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Severe infectious states are characterized by the occurrence of immune perturbations responsible for an exacerbation of the susceptibility to secondary infections. The development of a standardized murine model of double sequential infections (a sepsis followed 5 days later by an acquired infection) allowed us to explore the T- cells disturbances showing an increase in apoptosis of these cells as well as a decrease in their capacity to proliferate in vitro. These dysfunctions were associated with the presence of an alteration of mitochondrial respiration. On the other hand, an increase in the concentration of regulatory T cells and MDSCs and a decrease in arginine concentration were observed. The correction of hypoargininemia by citrulline supplementation allowed the correction of all these perturbations as well as a decrease in the severity of secondary infections. In order to complete this experimental approach, we have initiated explorations in patients suffering from COVID-19, allowing us to observe, once again, the presence of lymphopenia correlated to the severity of the patients as well as T-cells dysfunctions associated with the occurrence of hypoargininemia and an increased risk of secondary infections. Finally, the presence of immunosuppressive cell populations was observed in severe patients. All these results underline the key role of arginine metabolism within the immunosuppressive mechanisms occurring during infectious states. The correction of hypoargininemia suggests new therapeutic perspectives to limit the consequences of immunosuppressive phenomena induced by sepsis., Les états infectieux sévères sont caractérisés par la survenue de perturbations immunitaires responsables d’une exacerbation de la susceptibilité aux infections secondaires. L’élaboration d’un modèle murin standardisé de double infections séquentielles (un sepsis suivi 5 jours après d’une infection acquise) nous a permis d’explorer les perturbations lymphocytaires T objectivant une majoration de l’apoptose de ces cellules ainsi qu’une diminution de leurs capacités à proliférer in vitro. Ces dysfonctions étaient associées à la présence d’une altération de la respiration mitochondriale. D’autre part, ont été observées une augmentation de la concentration de lymphocytes T régulateurs et de MDSC ainsi qu’une diminution de la concentration en arginine. La correction de l’hypoargininémie par supplémentation en citrulline a permis la correction de l’ensemble de ces perturbations ainsi qu’une diminution de la sévérité des infections acquises. Afin d’approfondir cette approche expérimentale, nous avons initié des analyses chez les patients atteints de COVID-19 permettant d’observer, là encore, la présence d’une lymphopénie corrélée à la sévérité ainsi que des dysfonctions lymphocytaires T associées à la survenue d’une hypoargininémie et à une majoration du risque d’infections secondaires. Enfin, a pu être objectivée la présence de populations cellulaires immunosuppressives préférentiellement chez les patients sévères. L’ensemble de ces résultats souligne le rôle clé du métabolisme de l’arginine au sein des mécanismes immunosupresseurs survenant au cours des états infectieux. La correction de l’hypoargininémie laisse entrevoir de nouvelles perspectives thérapeutiques afin de limiter les conséquences des phénomènes immunosuppresseurs induits par le sepsis.

Induction chemotherapy with consolidation followed by allogeneic stem celltransplantation (allo-SCT) remains the standard of care in patients with acute myeloidleukemia (AML). But, high dose chemotherapy is responsible for intestinal impairmentresponsible for complications such as septicemia and Graft vs. Host disease (GvH) afterallo-SCT. The aim of this work was to investigate the specific impact and consequences ofinduction chemotherapy on intestinal barrier in case of AML.First of all, we investigated on 15 patients with AML, clinical, biological (citrullineand short-chain fatty acid) and microbial (qPCR and sequencing on feces) parametersbefore induction chemotherapy (T0), during aplasia (T1) and after hematological recovery(T2). An induction chemotherapy model was designed in a mouse model (Wt mice) withoutantibiotics and in a transgenic model able to release in intestinal lumen a recombinantprotein strengthening mucosal layer (Tg222). Intestinal damage was investigated withplasmatic citrulline level, terminal ileum mucosa analysis on histological slides withapoptosis (TUNEL) and cellular proliferation (PCNA) staining. Adherent microflora wasassessed with qPCR and sequencing on ileum section. Intestinal translocation wasassessed after oral gavage of Salmonella (S). Typhimurium. The fifteen patients hadneutropenic fever and received broad-spectrum antibiotics after chemotherapy completion.Septicemia with E. coli was diagnosed in 26 % of patients. Plasma citrulline level collapsedat T1 and reached normal value at T2. The alpha and beta diversity decreased significantlyand remained low at T2 with a decrease of all bacteria except for enterobacteria,enterococcus and lactobacillus. In mouse model, chemotherapy induced a transientdecrease of all blood counts, and citrulline level. We observed also a terminal ilealimpairment depicted by the increase of apoptosis and PCNA staining and a decrease ofgoblet cells. Three days after the chemotherapy completion, we observed a higher tissuerepair, citrulline level and a preserved alpha diversity in Tg222 mice compared to Wt mice.Intestinal translocation of S. Typhimurium was also lower than in Wt mice.Secondly, plasmatic citrulline level and in vitro macrophage reactivity wereassessed after microbial stimulation with (PAMP) in patients before allo-SCT procedure.Then, the plasma citrulline level as a predictive surrogate marker of GvH was investigatedin a large cohort of patients. Before allo-SCT procedure, a low citrulline level and anincrease of IL-6 and IL-10 released by macrophages were predictive of GvH. A large studywith 191 patients confirmed that a low citrulline level before allo-SCT procedure was anindependent risk factor of intestinal GvH.Intestinal impairment during induction chemotherapy was responsible for a transientepithelial impairment and prolonged dysbiosis leading to bacterial colonization andtranslocation. Before conditioning regimen, a low citrulline level and increased macrophagereactivity reflect sub-clinical damage and are predictive of GvH after allo-SCT procedure. Inmice, mucosal layer strengthening as a proof of concept may enhance tissue repair,maintain microbial diversity and could limit bacterial translocation after high dosechemotherapy.; La chimiothérapie d’induction et de consolidation suivie d’allogreffe de cellulessouches hématopoïétiques (allo-CSH) constitue le traitement de référence de la plupartdes leucémies aiguës myéloblastiques (LAM). Ces fortes doses de chimiothérapies sontresponsables d’une atteinte de la barrière intestinale à l’origine de complicationsinfectieuses et immunologiques, telles que la réaction aiguë du greffon contre l’hôte (GvH).Dans un premier temps l’objectif était d’évaluer au cours d’une étudetranslationnelle, l’impact et les conséquences de cette chimiothérapie d’induction sur labarrière intestinale. Pour cela, nous avons évalué sur une série de 15 patients atteints deLAM, les paramètres cliniques, biologiques (citrulline plasmatique et acide gras à chainecourte dans les selles) et microbiologiques (qPCR et séquençages des fèces) avant lachimiothérapie d’induction (T0), pendant la phase d’aplasie (T1) et après la sortie d’aplasie(T2). Tous les patients ont présenté une fièvre et ont nécessité l’administrationd’antibiotiques à large spectre après la chimiothérapie. Une septicémie à E. coli estsurvenue chez 26 % d’entre eux. Leur citrulline s’est effondrée à T1 avant de se normaliserprogressivement à T2. Il existait une diminution de la diversité α et β à T1 qui persistait àT2 avec une diminution de la plupart de populations bactériennes, exceptées pour lesentérobactéries, les entérocoques et les lactobacilles.Cette chimiothérapie d’induction a ensuite été adaptée pour pouvoir êtreadministrée, sans ajout d’aucun antibiotique, à des souris sauvages (WT) et à des souristransgéniques dont le mucus intestinal est renforcé (Tg222) afin d’évaluer : i. lesdommages intestinaux (citrulline plasmatique et analyse des coupes histologiques d’iléonavec marquage de l’apoptose (TUNEL) et de la prolifération cellulaire (PCNA)); ii. lemicrobiote adhérent iléale (qPCR et séquençage des fragments d’iléon) ; iii.. latranslocation intestinale de Salmonella (S) Typhimurium administrée par gavage oral. Chezces souris, la chimiothérapie provoquait une baisse de l’ensemble des lignées sanguines,de la citrulline et une atteinte iléale avec augmentation de l’apoptose, de la prolifération cellulaire et une baisse du nombre de cellules en gobelets. Trois jours après la fin de lachimiothérapie, on constatait une meilleure réparation tissulaire, avec un taux de citrullineet une diversité α plus élevés chez les souris Tg222 comparé aux souris WT. Les Tg222étaient également moins sensibles à la translocation intestinale à S. Typhimurium.Dans un second temps, la citrulline plasmatique et la réactivité des macrophages(issus de monocytes circulants) ont été étudiés après stimulation in vitro par différentsdérivés microbiens, sur une série de patients, avant que ne soit débuté leurconditionnement d’allo-CSH. Dans cette étude, une citrulline basse et l’augmentation de lasécrétion d’IL-6 et d’IL-10 par les macrophages avant la greffe étaient prédictifs de lasurvenue d’une GvH après la greffe.Une étude d’une cohorte sur 191 patients a confirmé qu’une citrulline pré-greffebasse (< 26 μmol/l) constituait un facteur de risque indépendant de survenue d’une GvHdigestive sévère et de mortalité précoce [...]

