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The presence of pharmaceuticals in environmental waters or plant matrices suppose a challenge for environment preservation, which makes necessary to evaluate, monitor and carry out an environmental diagnosis of the areas affected by pollution in order to know the ecosystems damaged by the presence of pollutants and thus evaluate the consequences of these on living beings. For this reason, this Thesis focuses its study on the effects of pollution on the native flora of the Doñana National Park (Spain), providing qualitative and quantitative data on the effect of pharmacologically active substances (such as emerging contaminants) in three plant species in this area, in addition similar studies are virtually nonexistent. This work aims to increase knowledge about the consequences of anthropogenic pressure in the ecosystem of Doñana National Park, simulating at laboratory scale the presence of pharmaceuticals, their degradation compounds and metabolites, in plant matrices from this natural environment. The antioxidant and enzymatic capacity as well as the identification of inhibitory molecules to the enzymes used in this study were evaluated in a collection of 150 selected plants from Doñana. An analytical procedure using high resolution liquid chromatography with detection of mass spectrometry - flight time has been optimized and validated for the identification and quantification of six active pharmacological principles, carbamazepine, flumequine, ciprofloxacin, enrofloxacin, ibuprofen and diclofenac, in extracts from three plant species: Lavandula dentata, Juncus sp. and Salicornia europaea. An uptake study has been carried out, irrigating the selected plants with aqueous solutions containing variable concentrations of the pharmaceuticals. The samples have been analyzed at 7, 15, 21 and 30 days (end of the assay) and the accumulation of the selected substances have been determined. Additionally, non-targeted analytical techniques using appropriate software (MetabolynxTM) have been applied to data from the samples subjected to the uptake study to identify possible metabolites and degradation products and possible metabolic routes involved. Additionally, some methods were optimized to evaluate antioxidant and inhibitory activities, using different enzymes (tyrosinase, elastase, collagenase and lipoxygenase), in the extracts of a selection of 150 plants from the Doñana National Park. For this purpose, the specimens were extracting using solvents of different polarity and extracting capacity: hexane, ethanol, water: ethanol (1:1, v/v) and ethyl acetate. These methods were applied to evaluate the enzymatic inhibition capacity as well as antioxidant capacity of the extracts., Actualmente, la presencia de sustancias farmacológicas en el agua utilizada para el riego o en las matrices de las plantas es un problema para el medioambiente, siendo cada vez, más necesario evaluar, monitorizar y realizar un diagnostico medioambiental de las zonas afectadas por la contaminación para conocer los ecosistemas dañados por la presencia de los contaminantes y así evaluar la consecuencia de estos en los seres vivos. Por lo tanto, esta tesis centra su estudio en los efectos de la contaminación para aumentar el conocimiento de sus consecuencias sobre la flora autóctona del Parque Nacional de Doñana (España), aportanto datos cualitativos y cuantitativos sobre el efecto de las sustancias farmacológicamente activas (consideradas como contaminantes emergentes) sobre tres especies vegetales típicas de esta región. Prácticamente son inexistentes los estudios que simulan a nivel de laboratorio la presencia de principios activos farmacológicos, sus compuestos de degradación y metabolitos en las matrices de las plantas en este medio natural, evaluando también la capacidad antioxidante y enzimática, así como la identificación de las moléculas inhibidoras de las enzimas utilizadas en este estudio en un conjunto de 150 plantas del mencionado entorno protegido. Se ha optimizado y validado un procedimiento analítico mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección por espectrometría de masas en tiempo de vuelo para la identificación y cuantificación de seis principios activos farmacológicos, carbamazepina, flumequina, ciprofloxacina, enrofloxacina, ibuprofeno y diclofenaco, en extractos de tres especies de plantas, Lavandula dentata y Juncus sp. y Salicornia europaea, especies presentes en diferentes hábitats del Parque Nacional de Doñana. Se ha dieseñado y llevado a cabo una prueba de exposición, regando las plantas seleccionadas con soluciones acuosas que contenían concentraciones variables de productos farmacéuticos. Las muestras se analizaron a los 7, 15, 21 y 30 días (final de la prueba) y se determinó la acumulación de las sustancias seleccionadas. Asimismo, se aplicaron técnicas analíticas