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Hydroxymethylfurfural (HMF) wird als eine der wichtigsten bio-basierten Plattformchemikalien angesehen. Ziel der Arbeit ist ein Verfahren zur Gewinnung von HMF auf Basis von Lignocellulosen in Wasser zu entwickeln. Lignocellulosen, das heißt Holz oder Halmgüter, bestehen aus einem komplexen Verbund von Lignin, Hemicellulosen und Cellulose. Dieser komplexe Verbund muss zunächst aufgeschlossen werden, denn nur Hexosen, die in Cellulose und Hemicellulosen vorhanden sind, können als Ausgangsmaterial für HMF dienen (vgl. Abbildung 0.1). Die zweite Herausforderung besteht darin, dass Cellulose ein Polymer der Glucose, und nicht der Fructose, ist. Ein Blick in die Literatur zeigt, dass Glucose nur sehr langsam, möglicherweise nur über die Isomerisierung zu Fructose, zu HMF reagiert. Glucose sollte folglich zunächst in Fructose umgewandelt werden. Zunächst wurde der säurekatalysierte Aufschluss von Hölzern in einer halbkontinuierlichen Laboranlage untersucht. Die Cellulose wird bei 180 °C mit 0,05 mol/l H2SO4 nur langsam zu Glucose hydrolysiert. Bei 200 °C ist die Cellulose nach knapp 2 h vollständig abreagiert und bei 220 °C verkürzt sich dies auf 40 min. Die Hemicellulosen sind ohne Zugabe eines Katalysators unter hydrothermalen Bedingungen bei 180 °C noch größtenteils stabil, werden bei 220 °C aber hydrolysiert. Die Ausbeute von Glucose beim Aufschluss mit 0,05 mol/l H2SO4 erreicht nach 40 min Reaktionszeit bei einer mittleren Hydrolysetemperatur von 200 °C den höchsten Wert. Die Ausbeute ist bei 180 °C niedriger, während bei 220 °C Glucose in Folgereaktionen abgebaut wird. So steigen beispielsweise die Ausbeuten an Lävulinsäure und Ameisensäure an. Durch die Vorbehandlung von Holz mittels Steam-Explosion sollte die Zugänglichkeit der Cellulose-Fasern erhöht werden, damit die Hydrolyse der Cellulose zu Glucose in kürzerer Reaktionszeit abläuft. Trotz einer „Aufsprengung“ der Macrofibrillen in der Lignocellulosen-Struktur durch die Steam-Explosion kam es nicht zu einer Erhöhung der Hydrolysegeschwindigkeit der Cellulose. Bei der Isomerisierung von Glucose wurden die besten Fructoseausbeuten mit dem heterogenen Katalysator Hydrotalkit erzielt. In Parameterstudien mit reinen Glucose-Lösungen unter pH-neutralen Bedingungen wurden 25 Ma.-% Fructoseausbeute bei 38 Ma.-% Glucoseumsatz erreicht (Massenverhältnis von Hydrotalkit zu Glucose von 0,2 bei 90 °C für 60 min). Durch vorherige Neutralisation der sauren Produktflüssigkeit aus dem Aufschluss ist es gelungen, säurekatalysierte Nebenreaktionen der Glucose, welche während der Isomerisierung ablaufen, drastisch zu reduzieren. Bei der Neutralisation fallen nur geringe Mengen an organischen Verbindungen aus. Allerdings ist als Neutralisationsmittel NaOH gegenüber Ba(OH)2 zu favorisieren, denn es werden nach NaOH-Neutralisation höhere Fructoseausbeuten bei der Isomerisierung erhalten (16 Ma.-% Fructoseausbeute, 32 Ma.-% Glucoseumsatz). Für eine technische Realisierung der HMF-Synthese aus Hexose-Zuckern sind moderate Reaktions-bedingungen zu wählen, bei denen die Summe der Nebenprodukte möglichst gering ist. Dies können beispielsweise 200 °C und 14 min bei Katalyse mit 0,005 mol/l Schwefelsäure sein. Durch eine numerische Optimierung werden die Geschwindigkeitskonstanten eines Reaktionsmodells von Zuckern zu HMF bestimmt. Dieses Modell liefert einen Einblick in die Bildung der nicht charakterisierten Nebenprodukte. Diese Nebenprodukte entstehen laut der Kinetik vor allem ausgehend von HMF und weniger direkt von den Monosacchariden. Es wurden zwei Machbarkeitsstudien für die Teilschritte (1) Lignocellulosen zu Zuckern sowie (2) Zucker zu HMF einer hydrothermalen Bioraffinerie durchgeführt. Für die erste Machbarkeitsstudie zum Aufschluss von Lignocellulosen zu Zuckern bilden die Rohstoffkosten für Holz den größten Kostenposten. Hexosen sind nicht wirtschaftlich aus Lignocellulosen herstellbar, wenn sie das einzige Wertprodukt des Prozesses sind, insbesondere wenn der Vergleich mit dem Import von Zuckern wie Saccharose gezogen wird. Eine Vermarktung der Ligninfraktion ist dabei für eine wirtschaftliche Bioraffinerie unerlässlich. In einer zweiten Machbarkeitsstudie wurde die Herstellung von HMF aus Saccharose untersucht, wobei ein Kreisprozess inklusive Abtrennung von HMF projektiert wurde. Bei den hier bestimmten HMF-Herstellungskosten von 4,30 €/kgHMF sind die beiden größten Posten die Eduktkosten sowie die Energiekosten. Erst danach folgen die Abschreibungskosten für die Anlage.