Increased nitric oxide (NO) bioavailability may improve exercise performance and vascular function. It remains unclear whether older adults (60-70 years) who experience a decreased NO bioavailability may benefit from chronic NO precursor supplementation. This randomized double-blind trial aims to assess the effect of chronic NO precursor intake on vascular function and exercise performance in older adults (60-70 years old). Twenty-four healthy older adults (12 females) performed vascular function assessment and both local (knee extensions) and whole-body (incremental cycling) exercise tests to exhaustion before and after one month of daily intake of a placebo (PLA) or a nitrate-rich salad and citrulline (N+C, 520mg nitrate and 6g citrulline) drink. Arterial blood pressure (BP) and stiffness, post-ischemic, hypercapnic and hypoxic vascular responses were evaluated. Prefrontal cortex and quadriceps oxygenation was monitored by near-infrared spectroscopy. N+C supplementation reduced mean BP (- 3.3mmHg; p=0.047) without altering other parameters of vascular function and oxygenation kinetics. N+C supplementation reduced heart rate and oxygen consumption during submaximal cycling and increased maximal power output by 5.2% (p

Beyond its transitional role in the urea cycle, numerous works have evidenced pleïotropic effects of citrulline in the metabolism, especially in the proteino-energy metabolism. Indeed, its amino acid is able to stimulate muscle protein synthesis which is closely related to cellular energy metabolism. Nevertheless, studies conducted until now do not allow to conclude about the importance of the specific endogenous citrulline production by the enterocytes. Also, in the organim, citrulline is produced thanks to a key enzyme, the ornithine transcarbamylase (OTC), giving to its functionnality a huge implication in the regulation of the proteino-energy homeostasis. Works presented here set up an in vitro model of human duodenal explants, as well as, an in vivo murine model of conditional knock out for the OTC gene. Results obtained have allowed to evidence the importance of the citrulline metabolism since it remains stable over energy status deregulation. Moreover, they have allowed to specify that a healthy organism is able to compensate an OTC deficiency, however, the induction of an energy deregulation with a low protein diet bring to light a major role of the endogenous citrulline in these situations., Outre son rôle d’intermédiaire dans le cycle de l’urée, de nombreux travaux mettent en évidence les effets pléïotropiques de la citrulline dans le métabolisme et notamment dans le métabolisme protéino-énergétique. En effet, cet acide aminé est capable de stimuler la synthèse protéique musculaire étroitement liée avec le métabolisme énergétique cellulaire. Cependant les études menées jusqu’alors ne permettent pas de conclure quant à l’importance de la production endogène de citrulline par les entérocytes spécifiquement. Aussi, dans l’organisme, la citrulline est produite par une enzyme clé, l’ornithine transcarbamylase (OTC), donnant à la fonctionnalité de cette dernière une implication tout aussi importante dans le maintien de l’homéostasie protéino-énergétique. Les travaux présentés ici mettent en place un modèle d’étude in vitro d’explants duodénal humain ainsi qu’un nouveau modèle murin de knock out conditionnel du gène de l’OTC. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence l’importance du métabolisme de la citrulline puisque celui-ci reste stable avec l’induction d’une altération du statut énergétique. De plus ils ont permis de spécifier qu’un la capacité d’un organisme sain à compenser une déficience en OTC, cependant, l’induction de dérégulation énergétique par un régime hypoprotéique met en avant un rôle majeur de la citrulline endogène dans ces situations.

