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Hintergrund: Bis heute existieren für die akute myeloische Leukämie - mit Ausnahme der PML - keine chemotherapeutischen Optionen mit zufriedenstellender Verbesserung der Gesamtüberlebensrate. Insbesondere bei älteren Erwachsenen liegen die Chancen auf Langzeitremissionen

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Inzidenz und prognostische Relevanz von ASXL1 Mutationen mit besonderem Fokus auf ältere AML Patienten (>60 Jahre) zu bestimmen. Es wurden 732 Patienten, die alle intensiv in zwei Therapiestudien (AML HD98B, AMLSG 06-04) der Deutsch-Österreichischen AML Studiengruppe (AMLSG) behandelt wurden, mittels GeneScan auf das Vorliegen einer ASXL1 Mutation (Exon 12) untersucht und die Mutationen dann mittels Sequenzierung nach Sanger verifiziert. Die Inzidenz von ASXL1 Mutationen lag bei 11%. ASXL1 Mutationen traten signifikant häufiger bei Patienten mit sekundärer AML (sAML) auf. Diese Beobachtung unterstützt die propagierte Hypothese, dass ASXL1 Mutationen ein frühes Ereignis im Prozess der Leukämogenese darstellen und bei einer vorbestehenden hämatologischen Neoplasie das Risiko für den Progress in eine AML erhöhen können. Auf molekularer Ebene zeigte sich eine Korrelation von ASXL1- mit RUNX1 Mutationen, während zu Mutationen in den Genen NPM1 oder FLT3 ein inverser Zusammenhang bestand. Patienten mit einer ASXL1 Mutation erreichten seltener eine komplette Remission (CR), hatten ein kürzeres ereignisfreies Überleben (EFS), rezidivfreies Überleben und Gesamtüberleben (OS). Aufgrund der signifikanten Korrelation von ASXL1- und RUNX1 Mutationen wurden die Daten explorativ bezüglich der prognostischen Wertigkeit des kombinierten ASXL1/RUNX1 Genotypes ausgewertet. Patienten mit dem Genotyp ASXL1mut und/oder RUNX1mut hatten eine signifikant niedrigere CR-Rate sowie ein kürzeres EFS und OS als Patienten mit allen anderen ASXL1/RUNX1 Genotypkombinationen. Zusammenfassend konnte durch die vorliegende Arbeit bestätigt werden, dass die Inzidenz der ASXL1 Mutationen bei älteren AML Patienten ansteigt. Im Falle einer ASXL1 Mutation sprechen ältere Patienten selbst bei gutem Allgemeinzustand und ohne Komorbiditäten schlechter auf eine konventionelle intensive Chemotherapie an und ihre Langzeitprognose ist ungünstiger, vor allem wenn die ASXL1 Mutationen zusammen mit RUNX1 Mutationen auftreten. Für diese molekular definierte ungünstige AML Subgruppe benötigen wir daher dringend neuartige Therapieansätze.

Die Untersuchung der messbaren Resterkrankung (MRD) bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) gewann in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung. Hierdurch werden Aussagen zum Therapieansprechen, zur Risikostratifizierung und zur frühzeitigen Identifizierung von Rezidiven ermöglicht, mit dem Ziel, das Überleben der Patienten mit AML zu verbessern. In vorangegangenen Studien konnten insbesondere für Mutationen im Gen Nucleophosmin 1 (NPM1mut), sowie für Mutationen in den Fusionsgenen corebinding-factor-beta-myosin-heavy-chain-11 (CBFB-MYH11) und runt-relatedtranscription-factor-1-runt-related-transcription-factor-1 (translocated to chromosome 1) (RUNX1-RUNX1[T1]) prognostische