La télomérase est un facteur clé dans la tumorigénèse vu son rôle dans le maintien de l’intégrité chromosomique. Cet enzyme est une ribonucléoprotéine constituée d’un ARN non-codant (hTR), qui contient la séquence matrice pour la synthèse des télomères et qui agit comme squelette pour l’assemblage des sous-unités protéiques. Parmi ceux-ci, nous retrouvons particulièrement la protéine hTERT, la sous-unité catalytique qui possède l’activité rétrotranscriptase. L’activité de cet enzyme est principalement déterminée par sa maturation ainsi que par son recrutement aux télomères. Au cours de ce processus, la télomérase interagit avec plusieurs effecteurs dont la coordination, bien qu’importante, demeure peu comprise. Suite à la transcription de l’ARN non-codant hTR, la maturation de la télomérase s’effectuerait en partie au nucléole. La télomérase serait ensuite transportée aux corps de Cajal (CB) pour terminer la biogénèse du complexe. Il a été proposé que la protéine TCAB1 jouerait un rôle à cette étape. Enfin, le recrutement de la télomérase mature aux télomères est modulé par son interaction avec le complexe shelterin présent aux télomères. Des études ont montré que la protéine POT1, qui interagit avec la partie simple-brin du télomère et inhibe le recrutement de la télomérase aux télomères, est mutée dans certains cancers présentant une élongation anormale des télomères. Bien qu’il soit proposé que l’assemblage des sous-unités hTERT et hTR s’effectuerait aux CB, il n’y a pas de consensus sur l’enchainement des étapes qui conduisent à cet assemblage. Une fois la télomérase assemblée, son accès aux télomères est contrôlé, notamment par la protéine POT1. Des mutations de POT1, tel que K90E, sont observées dans des cancers, mais l’impact de telles mutations sur l’accès de la télomérase aux télomères reste inconnu. Deux hypothèses ont donc été posées : 1) Une étape dans la maturation de la télomérase est favorisée au niveau du nucléole par la liaison de hTR à TCAB1, qui permettrait son trafic du nucléole vers les CB. 2) La mutation K90E dans POT1 augmenterait le recrutement de la télomérase aux télomères. Notre laboratoire a développé un système qui permet de marquer l’ARN hTR avec la GFP de manière à permettre l’imagerie de molécules unique en temps réel dans les cellules et ainsi étudier les interactions de la télomérase avec différents effecteurs. Dans ce projet, un pipeline d’analyse d’image, DCTracker, a été développé pour automatiser l’analyse d’image. 1) Des expériences de microscopie en temps réel sur cellules vivantes permettront d’observer les changements dans le recrutement de hTR aux télomères lorsque POT1 présente la mutation K90E identifiée dans certains cancers par rapport à POT1 sauvage. 2) TCAB1, fusionné à un HaloTag, sera marqué par Janelia Fluor 646 et de l’imagerie sur un microscope à haute résolution par la méthode HiLo sera faite pour détecter les molécules uniques de hTR et TCAB1, et évaluer leur colocalisation dans le nucléole et aux CB. Les résultats obtenus ont montré une différence dans le recrutement de hTR aux télomères lorsque POT1 présente la mutation ponctuelle K90E. Aussi, il a été possible d’imager et de localiser des particules uniques de TCAB1 dans le noyau des cellules à l’étude. D’une part, ces résultats ont permis de suggérer qu’une partie de la biogénèse de la télomérase se déroule au nucléole, et d’autre part ils ont permis d’identifier l’importance de la lysine 90 de POT1 dans la répression du recrutement de la télomérase aux télomères., Telomerase is a key enzyme in tumorigenesis due to its role in maintaining chromosomal integrity. This enzyme is a ribonucleoprotein complex consisting of a non-coding RNA (hTR), which contains the template sequence for telomere synthesis, and which acts as a backbone for the assembly of protein subunits. Among these, we particularly find the hTERT protein, the catalytic subunit which possesses the reverse transcriptase activity. The activity of this enzyme is mainly determined by its maturation as well as by its recruitment to telomeres. During this process, telomerase interacts with several effectors which coordination, although important, remains poorly understood. Following transcription of hTR, telomerase maturation takes place partly at the nucleolus. Telomerase would then be transported to the Cajal bodies (CB) to complete its biogenesis. It has been proposed that the protein TCAB1 plays a role at this step. Finally, the recruitment of mature telomerase to telomeres is modulated by its interaction with the shelterin complex present at telomeres. Studies have shown that the protein POT1, which interacts with the single-stranded extremity of the telomere and inhibits telomerase recruitment to telomeres, is mutated in some cancers with abnormal telomere elongation. Although it is proposed that the assembly of the hTERT subunits and hTR would take place at the CBs, there is no consensus on the different steps that lead to this assembly. Once telomerase is assembled, its access to the telomeres is controlled by members of the Shelterin complex, including POT1. POT1 mutations, such as K90E, are observed in several cancers, but the impact of such mutations on telomerase access to telomeres remains unknown. We hypothesized that: 1) A step in telomerase maturation is promoted in the nucleolus by the binding of hTR to TCAB1, which would allow its trafficking to CBs. 2) The K90E mutation in POT1 would increase telomerase recruitment to telomeres. Our laboratory has developed a system that allows the labeling of hTR RNA with GFP in order to perform imaging of single molecules of hTR in real time in living cells and thus study the interactions of telomerase with different effectors. In this project, we also developed a data analysis pipeline (DCTracker) to automatize the image analysis.1) Real-time microscopy experiments on live cells will allow us to observe the changes in the recruitment of hTR to telomeres when POT1 has the K90E mutation identified in certain cancers compared to the wild type. 2) TCAB1, fused to a HaloTag, will be labeled with JaneliaFluor 646 and imaged on a high-resolution Hilo microscope to detect single molecules of hTR and TCAB1, and assess their colocalization in the nucleolus and CBs. Our results revealed an increased recruitment of hTR at telomeres when POT1 presents the point mutant K90E. Also, we were able to image and localize single particle of TCAB1 in the nucleus of the cells. These results suggest that part of the biogenesis of telomerase takes place in the nucleolus, and they underline the role of lysine 90 of POT1 in the repression of telomerase recruitment to telomeres.