Primary and secondary prevention of cardiovascular diseases is a major public health concern. Cardiovascular prevention is mainly underpinned by the control of cardiovascular risks. Among them, arterial hypertension (30% of adults in France) and sedentarity (40% of french population) represents two main targets in cardiovascular prevention. Endothelial function as well as exercise tolerance and performance (fitness status) are used as powerful markers of cardiovascular morbidity-mortality.A normal vasomotor endothelial function allows to regulate vascular tone. By synthesising vasoactive substances, vascular endothelium continuously maintains an optimal balance between vasodilation and vasoconstriction to match oxygen and energetic substrate supply to the demand. Endothelial function is plastic, and is increased for instance by physical activity and decreased with age. Endothelial dysfunction is essentially characterized by the production of less vasodilation substances, inducing an increase in blood pressure, arterial stiffness and leading to blood-tissue exchanges alterations. Degrees of endothelial dysfunction is considered as a cardiovascular risk marker.One major vasoactive substance is nitric oxide (NO), which is produced by NO-synthase (NOS) in endothelium, and is a mediator of smooth muscle cells relaxation. This major endogen synthesis can be complemented by NO synthesis from simple reduction of nitrite to NO. Several mechanisms are provided to explain a decrease in NO endothelial synthesis, including decrease of enzymatic activity (NOS) and/or an inadequate substrate or cofactor bioavailability. This decrease in NO bioavailability can be offset, either by NOS activity optimization, or increase NO bioavailability at a vascular level. Although the effects of NO precursor supplementation on health and exercise performance have been extensively studied, results are somehow controversial, mainly due to methodological discrepancies. Thus, the real interest of these types of interventions stays unclear.Thought this thesis work, we were interested to physiological effect in healthy subjects of different interventions which may increase NO bioavailability at vascular level. Focusing on food supplement consumption, we differentiated two NO precursor, two supplementation modalities, and two populations.We have assessed effect of increasing NO bioavailability by acute or chronic supplementation of both NOS-dependent (L-arginine, L-citrulline) and/or NOS-independent (nitrate) pathways, with or without simultaneous training program, in young and older healthy subjects, on vascular function and exercise performances.In healthy young individuals, NO precursor intake increase endothelial function assessed by post-ischemic vasodilation, without effect neither on arterial pressure and fitness nor on exercise performances. However, nitrate and citrulline supplementation increase exercise training effect on maximal strength and strength endurance. In healthy older adults, chronic intake of nitrate and citrulline reduce arterial pressure and improve maximal aerobic power by decrease of submaximal VO2 and heart rate., Depuis de nombreuses années, la prévention primaire et secondaire des atteintes cardiovasculaires chez l’homme est devenue un véritable enjeu de santé publique. L’axe principal de cette prévention est l’identification et le contrôle des facteurs de risques cardiovasculaires. Parmis eux, l’hypertension artérielle (30% des adultes en France) et la sédentarité (40% de la population française) sont des acteurs majoritaiement dans la pathogénése des maladies cardiovasculaires. La fonction endothéliale ainsi que la tolérance et la performance à l’exercice, sont utilisées comme de puissants marqueurs de morbi-mortalité cardiovasculaires.Une fonction vasomotrice endothéliale normale permet de contrôler le tonus vasculaire, d’optimiser la circulation sanguine et participe au contrôle d’apports en oxygène et substrats énergétiques adaptés aux besoins tissulaires. Par la production de substances vasoactives, l’endothélium vasculaire assure en permanence un équilibre entre vasodilatation et vasoconstriction. La fonction endothéliale est plastique, s’améliorant par exemple avec l’activité physique et s’altérant avec l’âge. La dysfonction endothéliale de son côté, se caractérise essentiellement par une moindre sécrétion de substances vasodilatatrices participant à l’élévation de la pression artérielle, une augmentation de la rigidité artérielle et à une altération des échanges sang-tissus.L’une des substances vasodilatatrices majeures est le monoxyde d’azote (NO) synthétisé au niveau de l’endothélium, par la NO-synthase endothéliale (eNOS), et dont la diffusion vers les cellules musculaires lisses sous-jacentes, entraine leurs relâchements. Cette synthèse endogène majeure est complétée par une synthèse de NO à partir d’une simple réduction du nitrite circulant en NO. Les mécanismes proposés pour expliquer la baisse de la synthèse endothéliale de NO incluent une diminution de l’activité enzymatique (eNOS) et/ou une insuffisance en substrats et cofacteurs disponibles pour celle-ci. Cette diminution de la biodisponibilité en NO peut être compensée, soit par optimisation de l’activité de la NOS, soit par un apport de NO au niveau vasculaire. Bien que la littérature ait largement étudié l’effet de précurseur de NO sur la santé et la performance à l’exercice, les résultats restent très contrastés, notamment du fait de questions méthodologiques, et l’intérêt réel de ce type d’intervention reste à clarifier.Au cours de ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à l’effet de différentes interventions capables d’augmenter la biodisponibilité en NO au niveau vasculaire, chez le sujet sain. En se focalisant sur l’ingestion de compléments alimentaires, nous avons différencié deux types de précurseurs de NO et deux modalités de supplémentation (aiguë et chronique). Nous avons évalué l’effet de l’augmentation de la biodisponibilité en NO en supplémentant les voies NOS-dépendantes (L-arginine, L-citrulline) et/ou NOS-indépendantes (nitrate) de façon aigüe ou chronique, avec ou sans programme d’entraînement à l’effort simultané, chez des sujets sains jeunes ou âgés, sur la fonction vasculaire et les performances à l’effort.Chez le sujet jeune en bonne santé, il apparait que l’ingestion de précurseurs de NO améliore la fonction endothéliale évaluée par la vasodilatation post-ischémique, sans impacter ni la pression et la rigidité artérielle, ni la performance à l’exercice. En revanche, la supplémentation en nitrate et citrulline optimise les effets de l’entrainement sur la force maximale et l’endurance de force. Chez le sujet âgé, la prise chronique de nitrate et citrulline réduit la pression artérielle et améliore la puissance maximal aerobie en diminuant la VO2 et la fréquence cardiaque sous maximale.

Introduction : les maladies du tube digestif du nouveau-nés sont difficiles à prendre en charge. Une des principales complications est la résection chirurgicale d’une partie de l’intestin qui peut être responsable d’une insuffisance intestinale pouvant retentir sur la croissance et l’état nutritionnel. La citrulline est un acide aminé synthétisé par les entérocytes qui peut être un marqueur de la masse fonctionnelle intestinale et permettre de moduler le support nutritionnel. L’objectif principal était de chercher une corrélation entre la longueur d’intestin grêle post-chirurgicale et le taux de citrulline chez des nouveau-nés porteurs de pathologies digestives traitées chirurgicalement. Matériel et méthode : la citrulline plasmatique était dosée à plusieurs reprises chez des nouveau-nés porteurs de dérivation intestinale. La longueur de grêle était évaluée en peropératoire. Les éléments nutritionnels étaient relevés à partir du dossier du patient. Résultat : 15 nouveau-nés de 33,3 ± 5,9 [25-41] SA ont été inclus. Le taux de citrulline semble corrélé positivement à la longueur de grêle sans significativité statistique. La durée de nutrition parentérale est inversement proportionnelle à la longueur du grêle restant (p=0,01). Il existe un lien entre le taux de citrulline et la progression de la nutrition entérale permettant le sevrage de la nutrition parentérale. Conclusion : notre travail a permis de montrer que la citrulline pourrait être un marqueur biologique de la masse fonctionnelle intestinale chez des nouveau-nés porteurs de dérivation intestinale et ou de résection du grêle. Elle pourrait aider à monitorer la nutrition qui joue un rôle primordial dans le devenir de ces enfants.

