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Der universelle intrazelluläre second messenger, cyclisches 3‘,5‘-Adenosinmonophosphat (cAMP), wird durch die Enzymgruppe der Adenylatcyclasen (ACn) gebildet. In Mammalia liegen neun von zehn Adenylatcyclase (AC) Isoformen als membrangebundene Proteine vor. Die Regulation dieser Enzyme aufgrund extrazellulärer Signale erfolgt indirekt über eigenständige Transmembranrezeptoren, i.d.R. G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). In der Vergangenheit wurde für den Membrananker der ACn, der bis zu 40 % des Proteins umfasst, trotz einer evolutionären Konservierung von mehr als 400 Millionen Jahren, bisher keine eindeutige physiologische Funktion identifiziert. Des Weiteren zeigen die hexahelikalen Membrandomänen der ACn eine strukturelle Ähnlichkeit zu hexahelikalen Rezeptordomänen bakterieller Quorum sensing (QS) Systeme. Dies deutet auf eine bisher unbekannte physiologische Funktion des Membranankers der ACn hin. Der Austausch eines bakteriellen AC-Membranankers durch die Rezeptordomäne des QS Systems zeigte eine Stimulierung der Aktivität der entstandenen Chimäre durch den Liganden und bestätigt die Übertragung eines extrazellulären Signals auf die intrazelluläre katalytische Domäne. Ein zusätzlicher stark konservierter Sequenzabschnitt der ACn, das Cyclase-Transducer-Element (CTE), ist für die erfolgreiche Signalübermittlung essenziell. Dies lässt eine Rezeptorfunktion für bisher unbekannte Liganden vermuten. Der Austausch beider hexahelikaler Membrananker der humanen AC (hAC) Isoform 2 ergab eine Regulation der Gsα induzierten Stimulation durch den QS-Liganden. Hier zeige ich, dass sowohl Humanes Serum (HS) als auch Fötales Rinderserum (FBS) die Gsα-stimulierte Mammalia AC-Aktivität konzentrationsabhängig hemmt. Dies bestätigt i) die erfolgreiche Signaltransduktion und ii) suggeriert die Existenz bisher unbekannter AC-Liganden im Serum. Für die Charakterisierung der Liganden wurde das Serum auf unterschiedliche Stoffklassen untersucht. Verschieden aufgearbeitetes Rinderserum zeigte, dass Bestandteile des Immunsystems als mögliche Liganden nicht in Frage kommen. Eine chromatographische Auftrennung der Serumproteine und die anschließende Proteomanalyse deutete einige Proteine als potenzielle Liganden an. Eine Regulierung der AC-Aktivität durch diese Proteine blieb auch in Gegenwart von Gsα aus und zeigte, dass die Liganden keine Proteine sind. Die Extraktion des Serums mit polaren Lösungsmitteln bei saurem pH überführte die hemmenden Komponenten in die organische Phase. Dies favorisiert stark saure Lipide als Liganden. Die zukünftige Identifizierung von Lipiden als extrazelluläre Liganden der ACn würde eine Rezeptorfunktion der hAC Membrananker bestätigen. Damit eröffnet sich eine neue Dimension der Regulation von ACn und der Bildung des universellen second messengers cAMP, sowie der damit verbundenen Stoffwechselwege.

Class III adenylate cyclases are important transmitters for external signals into the intracellular second messenger cAMP. According to sequence similarities, they are classified into four distinct classes, IIIa-d. Among them, the classes IIIa and IIIb stand out the most not only for being present in both prokaryotic and eukaryotic cells but also for carrying a large hexahelical membrane anchor with a potential regulatory function. Previous work on membrane-bound adenylate cyclases has indicated the ability to perceive extracellular signals through the similarly structured quorum sensors CqsS and LqsS from V. harveyi and L. pneumophila. However, a possible regulatory mechanism by the membrane anchors has not been defined yet. One of 26 cyclases from S. meliloti, CyaCSm, shows a noteworthy similarity to succinate:quinone oxidoreductases regarding its membrane anchor. It is a monomer consisting of one 6TM domain, a ferredoxin domain, and a catalytic domain. According to UV-Vis measurements, four highly conserved histidine residues are binding two heme B molecules as a prosthetic group in the first four α-helices of the membrane anchor. Hence, specifically replacing these residues by alanine demonstrated that these histidines are responsible for binding of heme B. Subsequently, in vivo and in vitro measurements of these mutants indicated a significant decrease in AC activity. The hypothesis of AC regulation by the quinone Q0 and its reduced counterpart Q0H2 has been confirmed in this work. Experiments have shown a nearly threefold increase in cyclase activity under reduced (addition of Q0H2) to oxidized (addition of Q0) conditions. The formation of cAMP in mammalian cells is mainly regulated by GPCRs through the binding of the dissociated G protein subunit Gsα to the intracellular catalytic dimer. So far, direct regulation by an extracellular ligand for these adenylate cyclases has not been shown. First in vitro experiments on the effect of several hormones and neurotransmitters on the human adenylate cyclase isoform 5 showed no significant changes in the amount of produced cAMP after activation with Gsα. Only the addition of heat-inactivated human serum resulted in a significant inhibition of the Gsα-stimulated cyclase. This observation not only indicated the structural ability of the catalytic domains to recognize external signals, but also emphasizes the existence of a ligand in blood serum. The identification of ligands provides the basis for future research.

The formation of glycerol-3-phosphate (G3P) in cells growing on tryptone broth causes catabolite repression as shown by the reduction of malT expression. For this repression to occure the general protein of the PEP-dependent phosphotransferase system (PTS), in particular EIIAGlc, as well as the adenylate cyclase and the cAMP/CRP system have to be present. In contrast to the effect of glucose that causes a dramatic shift of the EIIAGlc level to the dephosphorylated form, G3P only slightly increases the amount of dephosphorylated EIIAGlc. A mutant carrying a C-terminal deletion in adenylate cyclase was no longer subject to G3P-mediated catabolite repression. The conclusion of this is that the stimulation of adenylate cyclase by phosphorylated EIIAGlc is controlled by G3P, as well as by other sugar phosphates like glucose-6-phosphate. Further metabolism of these compounds is not necessary for repression.There is also a translational repression which is independent of cAMP/CRP and EIIAGlc, but pH-mediated. The effect does not occure in buffered media and in some strains with mutations affecting metabolism and growth rate.The pleiotropic nature of G3P-mediated repression was shown by the method of two-dimensional gel electrophoresis. Among the proteins repressed by glycerol are periplasmic binding proteins, enzymes of tricarbonic acid cycle, aldehyde dehydrogenase, Dps (a stress-induced DNA binding protein) and D-tagatose-1,6-bisphosphate aldolase.