Der Einsatz diätetischer Lignocellulose bei Geflügel wurde bisher nur in wenigen Studien und mit uneinheitlichen Auswirkungen auf die Tierleistung, die Nährstoffverdaulichkeiten und die Zusammensetzung der intestinalen Mikrobiota beschrieben. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss einer höheren Dosierung von diätetischer Lignocellulose in isoenergetisch und isonitrogen gestalteten Diäten auf zootechnische, verdauungsphysiologische und mikrobiologische Parameter zu untersuchen. Dafür wurden 59 männliche Hühner einer langsam wachenden Kreuzungspopulation (WL77 – White Leghorn und NHI – New Hampshire) in drei Versuchsgruppen aufgeteilt und über einen Zeitraum von acht Wochen mit einem Futter mit 0,8, 5 und 10 % supplementierter Lignocellulose (ARBOCEL® RC Fine) gefüttert. Der Fütterungsversuch unterteilte sich dabei in eine 5-wöchige Adaptations- und eine 23-tägige Versuchsphase. Futter und Wasser standen durchgehend ad libitum zur Verfügung. Zootechnische Parameter wurden wöchentlich erhoben und die Digestaproben aus Ileum und Zäkum in der 13. LW entnommen. Zusätzlich wurden über die letzten 12 Tage des Versuchszeitraums täglich Exkremente gesammelt. Die daraus ermittelten Daten umfassten die Bestimmung der scheinbaren präzäkalen Verdaulichkeit des Rohproteins, der scheinbaren gesamten Verdaulichkeit des Rohfetts und der organischen Masse, die TS-Gehalte der Exkremente und die Analysen der bakteriellen Metaboliten sowie die Zusammensetzung und metabolische Aktivität ausgewählter Bakterien-Cluster. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse oder dem Kruskal-Wallis-Test. Ein Einfluss der eingesetzten Diäten auf die Leistung der Tiere konnte nicht festgestellt werden. So zeigten sich weder bei der Lebendmasse, der Lebendmassezunahme, dem Futterverbrauch noch beim Futteraufwand Veränderungen zwischen den Versuchsgruppen. Die scheinbare präzäkale Verdaulichkeit des Rohproteins reduzierte sich deutlich bei 10 % supplementierter Lignocellulose gegenüber der Versuchsgruppe mit 0,8 und 5 %. Die Werte der scheinbaren Gesamtverdaulichkeit des Rohfetts zeigten keine Veränderungen bei steigendem Gehalt von Lignocellulose in der Ration. Deutliche Unterschiede zwischen allen drei Versuchsgruppen wurden jedoch bei der scheinbaren gesamten Verdaulichkeit der organischen Masse dokumentiert. Diese sank bei höheren Zulagen von Lignocellulose im Futter. Es konnten keine Gruppenunterschiede zwischen den TS-Gehalten der Exkremente festgestellt werden. Ein Vergleich der bakteriellen Stoffwechselmetaboliten in der Digesta des Zäkums zeigte eine Abnahme der ermittelten Konzentrationen bei steigendem Gehalt von diätetischer Lignocellulose. Die deutlichsten Konzentrationsveränderungen ließen sich dabei in der Versuchsgruppe mit 10 % Lignocellulose beobachten. Signifikante Auswirkungen auf die Zusammensetzung und metabolische Aktivität der bakteriellen Mikrobiota konnten bei der Quantifizierung des Escherichia/Hafnia/Shigella-Clusters ermittelt werden. Mit zunehmender Konzentration von Lignocellulose sanken die gemessenen Zellzahlen in der Zäkumdigesta. Die ebenfalls gesunkenen Werte der ermittelten rRNA-Kopien beschrieben einen gerichteten Trend und deuteten dabei zusätzlich auf eine verringerte Stoffwechselaktivität hin. Schlussfolgernd zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Studie, dass höhere Konzentrationen von Lignocellulose die scheinbare präzäkale Verdaulichkeit von Protein, die mikrobiellen Stoffwechselmetaboliten in der Digesta und die Zusammensetzung und Aktivität des bakteriellen Mikrobioms beeinflussen können. Lignocellulose könnte zudem einen Einfluss auf potenzielle Krankheitserreger im Darm haben, welcher in weiteren Studien untersucht werden sollte., The use of dietary lignocellulose in poultry has been described in only few studies and with inconsistent effects on animal performance, nutrient digestibility and the composition of the intestinal microbiota. The aim of this study was to investigate the influence of higher dosages of dietary lignocellulose in isoenergetically and isonitrogenically designed diets on zootechnical, digestive and microbiological parameters. For this purpose, 59 male chickens of a slow-growing poultry cross-breeding population (WL77 - White Leghorn and NHI - New Hampshire) were divided into three experimental groups and were fed a diet containing 0.8, 5 and 10 % lignocellulose (ARBOCEL® RC Fine) over a period of eight weeks. The feeding trial was divided into a 5-week adaptation phase and a 23-day trial phase. Feed and water were continuously available ad libitum. Zootechnical parameters were recorded weekly and digesta samples from ileum and caecum were taken in the 13th week. Additionally, excrements were collected daily over the last 12 days of the experimental period. The resulting data included not only the determination of the apparent precaecal digestibility of crude protein and the apparent total digestibility of crude fat and organic matter, but also analyses of bacterial metabolites and the composition and metabolic activity of selected bacterial clusters. Statistical evaluation of the results was performed by means of single factor analysis of variance or the Kruskal-Wallis test. An influence of the diets used on the performance of the animals could not be determined. Neither the live mass, live mass gain, feed consumption nor feed expenditure showed changes between the experimental groups. The apparent precaecal digestibility of the crude protein was significantly decreased with 10 % supplemented lignocellulose compared to the experimental group with 0.8 and 5 %. The values of the apparent total digestibility of crude fat showed no changes with increasing contents of lignocellulose in the ration. Significant differences between all three experimental groups were documented in the apparent total digestibility of the organic mass. This parameter decreased with increasing supplements of lignocellulose in the diet. There were no group differences between dry matter contents of the excrements observed. A comparison of the bacterial metabolites in the caecal digesta showed a decrease of the analysed concentrations with increasing content of dietary lignocellulose. The most significant changes in concentration were observed in the experimental group with 10 % lignocellulose. Significant effects on the composition and metabolic activity of the bacterial microbiota were detected in the quantification of the Escherichia/Hafnia/Shigella cluster. With increasing concentration of lignocellulose the measured cell numbers in the caecal digesta decreased. The also decreased values of the determined rRNA copies described a directed trend and additionally indicated a reduced metabolic activity. In conclusion, the results of the present study show that higher concentrations of lignocellulose can influence the apparent precaecal digestibility of protein, the microbial metabolites in the digesta and the composition and activity of the bacterial microbiome. In addition, lignocellulose could have an impact on potential pathogens in the intestine, which should be investigated in further studies.

Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte am Beispiel von Weizenstroh die Entwicklung und Optimierung eines Prozesses zur Produktion von Bioethanol. Die Synergie aus effizienter Vorbehandlung mit NaOH, Reaktortyp (Freifallmischer) und einem effizienten Enzymkomplex aus Penicillium verruculosum ermöglichte die Herstellung von bis zu 13 Vol.-% Ethanol. Die Hydrolyse und Fermentation wurden simultan durchgeführt (SSF-Prozess), woraus eine Vermeidung der Produktinhibierung sowie eine Erhöhung der Ethanolproduktivität um 94 % resultierten. Eine in situ-Ethanolentfernung mittels Stripping gewährleistete einen kontinuierlichen SSF-Prozess und ermöglichte die Folgekonversion des Bioethanols mittels katalytischer Dehydratisierung zu Bioethylen. Dadurch wurde eine Wertsteigerung des Ethanols erzielt und eine energie- und kostenintensive Abtrennung, Reinigung und Konzentrierung des Ethanols umgangen. Außerdem gelang eine Übertragung des Prozesses zur Ethanolproduktion vom Labormaßstab (2 L) in den Technikumsmaßstab (200 L). Auch die Anwendung auf andere Biomassen (Miscanthus, Luzerne) sowie Rohstoffe (Weizenkleie) wurde erfolgreich gezeigt.

Am Fraunhofer-Institut für Holzforschung, WKI wurde ein Holzschaum auf Basis von Lignocellulosen entwickelt. Dieser Schaum besteht zu 100 % aus Holz und bedarf keines Zusatzes an Bindemitteln bzw. Klebstoffen, da holzeigene Bindungskräfte die Festigkeit des Schaums bewirken. Eine mögliche gesundheitliche Belastung durch Emissionen aus Klebstoffen ist daher nicht gegeben. Das Ergebnis dieser Entwicklung ist ein leichter Grundwerkstoff mit einer porösen, offenzelligen Struktur, einer hohen Festigkeit und einer niedrigen Rohdichte. Schäume können gezielt in einem Dichtebereich zwischen 50 kg/m³ und 200kg/m³ hergestellt werden. Holzschäume sind aus ökologischer und ökonomischer Sicht für eine Vielzahl von Einsatzbereichen interessant.

Die weltweite Kunststoffproduktion steigt stetig an, und gleichzeitig nimmt auch die Herstellung biobasierter Kunststoffe immer weiter zu. Neben bekannteren Biokunststoffen wird nun auch zunehmend Lignin als Rohstoff für Basischemikalien und die Herstellung wertvoller polymerer Werkstoffe eingesetzt. Lignin besteht aus einer Mischung aus drei verschiedenen Zimtalkoholen, die in pflanzlichen Geweben zwischen Cellulose und Hemicellulose eingelagert und zu Polymeren verknüpft werden. Das bisher eher als Abfallstoff betrachtete Lignin wird aus dem Zellwandmaterial verholzter Pflanzen, der Lignocellulose, gewonnen. Diese wird vor allem in der Papierherstellung als Rohstoffquelle für Cellulose und Hemicellulose benötigt. Lignin kann bis zu 30% der Biomasse einer Pflanze ausmachen, wobei die chemische Struktur des Polymers von Pflanze zu Pflanze variiert. Zur Isolierung von Lignin aus Lignocellulose wurden verschiedene industrielle und laborbasierte Aufschlussmethoden entwickelt, da die Monomere des Lignins eine interessante Quelle biobasierter aromatischer Grundchemikalien wie Benzol, Toluol und Xylol darstellen. Derzeit werden solche Chemikalien fast ausschließlich aus Kohle und Erdöl durch thermische oder katalytische Prozesse in Kokereien und Raffinerien gewonnen. Der Artikel zeigt die bekanntesten Verfahren zur Isolierung von Lignin auf, sowie dessen aktuelle und zukünftige Verwendungsmöglichkeiten.