Besides his role in the metabolism of the urea cycle, citrulline has many properties including the ability to stimulate muscle protein synthesis. However, protein synthesis is an important item of cell energy expenditure. Our work has explored both the in vivo and in vitro effects of citrulline on energy metabolism in order to understand how the activation of muscle protein synthesis by this amino acid is coordinated with energy metabolism. Our results have shown that citrulline modulates energy metabolism via a reorientation of energy flux in favor of protein synthesis. Moreover, our work has clarified citrulline effects on protein metabolism with a synergistic effect of citrulline and exercise on protein synthesis and performance. Finally, this work allowed to explore for the first time citrulline (and leucine) effects on muscle secretome. We have thus demonstrated that citrulline modulates muscle secretome and highlighted how complex is the regulation of secreted proteins by amino acids. In conclusion, our work contributes to a better understanding on muscle regulation of protein-energy metabolism by citrulline., Outre son rôle dans le métabolisme du cycle de l’urée, la citrulline possède de nombreuses propriétés notamment celle de stimuler la synthèse protéique musculaire. Or, la synthèse protéique est un poste de dépense énergétique important de la cellule. Nos travaux ont ainsi exploré, à la fois in vivo et in vitro, les effets de la citrulline sur le métabolisme énergétique afin de comprendre comment l’activation de la synthèse protéique musculaire par cet acide aminé est coordonnée avec le métabolisme énergétique. Nos résultats ont permis de mettre en évidence que la citrulline module bien le métabolisme énergétique, notamment via une réorientation des flux énergétiques au profit de la synthèse protéique. De plus, nos travaux ont précisé les effets de la citrulline sur le métabolisme protéique avec notamment un effet synergique de la citrulline et de l’exercice sur la synthèse protéique et sur la performance. Enfin, ces travaux ont permis d’explorer pour la première fois in vitro les effets de la citrulline (et de la leucine) sur le sécrétome musculaire. Nous avons ainsi démontré que la citrulline module le sécrétome musculaire et mis en évidence la complexité de régulation des protéines sécrétées par les acides aminés. En conclusion, nos travaux sont une contribution à la meilleure compréhension de la régulation musculaire du métabolisme protéino-énergétique par la citrulline.

Forum des prix SFN - Impact des facteurs environnementaux et génétiques sur la consommation et l'utilisation des nutriments; National audience; Introduction et but de l’étude : La prise en charge nutritionnelle de la sarcopénie et de la dénutrition est souvent peu efficace chez la personne âgée, notamment à cause de la résistance à l’anabolisme protéique postprandial. La Cit stimule la synthèse protéique musculaire chez le rat âgé et chez l’homme jeune. Le but de cette étude est de mesurer si la Cit est efficace sur le turn over protéique des patients âgés dénutris (PAD) hospitalisés. Matériel et méthodes : Cette étude prospective (PHRC National 2007, ClinicalTrials.gov Identifier: NCT00714675), randomisée et multicentrique a inclus 29 PAD hospitalisés en soins de suite gériatrique. Ils recevaient tous, pendant 20 jours, par voie orale, soit 10 g de Cit soit un mélange iso-azoté de 6 acides aminés (AAs) non essentiels (AANE). Le turn over protéique corps entier, la vitesse de synthèse fractionnaire de l’albumine (VSFA) et la séquestration splanchnique ont été mesurés le 21ème jour par une technique de dilution isotopique utilisant la 13C-Leucine et la 3D-Leucine, chez des patients à jeun depuis 12 heures et en situation postprandiale. Résultats et Analyse statistique : 24 patients ont terminé l’étude. Il n’y a pas de modification du turn over protéique et de la synthèse protéique corps entier (NOLD). La VSFA n’est pas modifiée. En revanche, il existe une tendance à la diminution de l’extraction splanchnique des AAs chez les patients traités par la Cit (Cit : 45.2 [26.2;58.4], AANE : 60.3 [48.3 ;69.7] en %/j, p