no específicas utilizando programas informáticos adecuados (MetabolynxTM) a los datos de las muestras del estudio de absorción para identificar posibles metabolitos y productos de degradación y las vías metabólicas implicadas. Además, se han optimizado algunos métodos para evaluar las actividades antioxidantes e inhibidoras, utilizando diferentes enzimas (tirosinasa, elastasa, colagenasa y lipoxigenasa), en extractos de una selección de 150 especies de plantas recolectadas y presentes en el Parque Nacional de Doñana, y/o su entorno, las muestras se extrajeron utilizando disolventes de diferente polaridad y capacidad de extracción: hexano, etanol, agua: etanol (1:1, v/v) y acetato de etilo. Estos métodos se aplicaron para evaluar la capacidad de inhibición de las enzimas, así como la capacidad antioxidante de los extractos y en muestras seleccionadas a partir de ensayos de exposición, lo que indica, como era de esperar, el aumento de la capacidad inhibitoria de las enzimas en muestras sometidas a altas concentraciones de soluciones de dopantes. Se ha establecido una relación metabólica entre las posibles moléculas bioactivas de extractos de plantas que no están documentadas en la literatura por su actividad inhibidora de enzimas y los inhibidores conocidos de estas enzimas, lo que explica la existencia de actividad inhibidora., Actuellement, la présence de substances pharmacologiques dans l'eau utilisée pour l'irrigation ou dans les matrices végétales est un problème pour l'environnement. En effet, il est de plus en plus nécessaire d’évaluer, surveiller et faire un diagnostic environnemental des zones affectées par la pollution afin de connaître les écosystèmes endommagés par la présence de polluants et ainsi évaluer les conséquences de ceux-ci sur les êtres vivants. Par conséquent, cette thèse se concentre sur les effets de la pollution afin d'accroître la connaissance de ses conséquences sur la flore indigène du Parc National de Doñana (Espagne), en fournissant des données qualitatives et quantitatives sur l'effet des substances pharmacologiquement actives (considérées comme polluants émergents) chez trois espèces de plantes typiques de cette région. De plus, les études, simulant à l'échelle du laboratoire la présence de principes actifs pharmacologiques, de leurs composés de dégradation et de leurs métabolites dans les matrices végétales de cet environnement naturel, évaluant également la capacité antioxydante et enzymatique ainsi que l'identification des molécules inhibitrices des enzymes utilisées dans cette étude dans une collection de 150 plantes du milieu protégé mentionné précédemment sont pratiquement inexistantes. Une procédure analytique a été optimisée et validée par chromatographie liquide à haute performance avec détection par spectrométrie de masse au temps de vol pour l'identification et la quantification de six principes pharmacologiques actifs, carbamazépine, fluméquine, ciprofloxacine, enrofloxacine, ibuprofène et diclofénac, en extraits de trois espèces végétales, Lavandula dentata et Juncus sp. et Salicornia europaea, espèces présentes dans différents habitats du Parc National de Doñana. Un essai d'exposition a été conçu et réalisé, irriguant les plantes sélectionnées avec des solutions aqueuses contenant des concentrations variables de produits pharmaceutiques. Les échantillons ont été analysés à 7, 15, 21 et 30 jours (fin du test) et l'accumulation des substances sélectionnées a été déterminée. De plus, des techniques d'analyse non ciblées à l'aide d'un logiciel approprié (MetaboLynxTM) ont été appliquées aux données des échantillons soumis à l'étude d'absorption afin d'identifier les métabolites et les produits de dégradation possibles et les voies métaboliques en cause. En outre, certaines méthodes ont été optimisées pour évaluer les activités antioxydantes et inhibitrices, en utilisant différentes enzymes (tyrosinase, élastase, collagénase et lipoxygénase), dans les extraits d'une sélection de 150 espèces végétales collectées et présentes dans le Parc National de Doñana, et/ou leur environnement, les échantillons ont été extraits à l'aide de solvants de polarité et de capacité d'extraction différentes : hexane, éthanol, eau : éthanol (1:1, v/v) et acétate d'éthyle. Ces méthodes ont été appliquées pour évaluer la capacité d'inhibition enzymatique ainsi que la capacité antioxydante des extraits et dans des échantillons choisis parmi les tests d'exposition indiquant comme prévu l'augmentation de la capacité inhibitrice des enzymes dans les échantillons soumis à de fortes concentrations de solutions dopantes. Une relation métabolique a été établie entre les molécules bioactives possibles d'extraits végétaux qui ne sont pas documentées dans la littérature pour leur activité d'inhibition enzymatique et les inhibiteurs connus de ces enzymes, expliquant ainsi l'existence d'une activité inhibitrice.