Wertigkeiten gezeigt werden. Für Mutationen im Gen DNA Methyltransferase 3A (DNMT3Amut) ist die Aussagekraft jedoch noch nicht endgültig geklärt. Ziel dieser Studie war die Evaluation der DNMT3Amut-Transkriptlevel hinsichtlich deren prognostischer Wertigkeit. Ebenso stellte sich die Frage, ob durch eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) eine Elimination der DNMT3Amut-Klone erreicht werden kann. In dieser Studie wurde die Kinetik der DNMT3Amut-Transkriptlevel mittels quantitativer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion (RQ-PCR) an 71 Patienten der German-Austrian Acute Myeloid Leukemia Study Group (AMLSG) 16-10 Studie untersucht, nachdem zum Diagnosezeitpunkt durch Sequenzierung eine DNMT3Amut identifiziert wurde. Bei der AMLSG 16-10 Studie handelt es sich um eine Phase-II-Studie, in der alle Patienten zusätzlich zur konventionellen intensiven Chemotherapie das Medikament Midostaurin erhielten und die Mehrheit der Patienten in der Konsolidierungsphase mittels allogener HSCT behandelt wurden. In der hier vorliegenden Studie korrelierten die DNMT3Amut-Transkriptlevel zum Diagnosezeitpunkt nicht mit klinischen oder genetischen Charakteristika, jedoch zeigten sie einen signifikanten Einfluss auf das Erreichen einer kompletten Remission (CR) nach Doppelinduktion. DNMT3Amut-Transkriptlevel hatten während der Therapie keinen signifikanten prognostischen Einfluss auf die Endpunkte Gesamtüberleben (OS) oder Remissionsdauer. Ebenso hatten die Reduktion der DNMT3Amut-Transkriptlevel und die RQ-PCR-Negativität weder nach Doppelinduktion noch nach Therapieende einen signifikanten prognostischen Einfluss auf die Endpunkte OS oder Remissionsdauer. Die DNMT3AmutTranskriptlevel waren nach Induktion I, Induktion II und nach Konsolidierung I in den Knochenmarkproben signifikant höher als in den peripheren Blutproben. Interessanterweise konnten nach allogener HSCT bei der Mehrheit der Patienten keine DNMT3Amut-Transkriptlevel mehr nachgewiesen werden. Bei 3 von 3 Patienten, die eine intensive Chemotherapie als Konsolidierungstherapie erhielten, fanden sich nach Therapieende persistierende DNMT3Amut-Transkriptlevel. RQ-PCR-Negativität war keine zwingende Voraussetzung für das Erreichen einer CR und stützt daher das Konzept der klonalen Hämatopoese. Das Transformationsrisiko einer klonalen Hämatopoese bei gesunden Personen in eine hämatopoetische Neoplasie sollte in nachfolgenden Studien genauer untersucht werden. Dadurch könnten sich neue Möglichkeiten in der präemptiven Therapie präleukämisch auftretender Klone ergeben. Inwiefern sich diese jedoch als therapeutische Targets nutzen ließen, bleibt abzuwarten. Verglichen mit den etablierten molekularen Markern scheint DNMT3Amut insgesamt eine schlechtere prognostische Aussagekraft zu besitzen. Die hier vorgestellten Daten legen nahe, dass die allogene HSCT eine effektive Möglichkeit darstellt den DNMT3Amut-Klon zu eradizieren. Weitere Studien werden zeigen, ob mit höheren Fallzahlen ein signifikanter prognostischer Einfluss von DNMT3Amut nach allogener HSCT festgestellt werden kann und ob Untersuchungen der Follow-up-Proben eine frühzeitige Erkennung von Rezidiven ermöglichen.