Obesity is frequently associated with type 2 diabetes and cardiovascular diseases, related to metabolic and endocrine dysregulation of white adipose tissue (WAT). During aging, the loss of muscle mass may be associated with obesity and defines the concept of sarcopenic obesity. Treatments implemented to counteract these conditions showed a very partial success. It is therefore appropriate to develop original alternative strategies that could lead to targeted therapies. Our team studies the metabolic regulation of WAT, the major source of energy storage in the body. Non-esterified fatty acids (NEFA) and glycerol are released in the blood from stored triglycerides through lipolysis and used as a source of energy for other tissues. In addition to their β-oxidation, NEFA are re-esterified in part, a process that limits their release in the blood. Glyceroneogenesis is the pathway necessary to NEFA re-esterification in the fasting state. Previous studies showed that administration of citrulline (CIT) for three months to aging rats induced a decrease of approximately 40% of the visceral WAT mass. This non-protein amino acid is given as a dietary supplement during aging or sports to increase muscle mass. We studied the effects of CIT on explant cultures of rat WAT. In the first part of this work, we show that CIT exerts a direct lipolytic and anti-glyceroneogenic effect on explants from rats whether young or old. However, the release of NEFA from the explants of young rats is limited by an increase in the oxidative capacity of the tissue. During aging, WAT mass augments in parallel to the increase in a pro-inflammatory state. To understand the influence of these two parameters regardless of age, we studied in the second part of this work, the effects of CIT on WAT explants from young rats fed a control (CD) or high fat (HFD) diet. We show an CIT-induced increase in lipolysis and beta-oxidative capacity of WAT from rats whatever the diet, while glyceroneogenesis is reduced. However, NEFA are selectively released from WAT of HFD rats, in connection with a drastic reduction of their re-esterification. NO is a mediator of these effects. In the third part of this work, we show that CIT acts directly on WAT from CD and HFD rats to induce the expression of uncoupling protein, UCP1, in line with the potential "browning" of WAT by this amino acid. These effects were not observed in explants from old rats. Altogether our results establish the basis for future investigations aimed at elucidating the mechanisms by which CIT reduces body fat and open new therapeutic perspectives to fight overweight and sarcopenic obesity.; L’obésité s’accompagne de pathologies comme le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires, liées à des dérégulations métaboliques et endocriniennes du tissu adipeux blanc (TAB). Au cours du vieillissement, la perte de masse musculaire peut être associée à l’obésité et définit le concept d’obésité sarcopénique. Les traitements mis en œuvre pour contrecarrer ces pathologies n’ont qu’un succès très partiel. Il est donc opportun de développer des stratégies alternatives originales qui pourraient aboutir à des thérapeutiques ciblées. Notre équipe étudie les régulations métaboliques du TAB, source majeure de stockage de l’énergie de l’organisme. Les triglycérides stockés sont libérés à jeun grâce à la lipolyse qui libère les acides gras non-estérifiés (AGNE) et le glycérol dans le sang, comme source d’énergie des autres tissus. En plus de la β-oxydation des AGNE, leur ré-estérification partielle intervient pour limiter leur libération lors de la lipolyse. La glycéronéogenèse est nécessaire à la ré-estérification en situation de jeûne. Des études préalables ont montré que l'administration de citrulline (CIT) pendant trois mois à des rats vieillissants induit une diminution d’environ 40% de la masse viscérale du TAB. Cet acide aminé non protéique est un complément alimentaire donné au cours du vieillissement ou à des sportifs pour augmenter la masse musculaire. Nous avons étudié les effets de la CIT sur des cultures d’explants de TAB de rats. Dans la première partie de ce travail, nous montrons que la CIT a un effet direct lipolytique et anti-glycéronéogénique sur les explants des rats qu’ils soient jeunes ou âgés. Cependant, la libération des AGNE du TAB des rats jeunes est limitée par une augmentation de la capacité oxydative du tissu. Avec l’âge, la masse du TAB augmente en parallèle à l’augmentation d’un état pro-inflammatoire. Afin de comprendre l’influence de ces deux paramètres indépendamment de l’âge, nous avons étudié dans la deuxième partie de ce travail, les effets de la CIT sur les explants de TAB de rats jeunes soumis à un régime contrôle (CD) ou hyperlipidique (HFD). Nous observons une augmentation, induite par la CIT, de la lipolyse et de la capacité ß-oxydative du TAB des rats quel que soit le régime, alors que la glycéronéogenèse est diminuée. Toutefois, les AGNE sont sélectivement libérés par le TAB de rats HFD, en relation avec une réduction drastique de leur ré-estérification. Le NO est un médiateur de ces effets. Dans une troisième partie, nous démontrons que la CIT agit directement sur le TAB de rats CD et HFD pour induire l'expression de la protéine découplante, UCP1, en lien avec le « brunissement » potentiel du TAB par cet acide aminé. Ces effets ne sont pas observés au sein du TAB des rats âgés. L’ensemble de nos résultats établit les bases pour de futures investigations visant à élucider les mécanismes par lesquels la CIT réduit la masse adipeuse et ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour lutter contre le surpoids et l’obésité sarcopénique.

National audience

National audience

Citrulline is an amino acid that becomes essential in situations of intestinal insufficiency such as short bowel syndrome. It is therefore interesting to provide the patients with dosage forms for routing citrulline to the colon. The aim of this work is to formulate microspheres of citrulline for colonic targeting by the technique of spray drying.Eudragit(®) FS 30D was selected as polymer to encapsulate citrulline using the spray drying technique. Citrulline and Eudragit(®) FS 30D were dissolved in water and ethanol, respectively. The aqueous and the ethanolic solutions were then mixed in 1:2 (v/v) ratio. Microspheres were obtained by nebulizing the citrulline-Eudragit(®) FS 30D solution using a Mini spray dryer equipped with a 0.7mm nozzle. The microspheres have been formulated using citrulline and Eudragit(®) FS 30D. The size distribution of microspheres was determined by light diffraction. The morphology of the microspheres was studied by electron microscopy. Manufacturing yields, encapsulation rate and dissolution profiles were also studied.The microspheres obtained had a spherical shape with a smooth surface and a homogeneous size except for the microspheres containing the highest concentration of polymer (90 %). The formulation showed that the size and morphology of the microspheres are influenced by the polymer concentration. Manufacturing yields were about 51 % but encapsulation rate were always very high (above 90 %). The in vitro dissolution study showed that the use of the Eudragit(®) FS 30D under these conditions is not appropriate to change the dissolution profile of the citrulline.This technique has led to the formulation of microspheres with good physical properties in terms of morphology and size. The compression of the microspheres should help to control citrulline release for colonic targeting.

Major advances have been made in the pathogenesis of rheumatoid arthritis, spondyloarthritis and connective tissue diseases, leading to new biotherapies. In rheumatoid arthritis, the discovery of anti-citrulline antibodies (ACPA, anti-citrullinatedpeptide antibodies), whose specificity is between 95% and 98% and may be present before symptom onset, allowed early diagnosis and provided new pathological insights. Studies of the role of cytokines, B cells and co-stimulation of T cells revealed novel therapeutic targets. TNF inhibitors are effective in spondyloarthritis. In lupusandSjigren'ssyndrome, genes stimulatedby IFNtypel are hyper-expressed, along with BAFF (or BLyS), a B lymphocyte-activating cytokine.

One of the most important pro-inflammatory cytokines in the pathophysiology of rheumatoid arthritis (RA) is interleukin 1 (IL-1). The purpose of this study is to evaluate the association between IL-1B (-511), IL-1 (+3953), IL-1 RN variable number of tandem repeat (VNTR) polymorphisms and the occurrence in Algerian patients with rheumatoid arthritis. We also analyze their correlations with clinical and biological phenotypes.One hundred and forty-seven patients with RA (119 women, 28 men) and 127 controls (70 women, 57 men) were included in the study. The analysis of two polymorphisms of IL-1B-511 and IL-1B+3953 was done by PCR-RFLP. Analysis of IL1-RN VNTR polymorphism was performed by PCR.No significant difference in genotype, allelic and haplotype distribution at the three polymorphisms was observed between RA patients and controls. However, the genotype (T/T) polymorphism of IL-1B-511 is more frequent in the group of patients with positive ACPA compared with negative ACPA group (Pc=0.01, OR=4.65). Moreover, we noted that the haplotype (IL-1RN* 1/IL-1B-511T/IL-1B+3953C) was more frequent (Pc=0.03, OR=2.05) in the positive ACPA group.The association between the allele 1 of IL-1 RN VNTR, T allele of IL1B-511 and C allele of IL1-B +3953 polymorphisms seems to predispose to the synthesis of ACPA and therefore to the occurrence of ACPA positive RA. Further studies with a larger number of patients are needed to define the real role of IL-1 in the susceptibility to or severity of RA.