The phytochemical study of Armeria maritima and Helichrysum stoechas led to the isolation of 31 molecules never reported before in the genus Armeria, 4 of which being new flavonol diglycosides, and to the development of a dereplication strategy for the study of H. stoechas. In both species, an abundance of polyphenols was observed, which could be extracted with eco-friendly methods like SFE. Both halophytes showed a strong biological potential as their extracts and molecules demonstrated antioxidant, anti-collagenase, anti-inflammatory and wound healing activities. Moreover, we initiated for the first time cell suspensions of A. maritima, and identified elicitors, such as methyl-jasmonate, which led to H. stoechas cell suspensions with an increased content in 3,5-dicaffeoylquinic acid, a bio-marker of anti-inflammatory activity. The production of bioactive molecules in "plant cell factories" could be scaled-up to enhance the valorization potential of both halophytes in dermocosmetics., L'étude phytochimique d'Armeria maritima et d'Helichrysum stoechas a permis d'isoler pour la première fois 31 molécules dans le genre Armeria dont 4 nouveaux flavonols diglycosylés, ainsi que le développement d'une stratégie de déréplication pour l'étude d'H. stoechas. Dans les deux espèces, nous avons relevé une richesse en polyphénols, qui pourraient être extraits par des techniques respectueuses de l'environnement comme la SFE. En parallèle, ces deux halophytes ont montré un fort potentiel biologique avec des extraits et des molécules dotés d'activités anti-oxydante, anti-collagénase, anti-inflammatoire ou encore cicatrisante. De plus, nous avons initié pour la première fois des suspensions cellulaires d'A. maritima et identifié des éliciteurs comme le méthyl jasmonate permettant d’augmenter dans les cellules d'H. stoechas la teneur en acide 3,5-dicaféoylquinique, un bio-marqueur de l'activité anti-inflammatoire. La production de molécules bioactives dans des cultures végétales in vitro pourrait par la suite être transposée à plus grande échelle, afin d’amplifier le potentiel de valorisation de ces deux halophytes en dermo-cosmétique.

The phytochemical study of Armeria maritima and Helichrysum stoechas led to the isolation of 31 molecules never reported before in the genus Armeria, 4 of which being new flavonol diglycosides, and to the development of a dereplication strategy for the study of H. stoechas. In both species, an abundance of polyphenols was observed, which could be extracted with eco-friendly methods like SFE. Both halophytes showed a strong biological potential as their extracts and molecules demonstrated antioxidant, anti-collagenase, anti-inflammatory and wound healing activities. Moreover, we initiated for the first time cell suspensions of A. maritima, and identified elicitors, such as methyl-jasmonate, which led to H. stoechas cell suspensions with an increased content in 3,5-dicaffeoylquinic acid, a bio-marker of anti-inflammatory activity. The production of bioactive molecules in "plant cell factories" could be scaled-up to enhance the valorization potential of both halophytes in dermocosmetics.; L'étude phytochimique d'Armeria maritima et d'Helichrysum stoechas a permis d'isoler pour la première fois 31 molécules dans le genre Armeria dont 4 nouveaux flavonols diglycosylés, ainsi que le développement d'une stratégie de déréplication pour l'étude d'H. stoechas. Dans les deux espèces, nous avons relevé une richesse en polyphénols, qui pourraient être extraits par des techniques respectueuses de l'environnement comme la SFE. En parallèle, ces deux halophytes ont montré un fort potentiel biologique avec des extraits et des molécules dotés d'activités anti-oxydante, anti-collagénase, anti-inflammatoire ou encore cicatrisante. De plus, nous avons initié pour la première fois des suspensions cellulaires d'A. maritima et identifié des éliciteurs comme le méthyl jasmonate permettant d’augmenter dans les cellules d'H. stoechas la teneur en acide 3,5-dicaféoylquinique, un bio-marqueur de l'activité anti-inflammatoire. La production de molécules bioactives dans des cultures végétales in vitro pourrait par la suite être transposée à plus grande échelle, afin d’amplifier le potentiel de valorisation de ces deux halophytes en dermo-cosmétique.