erstellt von: Sandra Burger Mit englischer Zusammenfassung Universität für Bodenkultur Wien, Masterarbeit, 2016

Ausgehend von der bestehenden Idee eines Lignocelluloseaufschlusses in einem alkalischen Polyol (Alkaline Polyol Pulping = AlkaPolP) wurden im Rahmen dieser Arbeit ein Aufschlussprozess für Lignocellulosen in alkalischem Glycerin sowie die nachgeschaltete Aufbereitung der Produktströme entwickelt und gezeigt, dass diese den Ausgangspunkt eines vielversprechenden Bioraffineriekonzeptes bilden können. Es wurde nachgewiesen, dass der AlkaPolP-Prozess für alle Arten von Lignocellulose geeignet ist und diese innerhalb weniger Minuten nahezu vollständig delignifiziert. Im Rahmen des Downstream Processings der Aufschlussprodukte wurden die enzymatische Hydrolyse des Zellstoffes, die Ligninfällung sowie die Aufreinigung des Ligninfiltrates genauer untersucht. Ein Vergleich mit Literaturdaten anderer Verfahren zur Lignocellulosefraktionierung zeigte, dass mit dem AlkaPolP-Prozess mindestens ähnliche Produktausbeuten und -qualitäten erreicht werden. Vor allem für den Aufschluss von widerstandsfähigem Nadelholz ist der AlkaPolP-Prozess den meisten anderen Verfahren deutlich überlegen. Nach der Konstruktion und Fertigung eines Reaktionsextruders wurden Betriebsbedingungen gefunden, mit denen Nadelholzschnitzel über mehrere Stunden hinweg in einem stabilen kontinuierlichen Prozess effektiv in alkalischem Glycerin aufgeschlossen werden konnten. Auf der Grundlage von Literaturdaten und der durchgeführten Experimente wurde ein Gesamtprozess entworfen, der neben bereits untersuchten Verfahrensstufen auch eine Aufarbeitung des Ligninfiltrates durch eine Elektrodialyse und mehrere Destillationsschritte umfasst und eine Regeneration der Einsatzstoffe sowie eine Abtrennung der während des Aufschlusses gebildeten Carbonsäuren ermöglicht. Die Ergebnisse dieser Arbeit bilden den Grundstein für die Weiterentwicklung des AlkaPolP-Prozesses. Es konnte gezeigt werden, dass dieser, im kontinuierlichen Betrieb durchführbare und für alle Arten von Lignocellulose geeignete, Aufschlussprozess einen vielversprechenden Ausgangspunkt für ein nachhaltiges Bioraffineriekonzept darstellt. Arising from the idea of a pulping process in an alkaline polyol (Alkaline Polyol Pulping = AlkaPolP) a lignocellulose pulping process in alkaline glycerol as well as the downstream processing of the product streams have been developed. It is shown that this process can be the basis of a promising biorefinery concept. Moreover, it was proven that the AlkaPolP process is applicable to all types of lignocellulose providing an almost complete delignification within a few minutes. As parts of the downstream processing the enzymatic hydrolysis of the pulp fraction, the lignin precipitation as well as the treatment of the lignin filtrate were investigated. In comparison to other lignocellulose fractionation processes described in literature, the AlkaPolP process provides at least similar product yields and qualities. Especially when resistant softwood is used as raw material the AlkaPolP process outmatches most of the other processes. After designing and assembling a reaction extruder process conditions were found at which the fractionation of softwood chips in alkaline glycerol could be performed as a stable continuous process for several hours. Based on experimental results and literature data an integrated process was designed. This biorefinery concept includes downstream processes which applicability had already been confirmed by experiments as well as the further processing of the lignin filtrate by electrodialysis and reactive distillation. In this way the applied chemicals can be regenerated and reused. Additionally, carboxylic acids are recovered as further product fraction of the process. The results presented here form the basis for the further development of the AlkaPolP process. It was shown, that this process can be performed continuously and applied to all types of lignocellulose. Therefore, the AlkaPolP represents a promising basis of a sustainable biorefinery concept.

Der Weißfäulepilz Pleurotus sapidus (PSA) sekretiert zahlreiche Enzyme, darunter ligninolytische Redoxenzyme und Hydrolasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die codierenden DNA-Sequenzen einer Arylalkoholoxidase (AAO), einer Peroxidase vom DyP-Typ (DyP) und einer GDS(L)-Lipase aus dem Sekretom von PSA mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken kloniert und sequenziert. Die Arylalkoholoxidase wurde heterolog in E. coli exprimiert. Da das Enzym hauptsächlich in inclusion bodies abgelagert wurde, wurden mehrere Strategien angewandt, um aktives Enzym direkt in löslicher Form oder durch Rückfaltung aus den inclusion bodies zu gewinnen. Die Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Maltose-Bindeprotein führte bei der Expression zu geringen Mengen löslichem, aber dennoch inaktivem Protein. Durch die Koexpression der Arylalkoholoxidase mit Chaperonen bei niedrigen Temperaturen wurden geringe Mengen des Proteins funktionell produziert. Mit den untersuchten Expressionssystemen wurden keine ausreichenden Mengen lösliche, aktive AAO gewonnen. Daher wurde das Enzym schließlich aus inclusion bodies durch Denaturierung gewonnen und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Das solubilisierte Enzym wurde in vitro durch blitzartige Verdünnung (flash dilution) in Rückfaltungspuffer renaturiert. Dabei wurden Aktivitätsausbeuten von ~190 U L-1 erzielt. Die rückgefaltete, gereinigte AAO (AAO*) wurde biochemisch charakterisiert sowie pH- und Temperatur-Optima bestimmt. Daneben wurden die kinetischen Parameter (Km und kcat) sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für verschiedene Substrate (Benzyl-, p-Anis-, Veratryl- und Zimtalkohol)bestimmt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine DyP-Typ Peroxidase aus einer Pleurotus-Art heterolog expimiert. Die rekombinante Produktion erfolgte durch die Firma AB Enzymes in Trichoderma reesei. Für die Reinigung der DyP aus dem Kulturüberstand wurde eine FPLC-Methode etabliert. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert und dessen kinetische Parameter für verschiedene Substrate bestimmt. Die rPsaDyP besitzt ein N-terminales Signalpeptid mit einer Länge von 62 Aminosäuren, das reife Enzym besteht somit aus 453 Aminosäuren. Das Enzym hat – vergleichbar zu anderen Peroxidasen dieser Familie – ein pH-Optimum im sauren Bereich und ist bei diesen Bedingungen über mehrere Stunden stabil. Der pI ist jedoch außergewöhnlich hoch und liegt im neutralen Bereich. Die rPsaDyP wird abhängig vom Substrat durch Wasserstoffperoxid bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen inhibiert. Die Analyse mittels Blue Native PAGE und Aktivitätsfärbung mit ABTS zeigte, ebenso wie die Gelfiltrationschromatographie, dass das aktive Enzym als Dimer (115 kDa) vorliegt. Die Untersuchung des Substratspektrums zeigte, dass das rekombinant produzierte Enzym neben einigen klassischen Peroxidase-Substraten auch natürliche Xanthophyllfarbstoffe abbaut. b-Carotin wurde durch die rPsaDyP in An- und Abwesenheit von H2O2 abgebaut, wobei die Enzymaktivität durch den Zusatz von H2O2 gesteigert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die rPsaDyP neben der Peroxidase auch eine Oxidasefunktion besitzt. Die rPsaDyP kann aufgrund ihrer hohen Affinität zu dem Anthrachinonfarbstoff RB5, einem charakteristischen Substrat der DyP-Typ Peroxidasen, auch funktionell diesen Peroxidasen zugeordnet werden. Aus den biochemischen und kinetischen Charakteristika der rekombinanten Arylalkoholoxidase und der rPsaDyP wurden Bedingungen für den Einsatz beider Enzyme in einem System abgeleitet. Die beiden Enzyme wurden kinetisch aufeinander abgestimmt und ein Zwei-Enzym-System etabliert. Dabei wurde das von der Arylalkoholoxidase bei der Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrumaldehyd produzierte H2O2 von der Peroxidase verbraucht. Die untersuchten Modell-Verbindungen wurden im Zwei-Enzym-System effizient umgesetzt. Der Einsatz des Zwei-Enzym-Systems im Labormaßstab zur Oxidation von Ligninkomponenten und zur Bleichung von mit Annatto gefärbter Molke verlief erfolgreich. Die in Trichoderma reesei exprimierte GDS(L)-Lipase (in Kooperation mit AB Enzymes) aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus zeigt nur sehr geringe Homologien zu bereits charakterisierten Lipasen/Esterasen. Die katalytischen Eigenschaften des Enzyms wurden bestimmt und die Substratspezifität des Enzyms in Abhängigkeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester ermittelt. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit längeren Acyl-Ketten kann das Enzym funktionell den Lipasen zugeordnet werden. Untersuchungen der Hydrolyse von Ferulasäuremethylester und Ferulasäureestern von Polysacchariden zeigten eine geringe Umsetzung dieser Substrate. Daher ist die Art der Beteiligung dieser sekretierten Lipase am Abbau von Lignocellulosen noch unklar. Eine Esterase aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus wurde in Hansenula polymorpha heterolog in unlöslicher Form exprimiert. Durch denaturierende Solubilisierung und Rückfaltung wurde kein aktives Enzym gewonnen. The basidiomycete Pleurotus sapidus (PSA) secretes numerous enzymes, comprising ligninolytic redox enzymes and various types of hydrolases. The coding DNA sequences of an aryl-alcohol oxidase (AAO), a dyp-type peroxidase (DyP) and a GDSL-like lipase from the secretome of PSA were cloned from cDNA libraries and sequenced. Heterologous expression of the aryl-alcohol oxidase in E. coli led to a high level production of recombinant protein mainly in inclusion bodies. Several strategies were used to obtain the protein in a soluble, biologically active form directly or by refolding from inclusion bodies. The expression as fusion protein with maltose-binding protein (MBP), which promotes solubility, resulted in small amounts of soluble, but inactive protein. By coexpression with chaperones at low temperatures small amounts of protein were functionally expressed. Due to the low yield of active protein, the enzyme was extracted from inclusion bodies by denaturation and purified by affinity chromatography. Functional AAO (AAO*) was prepared by refolding of the solubilized enzyme in vitro by flush dilution in refolding buffer. An activity yield up to 190 U L-1 was obtained. The AAO* was characterized and the kinetic constants for different substrates were determined. For the first time, a dyp type peroxidase from a Pleurotus species was expressed heterologously. The enzyme was recombinantly produced in Trichoderma reesei by the company AB Enzymes. A method for purification of the rPsaDyP from culture supernatant of Trichoderma reesei was established. The enzyme was biochemically characterized and the kinetic parameters were determined. The rPsaDyP has an N-terminal signal peptide with a length of 62 amino acids. The mature enzyme is thus composed of 453 amino acids. The enzyme was comparable to other peroxidases of this family, relating to optimum pH in the acidic range and the stability at these conditions. However, the pI is exceptionally high. The enzyme is inhibited by hydrogen peroxide at relatively low concentrations, depending on the substrate used. Analysis by Blue Native PAGE and activity staining with ABTS, as well as gel filtration chromatography, showed the native dimeric state of the enzyme (115 kDa). Analysis of the substrate range revealed that the recombinant enzyme degrades, in addition to some classic peroxidase substrates, also natural xanthophylls. b-carotene was degraded in the presence and absence of H2O2 by the rPsaDyP, although the enzyme activity was increased by the addition of H2O2. This indicates that the rPsaDyP has an oxidase function in addition to a peroxidase activity. Considering the high affinity to the specific substrate – the anthraquinone dye RB5 – the rPsaDyP belongs also functionally to the dyp-type peroxidase family. Based on the biochemical and kinetic characteristics of the recombinant aryl-alcohol oxidase and the rPsaDyP, conditions for the application of both enzymes in one system were derived. The two enzymes were kinetically adjusted to each other and a two-enzyme system was established. Here, the H2O2 produced by the AAO by oxidation of veratryl alcohol to veratraldehyde was used by the peroxidase, and the investigated model compounds were efficiently transformed in the two-enzyme system. The two-enzyme system was successfully used on laboratory scale for the oxidation of lignocellulosic compounds (2,6-Dimethoxyphenole) and bleaching of annatto coloured whey. The GDSL-like lipase from the secretome of Pleurotus sapidus expressed in Trichoderma reesei (in cooperation with AB Enzymes) shows only weak homologies to previously characterized lipases/esterases. The catalytic properties and the substrate specificity of the enzyme, depending on the acyl chain length of various p-nitrophenyl esters have been determined. Given the higher activity towards longer acyl chains, the enzyme belongs to the lipases. Studies of the hydrolysis of methyl ferulate and feruloylated carbohydrates showed a low conversion of these substrates. Consequently, the role of the secreted lipase in the degradation of lignocellulose is still unclear. An esterase from the secretome of Pleurotus sapidus was expressed in Hansenula polymorpha heterologously in an insoluble form. Enzymatic activity was not obtained by denaturing Solubilisation and refolding.

