We demonstrated a comparable efficacy between 200 mg/kg LPC-B treatment and doxycyclin administration (recommended in plague treatment). This work highlights the potential use of LpxC inhibitors in the management of infections caused by multi-resistant or highly virulent Gram-negative bacteria.

Antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria (GNB) has become a national and international public health concern. Resistant strains are involved in nosocomial diseases and in highly virulent infections, such as plague caused by Yersinia pestis, a potential biological terrorism agent. In this context the development of new antimicrobial compounds efficient on new bacterial targets is critical. LpxC metallo-enzyme catalyzes the first commitment step of the lipid A biosynthesis, a major component of the Gram negative cell wall. LpxC inhibitors have been developed for twenty years but their activity was restricted to enterobacteria and weak against Pseudomonas aeruginosa. In this study, we have collaborated in the chemical optimization of the compounds thanks to a dynamic approach of enzyme/inhibitor interactions brought by nuclear magnetic resonance (NMR). This technology enabled the development of LPC-058, a new inhibitor, showing a high potency against LpxC (Ki = 3.5 ± 0.2 pM). We studied the in vitro efficacy of LPC-058 and three other compounds (CHIR-090, LPC-011 and LPC-087) against 369 clinical strains responsible for nosocomial infections with various antibiotic resistance profiles. In this part, LPC-058 displayed the broadest spectrum of efficacy, even on Acinetobacter baumannii with the lowest MIC values (MIC90 = 0.12 mg/L against enterobacteria and 0.5 mg/L against P. aeruginosa). It showed bactericidal activity against multi-resistant strains and synergistic activity in association with third generation cephalosporins, imipenem, amikacin and ciprofloxacin against carbapenemase producing Klebsiella pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii strains (respectively KPC-2, VIM-1 and OXA-23). However, LPC-058 was constrained by strong protein interactions and a small volume of distribution (Vd = 1.1 L/kg). In vivo efficacy was studied in a murine model of bubonic plague. A 87% survival rate was obtained after five days of 10 mg/kg q8h intravenous administration. As LPC-058 treatment was associated to diarrheas in mice, we evaluated another derivate, LPC-B, characterized by a larger volume of distribution, minor protein fixation and less side effects, even for a high dose posology. We demonstrated a comparable efficacy between 200 mg/kg LPC-B treatment and doxycyclin administration (recommended in plague treatment). This work highlights the potential use of LpxC inhibitors in the management of infections caused by multi-resistant or highly virulent Gram-negative bacteria., L’émergence et la diffusion de la résistance aux antibiotiques au sein des bactéries à Gram négatif (BGN) sont aujourd’hui des enjeux de Santé Publique nationaux et internationaux. La multi-résistance aux antibiotiques concerne non seulement des espèces fréquemment responsables d’infections nosocomiales mais aussi des espèces hautement virulentes comme Yersinia pestis, agent de la peste et du bioterrorisme. Dans ce contexte, la mise au point de nouvelles molécules actives sur d’autres cibles bactériennes est primordiale. La métallo-enzyme LpxC catalyse la première étape irréversible de la biosynthèse du lipide A, constituant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Des inhibiteurs de LpxC sont ainsi développés depuis une vingtaine d’années mais leur spectre sur les BGN était initialement limité aux entérobactéries et leur activité partielle sur P. aeruginosa. Dans ce travail nous avons participé à l’optimisation de la structure chimique de ces molécules grâce à une approche dynamique des interactions enzymes/inhibiteurs utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN). Cette technique a permis l’élaboration d’un nouvel inhibiteur de LpxC, le LPC-058, caractérisé par une forte affinité pour l’enzyme (Ki = 3,5 ± 0,2 pM). Nous avons évalué in vitro l’activité antibiotique du LPC-058 et de trois autres composés (CHIR-090, LPC-011 et LPC-087) vis-à-vis de 369 souches cliniques responsables d’infections nosocomiales aux profils de résistance variés. Le LPC-058 présentait le plus large spectre d’activité en particulier sur A. baumannii et les valeurs de CMI les plus basses (CMI90 = 0,12 mg/L pour les entérobactéries et 0,5 mg/L pour P. aeruginosa). Il était bactéricide vis-à-vis de souches multi-résistantes et son action était synergique avec les C3G, l’imipénème, l’amikacine et la ciprofloxacine vis-à-vis de souches de K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii productrice de carbapénémases, respectivement KPC-2, VIM-1 et OXA-23. Le LPC-058 présentait néanmoins une forte fixation protéique et, in