In dieser Masterarbeit soll untersucht werden, welche Auswirkungen sich durch die Einführung einer europäischen Geldwäschebekämpfungsbehörde auf die tägliche Arbeit in Banken ergeben. Um diese Frage zu beantworten, wurden wissenschaftliche Publikationen verschiedener Autoren, sowie Publikationen der Institutionen der Europäischen Union in Form einer Literaturrecherche analysiert. Als zentrale Informationsquellen fungierten die Gesetzesentwürfe der Europäischen Kommission, welche über die Europäische Rechtsdatenbank EUR-Lex abgerufen wurden. Die aus der Literaturrecherche gewonnenen Erkenntnisse wurden zur Beantwortung der Forschungsfrage herangezogen. Die wissenschaftliche Relevanz dieser Masterarbeit ergibt sich durch die nach wissenschaftlichen Standards aufbereiteten Übersicht über potenzielle Auswirkungen nach Einführung einer europäischen Geldwäschebekämpfungsbehörde für die Bankenlandschaft. Aufgrund der im Zuge der Beantwortung der Forschungsfrage historischen Aufbereitung der europäischen Geldwäschegesetzgebung ist diese Abhandlung auch für Leserinnen und Leser interessant, welche sich einen Überblick über die vergangene, aber auch kommende Geldwäschegesetzgebung in Form des AML-Maßnahmenpakets verschaffen wollen. The aim of this master's thesis is to investigate the effects of the introduction of a European anti-money laundering authority on the daily work in banks. In order to answer this question, scientific publications of different authors as well as publications of the institutions of the European Union were analysed in the form of a literature research. The central sources of information were the draft laws of the European Commission, which were retrieved via the European legal database EUR-Lex. The findings obtained from the literature review were used to answer the research question. The scientific relevance of this master thesis results in the overview, prepared according to scientific standards, of the potential effects of the introduction of a European anti-money laundering authority on the banking industry. Due to the historical preparation of the European anti-money laundering legislation in the process of answering the research question, this paper is also interesting for readers who want to get an overview of the past but also upcoming anti-money laundering legislation in the form of the AML package of measures. eingereicht von: Sandro Luegger Abweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des Verfassers Masterarbeit FH JOANNEUM 2022

Diese retrospektive Studie untersucht den Einfluss von Komorbiditäten und biologischem Alter auf das Gesamtüberleben von Patient*innen mit akuter myeloischer Leukämie. Mit einem Durchschnittsalter von 70 Jahren betrifft diese Erkrankung vor allem ältere Personen. Diverse Komorbiditäten wurden anhand des HCT-CI-Scores erhoben. Zusätzlich wurde das Overall Survival von AML-Patient*innen mit Adipositas bzw. Diabetes Mellitus ausgewertet und überprüft, inwiefern eine Einschränkung der glomerulären Filtrationsrate mit einer Verschlechterung des Gesamtüberlebens korreliert. Die Arbeit beschäftigt sich weiters mit der Einteilung der AML nach der ELN-Klassifikation und vergleicht die Risikogruppen miteinander. Die Überlebenszeitanalysen wurden mit Hilfe des Kaplan-Meier-Verfahrens durchgeführt und dargestellt und mittels Log-Rank-Test verglichen. This retrospective study evaluates the impact of comorbidities and biological age on overall survival of patients with acute myeloid leukemia. With an average age of 70 years, this disease mainly affects older persons. Comorbidities are assessed by the HCT-CI score. In addition, in subgroup analyzes the prognostic value of obesity, diabetes mellitus and impaired glomerular filtration rate on overall survival of AML patients was investigated. Further this work deals with the classification of AML according to the ELN classification and compares the risk groups with each other. Survival curves were plotted using the Kaplan-Meier method and analyzed using the log-rank test.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung mit äußerst heterogenen, zugrundeliegenden genetischen Veränderungen. Nucleophosmin 1 (NPM1) ist mit seinen vielfältigen Funktionen und dessen häufige Mutation in der Gruppe der AML-Erkrankten mit normalem Karyotyp von zentralem Interesse. In der vorgelegten Arbeit wurde das NPM1-Transkriptom anhand der Vorkenntnisse aus explorativen Datenbanken näher untersucht. Dabei konnte in ausgewählten AML-Zelllinien die Diversität der NPM1 Splice-Varianten aufgezeigt werden mit insgesamt 16 weiteren, potentiell proteincodierenden Isoformen, neben drei vorbekannten Varianten. Auffällig war ein heterogenes Expressionsmuster der NPM1 cAug10 Variante. Daher wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ein Screening durchgeführt (n=127), wobei in 82 (65%) der Proben die cAug10 Splice-Variante nachweisbar war. In der Überlebenszeitanalyse zeigte sich ein Trend (p=0,08) zu kürzerem ereignisfreiem Überleben (EFS) für das Kollektiv der cAug10 Positiven. Der Splice-Varianten Status hatte ansonsten keinen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben und das rückfallfreie Überleben. Weitere Untersuchung an größeren Patientenkollektiven werden notwendig sein, um die klinische sowie prognostische Bedeutung der NPM1 Splice-Varianten besser verstehen zu können.