Der Weißfäulepilz Pleurotus sapidus (PSA) sekretiert zahlreiche Enzyme, darunter ligninolytische Redoxenzyme und Hydrolasen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die codierenden DNA-Sequenzen einer Arylalkoholoxidase (AAO), einer Peroxidase vom DyP-Typ (DyP) und einer GDS(L)-Lipase aus dem Sekretom von PSA mit Hilfe von cDNA-Bibliotheken kloniert und sequenziert.Die Arylalkoholoxidase wurde heterolog in E. coli exprimiert. Da das Enzym hauptsächlich in inclusion bodies abgelagert wurde, wurden mehrere Strategien angewandt, um aktives Enzym direkt in löslicher Form oder durch Rückfaltung aus den inclusion bodies zu gewinnen. Die Fusion mit dem löslichkeitsfördernden Maltose-Bindeprotein führte bei der Expression zu geringen Mengen löslichem, aber dennoch inaktivem Protein. Durch die Koexpression der Arylalkoholoxidase mit Chaperonen bei niedrigen Temperaturen wurden geringe Mengen des Proteins funktionell produziert. Mit den untersuchten Expressionssystemen wurden keine ausreichenden Mengen lösliche, aktive AAO gewonnen. Daher wurde das Enzym schließlich aus inclusion bodies durch Denaturierung gewonnen und mittels Affinitätschromatographie gereinigt. Das solubilisierte Enzym wurde in vitro durch blitzartige Verdünnung (flash dilution) in Rückfaltungspuffer renaturiert. Dabei wurden Aktivitätsausbeuten von ~190 U L-1 erzielt. Die rückgefaltete, gereinigte AAO (AAO*) wurde biochemisch charakterisiert sowie pH- und Temperatur-Optima bestimmt. Daneben wurden die kinetischen Parameter (Km und kcat) sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für verschiedene Substrate (Benzyl-, p-Anis-, Veratryl- und Zimtalkohol)bestimmt.Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine DyP-Typ Peroxidase aus einer Pleurotus-Art heterolog expimiert. Die rekombinante Produktion erfolgte durch die Firma AB Enzymes in Trichoderma reesei. Für die Reinigung der DyP aus dem Kulturüberstand wurde eine FPLC-Methode etabliert. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert und dessen kinetische Parameter für verschiedene Substrate bestimmt. Die rPsaDyP besitzt ein N-terminales Signalpeptid mit einer Länge von 62 Aminosäuren, das reife Enzym besteht somit aus 453 Aminosäuren. Das Enzym hat vergleichbar zu anderen Peroxidasen dieser Familie ein pH-Optimum im sauren Bereich und ist bei diesen Bedingungen über mehrere Stunden stabil. Der pI ist jedoch außergewöhnlich hoch und liegt im neutralen Bereich. Die rPsaDyP wird abhängig vom Substrat durch Wasserstoffperoxid bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen inhibiert. Die Analysemittels Blue Native PAGE und Aktivitätsfärbung mit ABTS zeigte, ebenso wie die Gelfiltrationschromatographie, dass das aktive Enzym als Dimer (115 kDa) vorliegt. Die Untersuchung des Substratspektrums zeigte, dass das rekombinant produzierte Enzym neben einigen klassischen Peroxidase-Substraten auch natürliche Xanthophyllfarbstoffe abbaut. b-Carotin wurde durch die rPsaDyP in An- und Abwesenheit von H2O2 abgebaut, wobei die Enzymaktivität durch den Zusatz von H2O2 gesteigert wurde. Dies deutet darauf hin, dass die rPsaDyP neben der Peroxidase auch eine Oxidasefunktion besitzt. Die rPsaDyP kann aufgrund ihrer hohen Affinität zu dem Anthrachinonfarbstoff RB5, einem charakteristischen Substrat der DyP-Typ Peroxidasen, auch funktionell diesen Peroxidasen zugeordnet werden. Aus den biochemischen und kinetischen Charakteristika der rekombinanten Arylalkoholoxidase und der rPsaDyP wurden Bedingungen für den Einsatz beider Enzyme in einem System abgeleitet. Die beiden Enzyme wurden kinetisch aufeinander abgestimmt und ein Zwei-Enzym-System etabliert. Dabei wurde das von der Arylalkoholoxidase bei der Oxidation von Veratrylalkohol zu Veratrumaldehyd produzierte H2O2 von der Peroxidase verbraucht. Die untersuchten Modell-Verbindungen wurden im Zwei-Enzym-System effizient umgesetzt. Der Einsatz des Zwei-Enzym-Systems im Labormaßstab zur Oxidation von Ligninkomponenten und zur Bleichung von mit Annatto gefärbter Molke verlief erfolgreich. Die in Trichoderma reesei exprimierte GDS(L)-Lipase (in Kooperation mit AB Enzymes) aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus zeigt nur sehr geringe Homologien zu bereits charakterisierten Lipasen/Esterasen. Die katalytischen Eigenschaften des Enzyms wurden bestimmt und die Substratspezifität des Enzyms in Abhängigkeit von der Acyl-Kettenlänge verschiedener p-Nitrophenylester ermittelt. Aufgrund der höheren Aktivität gegenüber Substraten mit längeren Acyl-Ketten kann das Enzym funktionell den Lipasen zugeordnet werden. Untersuchungen der Hydrolyse von Ferulasäuremethylester und Ferulasäureestern von Polysacchariden