Search

Peroxisomen sind an mehreren wichtigen Stoffwechselprozessen in eukaryotischen Zellen beteiligt, wie der Entgiftung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oder dem Abbau von Fettsäuren durch β-Oxidation, aber auch am Glyoxylat-Zyklus und der Photorespiration. Die Identifizierung von Peroxisom-spezifischen Peroxinen in der Cryptomonade Guillardia theta und anderen Chromalveolaten von Mix et al. (2018) bestätigte das Vorhandensein von Peroxisomen in Protisten mit der so genannten komplexen Plastide. Im Gegensatz zu Hefe-, Pflanzen- und Säugetierzellen ist über die Beteiligung der Peroxisomen zum zellulären Stoffwechsel in Cryptomonaden wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden heterologe Lokalisationsstudien von Kandidatenproteinen aus G. theta mit einem putativen C-terminalen peroxisomalen Zielsteuerungssignal Typ 1 (peroxisomal targeting signal, PTS1) in der Diatomee Phaeodactylum tricornutum durchgeführt. Dabei konnten putative PTS1-Proteine mit dem peroxisomalen Marker (mRuby3-SKL) kolokalisiert werden, die an wichtigen metabolischen Prozessen wie Kohlenhydrat-, Etherphospholipid-, Nukleotid-, Vitamin-K-, ROS-, Aminosäure- und Aminstoffwechsel beteiligt sind. Darüber hinaus wurden Homologe zu Faktoren der peroxisomalen β-Oxidation, dem Glyoxylat-Zyklus und der Photorespiration bioinformatisch in G. theta analysiert und Kandidaten mit PTS1-ähnlichen Sequenzen in P. tricornutum lokalisiert. Eine Kolokalisation der G. theta Homologe mit mRuby3-SKL wurde heterolog nicht beobachtet und es ist anzunehmen, dass der Glyoxylat-Zyklus in G. theta nicht peroxisomal lokalisiert und dass die G. theta Peroxisomen nicht an der Photorespiration beteiligt sind. Des Weiteren ist der β-oxidative Abbau von Fettsäuren in G. theta vermutlich ausschließlich mitochondrial. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden durch komparative Genomanalysen ausgewählter Chlorophyten, Rhodophyten und Glaucophyten putative Peroxin-Sequenzen identifiziert, was auf das Vorhandensein von funktionalen Peroxisomen in den meisten untersuchten Organismen hindeutet. Des Weiteren deuten in silico Analysen darauf hin, dass in Chlorophyten und Glaucophyten neben dem PTS1-Import auch PTS2-Proteine importiert werden könnten. Das PTS2 ist ein N-terminales Nonapeptid, das jedoch im Vergleich zu dem PTS1 seltener vorkommt.

Der globale Lebensmittelanbau steht durch den Klimawandel und die wachsende Weltbevölkerung vor einer großen Herausforderung. Unsere Nahrungsmittel werden durch unnachhaltigen Anbau in Monokulturen nährstoffärmer und minderwertiger. Gleichzeitig haben sich, getrieben durch aktuelle Food- und Megatrends, neue und wiedererwachte Systeme und Prozesse zur Nährstoffgewinnung etabliert. Superfoods und individualisierte Ernährung sind in den Generationen Z und Y in aller Munde. Spirulina Algen sind vielseitig und nährstoffhaltig und bieten eine Basis für die Ernährung der Zukunft, da sie unbewusste Mangelernährung durch nährstoffarme Nahrungszufuhr mithilfe wertvoller Mikronährstoffe vorbeugen, ausgleichen und ergänzen. AlGarden ist ein System zur individuellen Anzucht frischer Spirulina Algen zuhause. Es besteht aus einer holistischen Produktserie und einer unterstützenden Smartphone-Applikation. Zentrum von AlGarden ist die PlantAlge, eine minimalistische und nutzerfreundliche Algenplantage. Hier werden Spirulina Algen unter optimalen Umgebungsparametern in Symbiose mit Microgreens kultiviert. Das System führt die Nutzer:innen durch einen kompletten Kultivierungsprozess, von der Bestellung der Algenkultur und weiterem Zubehör, über Setup des AlGarden, Kultivierung und Pflege der Mikroalgen, Ernte und Reinigung bis hin zum angeleiteten Konsum der frischen Algen in Form von Shakes, die mithilfe des Mixaufsatzes zubereitet werden. Der Fokus liegt hier auf dem autarken und nachhaltigen Homefarming eines Lebensmittels der Zukunft. Durch das nutzerfreundliche, ganzheitliche und simple System wird den Nutzer:innen der Konsum von Mikroalgen als alltägliches Nahrungsergänzungsmittel spielerisch und realitätsnah aufbereitet. AlGarden ist reduziert und hochwertig gestaltet und bildet einen Ruhepol in der urbanen Work-Life-Umgebung. Es integriert sich so ästhetisch und flexibel in die alltägliche Umgebung und dient als Eyecatcher und zusätzliche Stimmungslichtquelle. Due to climate change and the growing world population, the global food production nowadays faces some major challenges. Because of unsustainable cultivation in monocultures, our food is becoming less nutritious and inferior in quality. At the same time, driven by current food- and megatrends, new and reawakened systems and processes for nutrient extraction have established themselves. Superfoods and individualized nutrition are on everyone‘s lips for generations Z and Y. Spirulina algae is versatile and nutritious. It prevents, balances, and supplements undiscovered malnutrition, which is caused by eating nutrient-poor food. Spirulina provides a basis for future nutrition with the help of valuable micronutrients. AlGarden is a system for the individual cultivation of fresh spirulina algae at home. It consists of a holistic product series and a supporting smartphone application. The heart of AlGarden is a minimalistic and user-friendly algae plantation. It provides ideal environmental parameters for symbiotic cultivation of Spirulina algae and microgreens. Users are being guided through the complete cultivation process. Starting with ordering the algae culture and other accessories, through the setup of the plantation, as well as cultivation and caregiving of the microalgae, harvesting, and cleaning. It ends with guided consumption of fresh algae blended into shakes which are prepared using the blender attachment. The focus of this product family lies on the self-sufficient and sustainable home farming of a future‘s food. The consumption of microalgae becomes part of everyday life through a user-friendly, holistic and simple system. Dietary supplements are being prepared playfully and realistically. The design of AlGarden is reduced and high in quality and forms a haven of peace in the urban work-life environment. It integrates aesthetically and flexibly into the everyday environment and serves as an eye-catcher and mood light source. Sina Chlod Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Masterarbeit FH JOANNEUM 2022