Die akute myeloische Leuk��mie (AML) ist biologisch als auch klinisch eine sehr heterogene Erkrankung. Die verschiedenen, in den letzten Jahren entdeckten genetischen Subgruppen und molekularen Marker der AML bewirkten eine ��nderung der vorwiegend morphologischen Klassifikation hin zu einer Klassifikation basierend auf zyto- und molekulargenetischen Ver��nderungen. Dar��ber hinaus werden diese Ver��nderungen auch als Grundlage f��r die Risikostratifizierung verwendet. TET2 (Ten-Eleven-Translocation oncogene family member 2)mut wurden in verschiedenen myeloischen Neoplasien nachgewiesen und ihre klinische Rolle von mehreren Studiengruppen in den letzten Jahren untersucht. Zielsetzung dieser Arbeit war die Untersuchung der Inzidenz und prognostischen Bedeutung von TET2mut in einer gro��en Kohorte klinisch und genetisch gut charakterisierter sowie intensiv behandelter AML-Patienten. Das untersuchte Patientenkollektiv (Alter > 18 ��� 60 Jahre) setzte sich aus insgesamt 1180 j��ngeren Patienten aus der multizentrischen randomisierten AMLSG (Acute Myeloid Leukemia Study Group) 07-04 Studie zusammen. Im Rahmen des experimentellen Teils dieser Arbeit wurde zum Nachweis der TETmut DNA (Deoxyribonucleic acid) aus Knochenmark oder peripherem Blut der Patienten isoliert und die kodierenden Exons von TET2 mittels PCR (Polymerase chain reaction)-Assay amplifiziert, gefolgt von direkter Sequenzierung nach Sanger. Im Weiteren wurden die TET2mut benannt und mit klinischen und genetischen Patientencharakteristika korreliert. In unserer Studie lagen insgesamt 114 TET2mut bei 97 von 900 analysierten AML-Patienten vor (10,7 %). Die meisten Mutationen fanden sich in Exon 3 und 11, darunter haupts��chlich frameshift- und missense-Mutationen. Es konnte eine signifikante Assoziation von TET2mut mit einem h��heren Alter nachgewiesen werden. TET2mut korrelierten mit DNMT3A (DNA(cytosine-5)-methyltransferase 3A)mut und zeigten eine signifikant inverse Korrelation mit IDH1/2 (Isocitratdehydrogenase 1/2)mut bzw. WT1 (Wilms Tumor 1)mut. Hinsichtlich der prognostischen Bedeutung konnten wir keinen signifikanten Unterschied f��r die klinischen Endpunkte Remissionsstatus, Gesamt��berleben, Rezidiv-freies-��berleben und Ereignis-freies-��berleben aufzeigen. Aufgrund des in einigen Studien beschriebenen schlechteren prognostischen Ergebnisses bei TET2-mutierten AML Patienten mit normalem Karyotyp kann jedoch durch ein Screening auf eine TET2mut ein zus��tzlicher Marker zur Prognoseabsch��tzung und zu Therapie��berlegungen bereitgestellt werden. Ein k��nftiges Ziel der Forschung wird es sein den Zusammenhang bestimmter TET2-Genotypen mit anderen epigenetischen Markern hinsichtlich ihrer Prognose und einer m��glichen zielgerichteten oder hypomethylierenden Therapie zu erarbeiten und das European LeukemiaNet -Schema zur genetischen Einteilung der AML durch die Einbeziehung weiterer molekularer Marker zu verfeinern. Bei Patienten mit klonaler H��matopoese von unbestimmtem Potential gilt zu kl��ren, ob sich eine AML durch ein Screening des TET2-Mutationsstatus vorhersagen l��sst, die pr��leuk��mischen Mutationen zum Erkrankungsrezidiv beitragen und die mit der klonalen H��matopoese assoziierten TET2mut Grundlage f��r effektive zuk��nftige Therapiestrategien darstellen. Aufgrund der zunehmenden Vielfalt AML-assoziierter molekularer Mutationen muss in weiteren Studien die klinische Relevanz von TET2mut hinsichtlich ihrer prognostischen und therapeutischen Rolle gekl��rt werden.