zeigten eine geringe Umsetzung dieser Substrate. Daher ist die Art der Beteiligung dieser sekretierten Lipase am Abbau von Lignocellulosen noch unklar.Eine Esterase aus dem Sekretom von Pleurotus sapidus wurde in Hansenula polymorpha heterolog in unlöslicher Form exprimiert. Durch denaturierende Solubilisierung und Rückfaltung wurde kein aktives Enzym gewonnen., The basidiomycete Pleurotus sapidus (PSA) secretes numerous enzymes, comprising ligninolytic redox enzymes and various types of hydrolases. The coding DNA sequences of an aryl-alcohol oxidase (AAO), a dyp-type peroxidase (DyP) and a GDSL-like lipase from the secretome of PSA were cloned from cDNA libraries and sequenced.Heterologous expression of the aryl-alcohol oxidase in E. coli led to a high level production of recombinant protein mainly in inclusion bodies. Several strategies were used to obtain the protein in a soluble, biologically active form directly or by refolding from inclusion bodies. The expression as fusion protein with maltose-binding protein (MBP), which promotes solubility, resulted in small amounts of soluble, but inactive protein. By coexpression with chaperones at low temperatures small amounts of protein were functionally expressed. Due to the low yield of active protein, the enzyme was extracted from inclusion bodies by denaturation and purified by affinity chromatography. Functional AAO (AAO*) was prepared by refolding of the solubilized enzyme in vitro by flush dilution in refolding buffer. An activity yield up to 190 U L-1 was obtained. The AAO* was characterized and the kinetic constants for different substrates were determined. For the first time, a dyp type peroxidase from a Pleurotus species was expressed heterologously. The enzyme was recombinantly produced in Trichoderma reesei by the company AB Enzymes. A method for purification of the rPsaDyP from culture supernatant of Trichoderma reesei was established. The enzyme was biochemically characterized and the kinetic parameters were determined. The rPsaDyP has an N-terminal signal peptide with a length of 62 amino acids. The mature enzyme is thus composed of 453 amino acids. The enzyme was comparable to other peroxidases of this family, relating to optimum pH in the acidic range and the stability at these conditions. However, the pI is exceptionally high. The enzyme is inhibited by hydrogen peroxide at relatively low concentrations, depending on the substrate used. Analysis by Blue Native PAGE and activity staining with ABTS, as well as gel filtration chromatography, showed the native dimeric state of the enzyme (115 kDa). Analysis of the substrate range revealed that the recombinant enzyme degrades, in addition to some classic peroxidase substrates, also natural xanthophylls. b-carotene was degraded in the presence and absence of H2O2 by the rPsaDyP, although the enzyme activity was increased by the addition of H2O2. This indicates that the rPsaDyP has an oxidase function in addition to a peroxidase activity. Considering the high affinity to the specific substrate the anthraquinone dye RB5 the rPsaDyP belongs also functionally to the dyp-type peroxidase family.Based on the biochemical and kinetic characteristics of the recombinant aryl-alcohol oxidase and the rPsaDyP, conditions for the application of both enzymes in one system were derived. The two enzymes were kinetically adjusted to each other and a two-enzyme system was established. Here, the H2O2 produced by the AAO by oxidation of veratryl alcohol to veratraldehyde was used by the peroxidase, and the investigated model compounds were efficiently transformed in the two-enzyme system. The two-enzyme system was successfully used on laboratory scale for the oxidation of lignocellulosic compounds (2,6-Dimethoxyphenole) and bleaching of annatto coloured whey.The GDSL-like lipase from the secretome of Pleurotus sapidus expressed in Trichoderma reesei (in cooperation with AB Enzymes) shows only weak homologies to previously characterized lipases/esterases. The catalytic properties and the substrate specificity of the enzyme, depending on the acyl chain length of various p-nitrophenyl esters have been determined. Given the higher activity towards longer acyl chains, the enzyme belongs to the lipases. Studies of the hydrolysisof methyl ferulate and feruloylated carbohydrates showed a low conversion of these substrates. Consequently, the role of the secreted lipase in the degradation of lignocellulose is still unclear.An esterase from the secretome of Pleurotus sapidus was expressed in Hansenula polymorpha heterologously in an insoluble form. Enzymatic activity was not obtained by denaturing Solubilisation and refolding.