These last years were especially marked by the best understanding of the physiopathological mechanisms at the onset of rheumatoid arthritis (RA) and in the processes of joint inflammation and joint destruction. RA is more and more considered as a syndrome with at least two clinical entities with different phenotype and profiles: seronegative RA and seropositive RA. In RA with ACPA, it is the process of immunization, that is the immunological reaction against citrullinated peptides, that leads to the disease. The peptide citrullination is directly favored by environmental factors such as tobacco, infection to Porphyromonas gingivalis and alcohol. The immunization supposes a genetic predisposition including approximately 22 genetic factors including the molecules of the major histocompatibility complex (MHC) and PTPN22. Finally, joint damage result at the same time from an excess of destruction (RANK/RANKL, TNFalpha) and from a defect of bone reparation by the way Wnt/Frizzled. It is thanks to the best understanding of RA physiopathology that leads to development of targeted treatments and specially processing for this disease.

Palindromic rheumatism is characterized by episodes of arthritis or para-arthritis leaving no residual or radiographic changes. Several diseases should be ruled out in the differential diagnosis. Evolution to rheumatoid arthritis is common, especially in patient with positive rheumatoid factor and anticitrullinated peptides. In seronegative patients, palindromic rheumatism could be part of the spectrum of autoinflammatory diseases because of a high frequency of MEFV mutations. Treatment remains discussed. The use of antimalarials could delay the development of rheumatoid arthritis or another connective tissue disease.

International audience; Circulating citrulline is emerging as an innovating biomarker candidate for assessment of intestinal function. Amino acid synthesized by enterocytes of intestinal mucosal, citrulline is not included in proteins or nutrition products and is a precursor for production of arginine by the kidney. Plasma citrulline is, in clinical situation, an established biomarker of enterocyte functional metabolic mass (trophicity) in children and in adult patients due to its high relation to active functional small bowel remnant length in intestinal diseases (short bowel, extensive enteropathies, intestinal toxicity of chemotherapy and radiotherapy. Plasma citrulline concentration (30-50 μmol/L), independent of nutritional status, if less than 10 μmol/L can give an objective threshold for nutrition parenteral use in case of intestinal failure due to enterocyte abnormalities or lack. Its regular dosage allows the monitoring of intestinal function except in case of significant renal failure.

Deimination or citrullination, is a post-translational modification with many facets. It is involved in several basic cellular processes, including gene regulation, embryonic development and terminal differentiation, and also in various pathophysiological mechanisms linked to severe human diseases such as multiple sclerosis and rheumatoid arthritis. Deimination, the calcium-dependent enzymatic conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline, induces a decrease in the charge of the modified proteins with major consequences on their conformation, stability and/or interactions, and therefore on their functions. Five isotypes of peptidylarginine deiminases (1-4 and 6), exist in humans with a variable tissue expression. These highly conserved enzymes are closely regulated at transcriptional and post-transcriptional levels, probably including auto-deimination.

Protein-energy malnutrition found in the elderly contributes to muscle decline (sarcopenia and dynapenia)and then to an increased morbi-mortality. Prevention and treatment of malnutrition is difficult due to a resistance to renutrition observed in the elderly; this can be explained by a high splanchnic extraction of amino acids at the post-prandial time, which results in a least stimulation of muscle proteosynthesis. Citrulline is an amino acid that escape splanchnic extraction ans is a stimulating factor for muscle protein synthesis. We showed citrulline improves muscle mass and function (motor activity and maximal tetanic isometric force) in malnourished aged rats. This benefic effect could be partly explained by an overexpression of myofibrillar contractile proteins and a decrease in the expresssion of componants of the proteolysis pathway. Its mecanism of action is still unclear but our data suggest citrulline would reorientates energy metabolism. In addition to these experimental data, we develop a clinical study to evaluate the effect of citrulline on protein metabolism in the malnourished elderly. Then, we could evaluate its effect on muscle function in this population. Citrulline could thus represent an efficient and inovative nutritionnal strategy to limit muscle decline that occurs within ageing; it could also limit morbi-mortality due to protein-energy malnutrition., La dénutrition protéino-énergétique, qui touche une partie de la population âgée, accentue leur déclin musculaire (sarcopénie et dynapénie) et participe donc à l'augmentation de la morbi-mortalité. La prévention et le traitement de la dénutrition s'avèrent difficiles, lié au défaut de réponse à la renutrition observé chez les personnes âgées ; celui-ci est expliqué par une forte extraction splanchnique des acides aminés en période post-prandiale, responsable d'une moindre stimulation de la protéosynthèse musculaire. La citrulline, acide aminé non protéinogène qui échape à la séquestration splanchnique des acides aminés, est un facteur stimulant de la synthèse protéique musculaire. Nous avons montré qu'un apport en citrulline s'accompagne d'une amélioration de la masse et des capacités fonctionnelles musculaires (activité motrice, force musculaire maximale isométrique) chez le rat âgé dénutri. Cet effet bénéfique de la citrulline s'expliquerait, en partie, par une surexpression des protéines contractiles myofibrillaires et une diminution de l'expression d'éléments des voies de dégradation protéique. Son mécanisme d'action reste encore à préciser bien que nos données suggèrent également une réorientation du métabolisme énergétique. En complément de ces données expérimentales, nous développons une étude clinique afin de vérifier les effets bénéfiques de la citrulline sur le métabolisme protéique de la personne âgée dénutrie. Suite à cette étude, nous pourrons réaliser un essai thérapeutique de plus grande ampleur, afin de montrer l'efficacité de la citrulline sur l'amélioration de paramètres reflétant la fonction musculaire. Ainsi, l'administration de citrulline pourrait être une stratégie nutritionnelle efficace et innovante afin de limiter le déclin musculaire survenant au cours du vieillissement. En s'opposant à la dénutrition protéino-énergétique des personnes âgées, elle pourrait retarder l'entrée dans la dépendance, améliorer la qualité de vie et limiter la morbi-mortalité liée à la dynapénie.