Die Modifikation von Genen ist in den molekularen Biowissenschaften ein fundamentales Werkzeug, um die Funktion von Genen zu studieren (Reverse Genetik). Diese Arbeit hat erfolgreich Zinkfinger- und CRISPR/Cas9-Nukleasen für die Verwendung in C. reinhardtii etabliert, um Gene im Kerngenom gezielt auszuschalten und präzise zu verändern. Basierend auf vorausgegangener Arbeit mit Zinkfingernukleasen (ZFN) konnte die Transformationseffizienz um das 300-fache verbessert werden, was die Inaktivierung von Genen auch in motilen Wildtyp-Zellen ermöglichte. Damit war es möglich, die Gene für das Kanalrhodopsin-1 (ChR1), Kanalrhodopsin-2 (ChR2) und das Chlamyopsin-1/2-Gen (COP1/2) einzeln und gemeinsam auszuschalten. Eine Analyse der Phototaxis in diesen Stämmen ergab, dass die Phototaxis durch Inaktivierung von ChR1 stärker beeinträchtigt ist als durch Inaktivierung von ChR2. Um das CRISPR/Cas9-System zu verwenden, wurden die Transformationsbedingungen so angepasst und optimiert, dass der Cas9-gRNA-Komplex als in vitro hergestelltes Ribonukleoprotein in die Zellen transformiert wurde. Um die Bedingungen für präzise Genmodifikationen zu messen und zu verbessern, wurde das SNRK2.2-Gen als Reportergen für eine „Blau-Grün Test“ etabliert. Kleine Insertionen von bis zu 30 bp konnten mit kurzen Oligonukleotiden eingefügt werden, während größere Reportergene (mVenus, SNAP-Tag) mithilfe eines Donor-Plasmids generiert wurden. In dieser Arbeit konnten mehr als 20 nicht-selektierbare Gene – darunter 10 der 15 potenziellen Photorezeptorgene – mit einer durchschnittlichen Mutationsrate von 12,1 % inaktiviert werden. Insgesamt zeigt diese Arbeit in umfassender Weise, wie Gen-Inaktivierungen und Modifikationen mithilfe von ZFNs und des CRISPR/Cas9-Systems in der Grünalge C. reinhardtii durchgeführt werden können. Außerdem bietet die Sammlung der zehn Photorezeptor-Knockouts eine aussichtsreiche Grundlage, um die Vielfalt der Photorezeptoren in C. reinhardtii zu erforschen. Gene editing is a fundamental tool in molecular biosciences in order to study the function of genes (reverse genetics). This study established zinc-finger and CRISPR/Cas9 nucleases for gene editing to target and inactivate the photoreceptor genes in C. reinhardtii. In continuation of previous work with designer zinc-finger nucleases (ZFN), the transformation efficiency could be improved 300-fold, which enabled the inactivation of genes in motile wild type cells. This made it possible to disrupt the Channelrhodopsin-1 (ChR1), Channelrhodopsin-2 (ChR2) and Chlamyopsin-1/2 (COP1/2) genes individually and in parallel. Phototaxis experiments in these strains revealed that the inactivation of ChR1 had a greater effect on phototaxis than the inactivation of ChR2. To apply the CRISPR/Cas9 system, the transformation conditions were adapted and optimized so that the Cas9-gRNA complex was successfully electroporated into the cells as an in vitro synthesized ribonucleoprotein. This approach enabled gene inactivations with CRISPR/Cas9 in C. reinhardtii. In order to measure and improve the conditions for precise gene modifications, the SNRK2.2 gene was established as a reporter gene for a ‘Blue-Green test’. Small insertions of up to 30 bp were inserted using short oligonucleotides, while larger reporter genes (mVenus, SNAP-tag) were integrated using donor plasmids. Throughout this study, more than 20 non-selectable genes were disrupted, including 10 of the photoreceptor genes, with an average mutation rate of 12,1 %. Overall, this work shows in a comprehensive way how gene inactivations and modifications can be performed in green alga C. reinhardtii using ZFNs or CRISPR/Cas9. In addition, the collection of the ten photoreceptor knockouts provides a promising source to investigate the diversity of photoreceptor genes in C. reinhardtii.