vivo, son volume de distribution était limité au compartiment sanguin (Vd = 1,1 L/kg). Nous avons évalué son activité in vivo dans un modèle murin de peste bubonique car il s’agit de l’une des infections les plus virulentes pour l’homme. Nous avons obtenu une survie de 87 % après 5 jours de traitement à la posologie de 10 mg/kg q8h par voie veineuse. Le LPC-058 occasionnant des diarrhées chez le rongeur, nous avons évalué un de ses dérivés, le LPC-B, caractérisé par une moindre fixation protéique, un plus grand volume de distribution et l’absence d’effets secondaires chez la souris, même à fortes doses. Nous avons démontré qu’à la posologie de 200 mg/kg par voie veineuse, cet antibiotique était aussi efficace que la doxycycline (traitement de référence de la peste). L’ensemble de ces travaux souligne le rôle potentiel des inhibiteurs de LpxC dans la prise en charge des infections par des bactéries multi-résistantes ou hautement virulentes.

Introduction : carbapenem resistance of Pseudomonas Aeruginosa (PA) is increasing worldwide. Carbapenemase outbreaks are sources of concern. Several rapid phenotypic diagnostic assays for carbapenemase detection have been developed and validated on enterobacteriaceae, but poorly evaluated on PA. Goal : to evaluate the epidemiology of carbapenem resistance mechanisms in PA in 3 French intensive care units (ICU). To compare the results of phenotypic carbapenemase detection tests to genotypic Gold Standard. Methods : IMIPENEM or MEROPENEM resistant PA strains from 3 French ICU were included. CLAVULANATE synergy test was used to detect ESBL (Extended-Spectrum Beta-Lactamase). Carbapenemase-producing strains were detected with the following assays : interpretative diameters reading, EDTA-based disc-test, ©Liofilchem® KPC&MBL disc kit, Mastdiscs ™ Carbapenemase Detection Set®, Mastdiscs ™ CAT-ID™, Rapidec® Carba NP-test. Multiplex PCR for ESBL and carbapenemase main genes was performed for each strain. 2 metallo-carbapenemase positive strains were included in the analysis. Results : 47 strains were analyzed. No carbapenemase was found, 2 (4.3%), were positive for ESBL, 12 (25.5%) were positive for AmpC hyperproduction, 33 (70,2%) for overexpressed efflux pumps. Interpretative reading, EDTA-based disc-test, and Rapidec® Carba NP-test showed good sensitivity and specificity. Diagnostic performances of other tests were poor. Conclusion : in this population, carbapenem resistance was mostly due to non-transferable mechanisms. Well conducted antibiogram interpretative reading and EDTA-based disc test appeared to be efficient to detect most common carbapenemases in PA. Diagnostic contribution of other tests in low-prevalence population remains shallow., Introduction : la résistance de Pseudomonas Aeruginosa (PA), premier pathogène en réanimation, aux carbapénèmes augmente à l’échelle mondiale. L’apparition de carbapénémases est problématique. De nombreux tests rapides de dépistage des carbapénémases ont été développés chez les entérobactéries, mais peu évalués chez PA. Objectif : évaluer la part respective des différents mécanismes de résistance de PA aux carbapénèmes dans 3 services de réanimation français. Comparer les résultats des tests phénotypiques et de la lecture interprétative de l’antibiogramme au Gold Standard génotypique. Matériel et méthode : étude ancillaire du PHRC Dynapyo ayant étudié les souches de PA acquises dans 10 services de réanimation français en 2009. Les souches de PA résistantes à l’IMIPENEME et/ou au MEROPENEME issues de 3 des services étaient incluses. Les BLSE (β-lactamases à spectre étendu) étaient recherchées par synergie au clavulanate. Les carbapénémases étaient recherchées par les tests suivants : analyse de l’antibiogramme, test à l’Ethylène Diamine Tétra-Acétique (EDTA), ©Liofilchem® KPC&MBL disc kit, Mastdiscs ™ Carbapenemase Detection Set®, Mastdiscs ™ CAT-ID™, Rapidec® Carba NP-test. Les gènes de BLSE et de carbapénémases étaient recherchés par PCR. 2 souches témoins positives pour métallo-carbapénémases étaient utilisées pour comparer tests phénotypiques et génotypiques. Résultats : sur 47 souches analysées, aucune n’était porteuse de carbapénémase, 2 (4,3%) étaient porteuses de BLSE, 12 (25,5%) de céphalosporinase AmpC hyperproduite, 33 (70,2%) de mécanismes d’efflux. La lecture interprétative de l’antibiogramme, le test à l’EDTA, et le Rapidec® Carba NP-test étaient sensibles et spécifiques, comparés à la PCR. Les performances diagnostiques des autres tests étaient médiocres. Conclusion : la résistance aux carbapénèmes de PA dans cette population était principalement due à des mécanismes non-transférables. La lecture interprétative de l’antibiogramme bien conduite et le test simple à l’EDTA semblent adaptés au dépistage des carbapénémases les plus fréquentes chez PA. L’apport diagnostique d’autres tests phénotypiques en pratique courante semble mince.