Accidental irradiations induce a complex pathological situation, difficult to assess and to treat. However, recent results describing new biological indicators of radiation-induced damages such as Flt3-ligand, citrulline and oxysterol concentration in the plasma, together with results obtained in large animal models of high dose irradiation, allowed a better understanding of pathophysiological mechanisms induced by uncontrolled irradiations. This conducted to leave the classical paradigm of the acute radiation syndrome, described as the association of three individual syndromes, the hematopoietic syndrome, the gastro-intestinal syndrome and the cerebrovascular syndrome, in favour of a multiple organ dysfunction syndrome, with the implication of other organs and systems. Follow-up of victims from two recent radiation accidents brings a confirmation of the usefulness of the newly described biological indicators, and also a partial confirmation of this new concept of a multiple organ dysfunction syndrome. © 2009 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.; Les irradiations accidentelles conduisent à des situations pathologiques complexes, difficiles à évaluer et à traiter. Cependant, des résultats récents ont permis de définir de nouveaux bio-indicateurs de dommages radio-induits comme le Flt3-ligand, la citrulline ou les oxystérols plasmatiques. Par ailleurs, des études sur des modèles animaux ont permis une évolution de la compréhension des mécanismes physiopathologiques des irradiations complexes à forte dose. Cette évolution conduit à abandonner le concept de syndrome aigu d’irradiation comme étant une association de trois syndromes bien individualisés, le syndrome hématopoïétique, le syndrome gastro-intestinal et le syndrome cérébrovasculaire au profit d’un concept de syndrome de dysfonctionnement multi-organes, avec l’implication d’autres systèmes physiologiques. Le suivi des victimes de deux accidents d’irradiation récents a permis de confirmer la validité des nouveaux bio-indicateurs utilisés, mais a apporté aussi un début de confirmation de ce concept de syndrome de dysfonctionnement multi-organes induit par une irradiation accidentelle.

New treatment strategies require that rheumatoid arthritis (RA) be diagnosed as early as possible. New diagnostic markers were required, because rheumatoid factors (RF), until now criteria for classification of RA, are not sufficiently specific and sometimes appear late, thereby limiting their diagnostic usefulness. The objective of this review is to describe the current state of knowledge and more particularly to analyze the interest of new RA autoanti-bodies, called anti-peptide or anti-citrullinated protein anti-bodies (ACPA). Other autoanti-bodies have been described, including anti-Sa, anti-alpha enolase, and anti-calpastatin autoanti-bodies. Nonetheless, their diagnostic value remains limited compared to ACPA. Accordingly, in daily practice today, the only autoanti-bodies that must be tested for to diagnose RA are the ACPAs and RFs. The discovery of ACPA (initially called anti-keratin and anti-perinuclear anti-bodies) was a major step forward for the laboratory diagnosis of RA. The tests most often used routinely areenzyme-linked immunosorbent assays(ELISA) with cyclic citrullinated peptides, whence the name anti-CCP autoanti-bodies. Accordingly, the two terms ACPA and anti-CCP can both be used. The diagnostic value, in particular their specificity, is on the order of 95%, regardless of the method of identification. These markers are very useful and are often present earlier than RF. These ACPA also have prognostic value because they are associated with more aggressive forms of RA. On the other hand, their value over time, in particular, their fluctuation as a function of treatment, is more controversial. In practice, it is recommended to test for both RF and ACPA in a diagnostic work-up for early RA. During follow-up, the value of testing for these autoanti-bodies has not been demonstrated, but additional studies are still necessary with the anti-CCP autoanti-bodies and the new anti-citrullinated protein autoanti-bodies.

The detection of anti-cyclic citrullinated peptides (CCP) antibodies is a new marker for diagnosis of rheumatoid arthritis. We screened 100 patients suffering from rheumatic pathologies or from other affections where rheumatoid factor is frequently detected. The screening was assessed by a second generation ELISA (Immunoscan RA) in comparison with agglutination assay (Latex and Waaler-Rose) and specific ELISA (IgM, IgG and IgA). The sensitivity of the anti-CCP is good (70%) with an excellent specificity (98%). In our study the predictive value of the Immunoscan RA reached 71% and more among patients with joints symptoms. Anti-CCP antibody test could serve as a better diagnosis marker than rheumatoid factor.

In this thesis we demonstrate, for the first time, that plasma venous citrulline -an end derived product of enterocyte metabolisme- concentration is a reliable biomarker for intestinal failure assessment in humans in the following model: short bowel syndrome, villous atrophy syndrome, intestinal transplantation.; L'insuffisance intestinale chronique résulte le plus souvent d'une malabsorption nécessitant une nutrition parentérale pour maintenir l'équilibre nutritionnel. Sa cause habituelle est le syndrome de grêle court (SGC). Dans ce dernier (n=124) nous avons déterminé par analyse actuarielle multidimensionnelle les facteurs de dépendance à la nutrition parentérale et de survie. Nous avons ainsi discriminé l'insuffisance intestinale transitoire et permanente par les césures de longueur de grêle selon le type anatomique et de période adaptative post-résection (2 ans). Notre objectif a ensuite été de déterminer, dans l'insuffisance intestinale, un marqueur biologique de la masse entérocytaire absorptive. Après avoir optimisé chez l'homme sain l'administration digestive des traceurs isotopiques du métabolisme protéique (leucine, glutamine) en démontrant que seule la perfusion duodénale, par rapport à la perfusion gastrique, permettait d'obtenir des résultats reproductibles pour l'état stationnaire et l'extraction splanchnique, nous avons fait l'hypothèse que la citrullinémie, acide aminé non protéique produit du métabolisme entérocytaire de la glutamine, pouvait être un marqueur candidat. En préalable, dans le SGC, nous avons validé une méthode radiologique pour évaluer anatomiquement la masse intestinale et modélisé la masse intestinale fonctionnelle grâce aux bilans d'absorption. Nous avons montré que l'hyperphagie était l'un des facteurs majeurs qui caractérisait ces patients (présente chez 82%) et qu'elle participait à l'expression de l'adaptation intestinale. Nous avons alors, dans le SGC (n=57), pu démontrer que la citrullinémie est un marqueur de la masse entérocytaire du fait : a) de son abaissement par rapport aux contrôles, b) de sa corrélation positive (r=0.83, P