La dégradation protéolytique du collagène de type II est considérée comme étant un facteur majeur dans le processus irréversible de dégradation de la matrice cartilagineuse lors d’ostéoarthrose. Outre les collagénases de la famille des métaloprotéinases de la matrice (MMP-1, -8, -13), la cathepsine K est parmi les seules enzymes susceptibles de dégrader la triple hélice intacte du collagène de type II, devenant ainsi un élément pertinent pour les recherches sur l’ostéoarthrose. L’objectif à court terme de notre étude consiste en l’identification et la caractérisation de sites de clivage spécifiques de la cathepsine K sur le collagène de type II équin. La technique d’électrophorèse SDS-PAGE 1D permet la visualisation des produits de digestion et la validation des résultats de la caractérisation moléculaire des fragments protéolytiques. La caractérisation est réalisée en combinant la digestion trypsique précédant l’analyse HPLC-ESI/MS. Les résultats ont permis d’établir les sites, présents sur la carte peptidique de la molécule de collagène de type II équin, des 48 résidus prolines (P) et 5 résidus lysines (K) supportant une modification post-traductionnelle. De plus, 6 fragments majeurs, différents de ceux produits par les MMPs, sont observés par SDS-PAGE 1D puis confirmés par HPLC-ESI/MS, correspondant aux sites suivants : F1 [G189-K190], F2 [G252-P253], F3 [P326-G327], F4 [P428-G429], F5 [P563-G564] et F6 [P824-G825]. Le fragment F1 nouvellement identifié suggère un site de clivage différent de l’étude antérieure sur le collagène de type II bovin et humain. L’objectif à long terme serait le développement d’anticorps spécifiques au site identifié, permettant de suivre l’activité protéolytique de la cathepsine K par immunohistochimie et ÉLISA, dans le cadre du diagnostic de l’ostéoarthrose., The proteolytic degradation of type II collagen is believed to be mainly an irreversible event in the process of cartilage matrix degradation in osteoarthritis. Cathepsin K is the most active enzyme protease outside the matrix metalloproteinase (MMP) family (MMP 13, -8, -1) capable of degrading the intact triple helical type II collagen. The short term objective of our study was to characterize the specific cleavage sites of CK on type II collagen. Our long term goal is to develop antibodies specific to these sites to develop biomarkers to detect it’s cleavage, for the early diagnosis of OA. Thus, in order to achieve our first goal, Cathepsin K cleavage of equine type II collagen was first examined by SDS-PAGE electrophoresis. Molecular characterization of proteolytic fragments, and therefore cleavage sites, was performed using tryptic digestion followed by LC-ESI/MS analysis to establish a comprehensive peptide map which was used as a template to identify specific proteolytic cleavage by cathepsin K. Comprehensive peptide mapping provided information on post-translational modifications and permitted the identification of 48 proline (P) and 5 lysine (K) residues that were subject to post translational modification. Six major fragments were observed on 1D SDS-PAGE and confirmed by HPLC-ESI/MS including F1 [189-190], F2 [252-253], F3 [326-327], F4 [428-429], F5 [563-564] and F6 [824-825]. The observed F1 fragment showed that cleavage was three residues N-terminal to the site reported previously for bovine type II collagen. These new findings will be used to develop new analytical methods to quantify biomarkers associate to equine type II collagen degradation in osteoarthritis patient and/or to support the development of new treatments.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

The present study was undertaken to provide further information on lipogenesis in isolated adipocytes from the subcutaneous adipose tissue of fattening steers. The main aims were to compare different incubation media and to clarify the effects of fetal bovine serum (FBS) on lipogenesis and substrate oxidation rate in the adipocytes. The isolated adipocytes were prepared by the collagenase digestion technique. The changes in cellularity, the incorporation rates of acetate or glucose into lipid molecules, and the oxidation rates to CO2 both in fresh and preincubated adipocytes were measured in different media. It was shown that FBS increased significantly both lipogenesis and the oxidation rates of glucose or acetate in the fresh adipocytes but insulin did not. In isolated adipocytes preincubated for 24 and 48 h, the cellularity, the incorporation rate of glucose into lipid molecules, and the oxidation rates of glucose or acetate to CO2 were not different to those in fresh adipocytes, but the incorporation rate of acetate into lipid molecules was significantly lower.

Isolation and characterization of two subunits from structural glycoproteins of rabbit dermis Structural glycoproteins have been extracted by 8 M urea from the insoluble residue remaining after collagenase digestion of rabbit dermis and purified by Sepharose 4 B chromatography. After reduction and alkylation, Dowex 1 × 2 chromatography allowed separation of two structural glycoproteins (D 1 and D 2 ) in homogenous state as shown by chromatographic and electrophoretic behaviour as well as N terminal amino acid determination. These two glycoproteins have a molecular weight of about 16 000. Their amino acid compositions (very similar), are characterized by a high level of dicarboxylic amino acids and the absence of hydroxyproline and hydroxylysine. The less acidic glycoprotein (D 1 ) has glycine for N terminal amino acid and contains 10.4 percent of bound carbohydrates. The glycoprotein D 2 contains 5.1 percent of bound carbohydrates and its N terminal amino acid is glutamic acid.