Introduction: Primary immunodeficiencies are a group of diseases in which bone marrow transplantation is sometimes the only curative therapy. These patients present a major risk of infection. The pandemy of Enterobacteriaceae producing β-lactamases (E.ESBLs) complicates their care. A better understanding of its clinical impact is necessary to improve the outcome of these patients.Materials and Methods: We conducted a retrospective, monocentric, cohort study, including 46 children bone marrow transplanted for primary immunodeficiency or primitive bone marrow failure. Carriers of E. ESBLs at the entrance are compared with noncarriers. The primary endpoint is mortality. The secondary endpoints were duration of hospitalization, infectious episodes, and antibiotic consumption.Results: 43.5% of patients are carriers at the entrance. No difference between carriers and non carriers are found according to the criteria studied. A majority of patients receive carbapenems in both groups. The acquisition of a carriage of E. ESBLs occurs in the most severe patients. Infected patients with E.BLSE seem to have a worse outcome and are significantly younger. Digestive decontamination has a partial microbiological effect.Conclusions: We find no impact of E. ESBLs carriage at the entrance. E.BLSE infection is found in younger patients and seems have poor outcome. A study should be conducted on the use of carbapenems. The efficacy of digestive decontamination should be clarified.; Introduction : Les déficits immunitaires primitifs représentent un ensemble de pathologies pour lesquelles la greffe de moelle osseuse est parfois la seule thérapeutique curative. Ces patients présentent un risque infectieux majeur. La pandémie d’entérobactéries productrices de β-lactamases à spectre étendu (E.BLSE) complexifie leur prise en charge. Une meilleure compréhension de son impact clinique est nécessaire pour la prise en charge de ces patients.Matériels et Méthodes : Nous avons mené une étude de cohorte, rétrospective, monocentrique incluant 46 enfants greffés de moelle pour un déficit immunitaire primitif ou une aplasie médullaire primitive. Les porteurs d’E.BLSE à l’entrée sont comparés aux non porteurs. Le critère de jugement principal est la mortalité. Les critères de jugement secondaires sont la durée d’hospitalisation, les épisodes infectieux, la consommation d’antibiotiques.Résultats : 43,5% des patients sont porteurs à l’entrée. On ne constate pas de différence entre les porteurs et les non porteurs sur les critères étudiés. Une majorité des patients reçoivent des carbapénèmes, dans les deux groupes. L’acquisition d’un portage d’E.BLSE survient chez les patients les plus graves. Les patients s’infectant à E.BLSE semblent avoir un plus mauvais pronostic et sont significativement plus jeunes. La décontamination digestive a un effet microbiologique partiel.Conclusions : Nous ne retrouvons pas d’impact du portage d’E.BLSE. L’infection à E.BLSE est retrouvée chez les patients les plus jeunes, et semble de mauvais pronostic. Une réflexion doit être menée sur l’utilisation des carbapénèmes. L’efficacité de la décontamination digestive mérite d’être précisée.