La digestion intestinale des protéines alimentaires fait intervenir des protéases d’origine pancréatique et des peptidases intestinales. Les produits de la digestion sont constitués d’acides aminés libres et de peptides relativement abondants. Acides aminés et peptides sont transportés dans l’entérocyte où ces derniers subissent une hydrolyse. Les acides aminés libres présents dans la veine porte présentent un profil bien différent de celui des protéines alimentaires. En effet, le métabolisme intestinal des acides aminés est très actif. Afin d’assurer la synthèse des protéines constitutives et sécrétées, l’intestin prélève des acides aminés à la fois dans la lumière intestinale et dans le sang artériel. Cet organe renouvelle plus de 50 % de ses protéines par jour et la synthèse de protéines bien particulières comme les mucines engendre des besoins élevés en certains acides aminés comme la thréonine. L’intestin est le principal tissu utilisant la glutamine artérielle et le glutamate alimentaire. Le catabolisme intestinal de ces acides aminés produit de l’alanine, de l’acide aspartique, de la proline et, par l’intermédiaire des enzymes du cycle de l’urée, de l’ornithine, de la citrulline et de l’arginine. Les acides aminés indispensables n’échapperaient pas non plus au catabolisme intestinal. Le rôle de l’intestin ne se limite donc pas à la digestion des protéines et à l’absorption des acides aminés. Son métabolisme modifie profondément la disponibilité des acides aminés alimentaires pour le reste de l’organisme., The digestion of dietary proteins is achieved by several proteolytic enzymes, released by the pancreas and peptidases from the brush border. The products of digestion are composed of free amino acids and peptides. Amino acids and peptides are transported into the enterocytes where the latter are hydrolysed, The profile of amino acids in the portal vein is different from dietary amino acids. Indeed, intestinal metabolism is very active. Both circulating and luminal amino acids are taken up by the intestine in order to ensure the synthesis of constitutive and secreted endogenous proteins. Intestinal protein turnover rate exceeds 50% per day. The synthesis of endogenous proteins (mucins for example) with a specific amino acid composition induces high requirements for some amino acids like threonine. The gastrointestinal tract is the main organ utilising circulating glutamine and dietary glutamate. Catabolism of these amino acids produces alanine, aspartic acid, proline and, via the enzymes of urea cycle, ornithine, citrulline and arginine. Essential amino acids seem to be involved in catabolism in the intestine as well. Finally, the role of the intestine is not limited to protein digestion and amino acid absorption but intestinal metabolism changes dietary amino acid availability to the other extraintestinal tissues.

In this thesis we demonstrate, for the first time, that plasma venous citrulline -an end derived product of enterocyte metabolisme- concentration is a reliable biomarker for intestinal failure assessment in humans in the following model: short bowel syndrome, villous atrophy syndrome, intestinal transplantation., L'insuffisance intestinale chronique résulte le plus souvent d'une malabsorption nécessitant une nutrition parentérale pour maintenir l'équilibre nutritionnel. Sa cause habituelle est le syndrome de grêle court (SGC). Dans ce dernier (n=124) nous avons déterminé par analyse actuarielle multidimensionnelle les facteurs de dépendance à la nutrition parentérale et de survie. Nous avons ainsi discriminé l'insuffisance intestinale transitoire et permanente par les césures de longueur de grêle selon le type anatomique et de période adaptative post-résection (2 ans). Notre objectif a ensuite été de déterminer, dans l'insuffisance intestinale, un marqueur biologique de la masse entérocytaire absorptive. Après avoir optimisé chez l'homme sain l'administration digestive des traceurs isotopiques du métabolisme protéique (leucine, glutamine) en démontrant que seule la perfusion duodénale, par rapport à la perfusion gastrique, permettait d'obtenir des résultats reproductibles pour l'état stationnaire et l'extraction splanchnique, nous avons fait l'hypothèse que la citrullinémie, acide aminé non protéique produit du métabolisme entérocytaire de la glutamine, pouvait être un marqueur candidat. En préalable, dans le SGC, nous avons validé une méthode radiologique pour évaluer anatomiquement la masse intestinale et modélisé la masse intestinale fonctionnelle grâce aux bilans d'absorption. Nous avons montré que l'hyperphagie était l'un des facteurs majeurs qui caractérisait ces patients (présente chez 82%) et qu'elle participait à l'expression de l'adaptation intestinale. Nous avons alors, dans le SGC (n=57), pu démontrer que la citrullinémie est un marqueur de la masse entérocytaire du fait : a) de son abaissement par rapport aux contrôles, b) de sa corrélation positive (r=0.83, P

Citrulline production is demonstrated in murine bone marrow cell cultures incubated with dialyzed secondary MLC supernatant. This synthesis, proceeding from arginine, is induced by a soluble protein factor released during secondary MLC, unstable to heat, with a molecular weight of approximately 150,000 daltons.

Ornithine carbamyl transferase activity was determined by estimation of the citrulline formed during the reaction. Citrulline is estimated by diacetylmonoxime in the presence of thiosemicarbazide. The conditions of enzyme analysis were then studied in buffer veronal-acetate medium at 37 degrees C. The optimum pH for activity depended on the ornithine concentration, but was independent of carbamyl-phosphate concentration. At pH 7.8, ornithine at concentrations higher than 1.6 mM inhibited enzyme activity, ornithine Km was 0.208 mM and that of carbamyl-phosphate was 1.92 mM. The incubation time for determination of OCT activity was 15 minutes. Citrulline production was proportional to the enzyme concentration up to activities of 180 units/l. Serum urea was destroyed by a urease of high quality, so that the formation of citrulline in the control reagents was minimal. Reference values, determined on a hospital population, without liver, heart or pulmonary disease, lay between 4.7 +/- 2.3 units/l. The coefficient of variation of the technique, determined on a pool of serum of moderate activity was 8 units/l i.e. 5.1 per cent.

From day 1 to day 3, the protein intake of this neonate was restricted to 1 g/kg/d. It included a) essential amino acids (i.e. histidine, lysine, threonine, tryptophan), b) arginine (1,000 mg/d), c) alphaketoisovaleric 500 mg/d, alpha-ketoisocaproic (500 mg/d), alphaketobetamethylvaleric (500 mg/d), alphaketogammamethylthiobutyric (200 mg/d), betaphenylpyruvic (400 mg/d) acids. 250 mg/kg/d of sodium benzoate were given. Caloric and water intakes were 120 cal/kg/d and 120 ml/kg/d respectively. Afterwards, this procedure was modified according to clinical and biological data including serum ammonia and amino acid levels. Alpha-ketonic acid absorption and metabolism were studied on day 29. Both were fast. The detection of alloisoleucine, which is not metabolized was the consequence of the use of alphaketobetamethylvaleric acid. Until the age of 21 months, clinical and metabolic status was satisfactory. At this time, repeated seizures without metabolic failure were accompanied by psychomotor damages.