Diagramme, Illustrationen

In den Pflanzenzellwänden befindliche Polysaccharide stehen dem Prozess nur bedingt als Energiequelle zur Verfügung, da diese in einem Komplex mit Lignin verknüpft sind. Um diese Substanzen für den Biogasprozess verfügbar zu machen und demnach den Substratumsatz bzw. die Prozesseffizienz zu erhöhen, sind geeignete Stoffe oder Techniken einzusetzen bzw. zu entwickeln. In dieser Arbeit wurde zielführend der Einsatz von unterschiedlichen Enzympräparaten in drei verschiedenen Prozessstufen bei ausgewählten Energiepflanzen mit variierender Häcksellänge untersucht. Anhand von Enzymaktivitätsbestimmungen konnten Enzympräparate für die einzelnen Stufen selektiert werden. Die ausgewählten Enzyme wurden einzeln oder in Mischung während der Silierung, direkt vor dem Biogasprozess sowie während des Biogasprozesses zum Substrat dotiert und dieses nach der jeweiligen Vorbehandlung in Batch-Gärtests vergoren. Neben der Biogas- und Methanausbeute wurde zur Bewertung der Enzymleistung der Abbau an Lignocellulose sowie die Freisetzung an niedermolekularen Kohlenhydraten ermittelt. Zusätzlich wurde das Quellen der Lignocellulose mit Hilfe eines Wasserzusatzes in Form einer Vorhydrolyse als Vorbehandlungsmethode mit allgemein positivem Ergebnis geprüft. Das Ziel der verbesserten Substratumsetzung bei Mais und Roggen und folglich einer Erhöhung der Biogasproduktion wurde durch den Zusatz ausgewählter Enzympräparate erreicht. Es konnten Grundlagen bezüglich der Wirkung von Enzymen in Biogasprozessen geschaffen werden, anhand derer deutlich wurde, dass besonders die enzymatische Behandlung in den der Methanisierung vorgelagerten Prozessstufen weiterzuentwickeln ist. Polysaccharides of plant cell walls are of limited digestibility due to their cross-linking to lignin. In order to make the molecules available for the biogas process and thus increase the substrate utilization and process efficiency appropriate substances or techniques are needed. It was therefore the aim of this work to investigate the effects of different enzyme preparations in three digestion process stages. Selected energy plants with varying degrees of particle sizes (chopping lengths) were used as digester feedstock. Enzyme preparations for the different process stages were chosen by enzyme assays. The selected enzymes were added to the feedstock during the ensiling, directly before the biogas process or during the biogas process separate or in mixtures. Pre-treated substrates were subsequently digested in batch fermentation tests. Beside the biogas and methane yield the degradation degree of lignocellulose and the release of low molecular carbohydrates were investigated for evaluating the enzyme performance. Additionally, the swelling of lignocellulose caused by addition of water in a pre-hydrolysis process was examined as a method of pre-treatment, with generally positive results. The aim of an improved substrate conversion of maize and rye and thus an enhanced biogas production by enzymatic pretreatments was achieved. Scientific fundamentals regarding the impact of enzymes on biogas processes were established. Enzymatic pretreatments in process steps before methanation showed potential for further developments.

Mit einer polyvalenten Peroxidase wurde ein Schlüsselenzym des Lignocelluloseabbaus aus Kulturen des Basidiomyceten Pleurotus sapidus chromatographisch gereinigt. Nach einer dreistufigen Reinigung wurde das Enzym mit einem Reinigungsfaktor von 130 aus dem Überstand einer Submerskultur isoliert. Die Aktivitätsoptima wurden für die Substrate b,b-Carotin, ABTS, Syringol und Veratrylalkohol ebenso bestimmt wie die Wechselzahlen und katalytischen Konstanten. In Zusammenarbeit mit der Firma Artes Biotechnology GmbH wurde ein Hansenula polymorpha Stamm generiert, welcher die für die polyvalente Peroxidase aus Pleurotus sapidus kodierende cDNA enthielt. Das Enzym wurde heterolog exprimiert und die Aktivitätsoptima des rekombinanten Enzyms ermittelt. Anschließend wurde der Abbau der Substrate Rapsstroh und „Rückstand einer Biogasanlage“ durch den Basidiomyceten Pleurotus sapidus untersucht. Dazu wurde die Gesamtheit der sekretierten Enzyme (das Sekretom) von Pleurotus sapidus in Submers- und Emerskulturen analysiert. Photometrisch bestimmt wurden die Aktivitätsverläufe von Laccasen, Esterasen, Lipasen, Cellulasen, Xylanasen und Peroxidasen, insbesondere von Manganperoxidasen und polyvalenten Peroxidasen. Das Sekretom von Pleurotus sapidus wurde anschließend mittels zweidimensionaler Elektrophorese getrennt, massenspektrometrisch identifiziert und bioinformatisch ausgewertet. Verschiedene Substrate wurden mit gereinigten Enzympräparationen und Kulturüberständen von Pleurotus sapidus umgesetzt. Hierbei wurde die Umsetzung von Ligninmodellsubstanzen wie zum Beispiel Coniferyl- und Veratrylalkohol, aber auch von Lignin organosolv und feingemahlenem Rapsstroh durch die gereinigte polyvalente Peroxidase aus Pleurotus sapidus gezeigt. Ebenso wurde ein Umsatz von feingemahlenem Rapsstroh mit Pleurotus sapidus Submerskulturen nachgewiesen. Die Versuche wurden analytisch durch photometrische Bestimmungen (Glucose- und Phenolgehalt), Messung der Partikelgrößenverteilungen und HPLC-/HPSEC-Messungen ausgewertet. With a versatile peroxidase, a key enzyme of the degradation of lignocelluloses was purified by chromatographic methods from submers cultures of the basidiomycete Pleurotus sapidus. After three steps, the enzyme was isolated with a purification factor of 130. Optimal reaction conditions were determined together with turnover numbers and product formation rates for the substrates: b,b-carotene, ABTS, syringol, and veratryl alcohol. In cooperation with Artes® Biotochnology, a Hansenula polymorpha strain was generated containing the cDNA encoding the versatile peroxidase of Pleurotus sapidus. The enzyme was expressed heterologously, and pH and temperature optima were determined for the recombinant enzyme. The degradation of the lignocelluloses rape straw and residues from a biogas plant by Pleurotus sapidus were studied. Therefore, the entirety of enzymes (“the secretome“) secreted by Pleurotus sapidus in submerged and surface cultures were analysed. The activities of laccases, esterases, lipases, cellulases, xylanases, and peroxidases, in particular manganese peroxidases and versatile peroxidases were calculated by photometric assays. The secretome of Pleurotus sapidus was separated by two-dimensional electrophoresis and identified by mass spectrometry. A bioinformatic analysis of the data was performed. In-vitro digestions of various substrates were carried out with the isolated versatile peroxidase and culture supernatants of Pleurotus sapidus. The conversion of various low molecular weight lignin model substances like coniferyl alcohol or veratryl alcohol, finely ground rape straw and lignin organosolv were investigated. The conversion of finely ground rape straw was demonstrated with submerged cultures of Pleurotus sapidus. The product analysis was performed by photometric assays, determination of particle size distribution, and HPLC-/HPSEC analysis.

Ill., graph. Darst.

Ill., graph. Darst.

Ill., graph. Darst