Trotz enormer wissenschaftlicher Fortschritte in der Behandlung der akuten myeloischen Leukämie (AML), kann nur ein kleiner Anteil der Patienten dauerhaft von der meist tödlich verlaufenden Erkrankung kuriert werden. Welche Faktoren das Therapieergebnis dabei beeinflussen ist bislang nicht vollständig aufgeklärt. Im Gegensatz zu soliden Tumoren spielen inaktivierende Mutationen von p53, einem der zentralen Tumorsuppressoren, bei de-novo AML nur eine untergeordnete Rolle. Die Hypothese dieser Arbeit war daher, dass bei AML alternative Prozesse zur Inaktivierung des p53-Signalwegs führen. Eine mögliche Rolle könnte dabei die Dysregulation der Apoptose-stimulierenden-Proteine-von-p53 (ASPP) spielen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deshalb die Rolle von ASPP1 in akuten myeloischen Leukämien untersucht. In einem ersten Schritt konnte eine signifikante Herabregulation der mittels quantitativer Real Time PCR gemessenen ASPP1-mRNA-Expression im Vergleich zu gesunden Probanden nachgewiesen werden. Eine Analyse verschiedener AML-Subgruppen ergab darüber hinaus signifikant verringerte ASPP1-Expressionen in prognostisch ungünstigen AML-Subgruppen. Im nächsten Schritt wurde in einem eigens etablierten ASPP1-Knock-Down-Zellmodell die Folge einer ASPP1-Herabregulation untersucht. Dabei zeigte die ASPP1-defiziente MOLM-14-Zelllinie eine deutlich geringere Apoptose-Induktion gegenüber der Behandlung mit Cytarabin und Daunorubicin sowie eine signifikant erhöhte Proliferationskapazität. Zuletzt konnte ein Anstieg der ASPP1-Expression im Zellmodell sowie in kultivierten primären AML-Blasten nach Behandlung mit dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor Decitabin festgestellt werden. Zusammenfassend konnte ein möglicher Mechanismus demonstriert werden, wie sich leukämische Blasten trotz erhaltener p53-Funktion durch Herabregulation der ASPP1-Expression dem programmierten Zelltod entziehen können. Zudem konnte die therapierelevante proapoptotische Funktion von ASPP1 im Zellmodell untermauert werden. Die partielle Restauration der ASPP1-Expression nach Behandlung mit Decitabin stellt eine weitere Rationale zum Einsatz des DNA-Methyltransferase-Inhibitors in der Behandlung der AML dar. Weitergehende Untersuchungen sind notwendig, um ASPP1 als prognostischen Marker für das Therapieansprechen in AML zu etablieren.

Die akute myeloische Leukämie (AML) zählt zu den klonalen Erkrankungen hämatopoetischer Stammzellen und zeichnet sich durch eine große biologische und klinische Heterogenität aus. Weiterhin stellt diese Erkrankung eine große Herausforderung dar und dies gilt sowohl für die Diagnosestellung als auch die Therapie dieser Erkrankung. Aufgrund der fortlaufenden technologischen Verbesserungen und weiterer wissenschaftlicher Erkenntnisse im Bereich von Diagnostik, Therapie und Prognose konnten bei der AML bedeutende Fortschritte erzielt werden. Es wurden histomorphologische und zytologische Erkenntnisse durch zyto- und molekulargenetische Erkenntnisse ergänzt. Dadurch entstanden die verschiedenen WHO (Welt Gesundheits Organisation / World Health Organisation) Klassifikationen sowie die Risikostratifizierung des European LeukemiaNet, welche aufgrund dieses Fortschritts zuletzt 2016 bzw. 2017 angepasst wurden. Zielsetzung der hier vorliegenden Studie war die Inzidenz und Bedeutung von DNMT3A Mutationen als prognostischen Marker bei der AML in einer Gruppe von homogen intensiv behandelten älteren AML Patienten zu untersuchen. DNMT3A ist für die de novo Methylierung von DNA (Desoxyribonukleinsäure) zuständig. Es wurden hier 750 Patienten aus den Studien AML HD98B und AMLSG 06-04 analysiert, deren Alter zwischen 58 und 85 Jahren lag. Die Analyse der Proben wurde mittels konventioneller PCR (Polymerase-Kettenreaktion) und direkter Sanger Sequenzierung durchgeführt, um die Inzidenz von DNMT3A Mutationen festzustellen. Im Weiteren wurden die erhaltenen Ergebnisse mit den biologischen und klinischen Charakteristika der Kohorte verglichen. Es wurde eine signifikante Korrelation von DNMT3A Mutationen mit dem Alter und einer erhöhten Leukozytenzahl festgestellt. In Bezug auf die genetischen Alterationen war eine signifikante Korrelation von DNMT3A Mutationen mit Mutationen in NPM1, IDH1, IDH2, FLT3-ITD zu beobachten. Mit FLT3-TKD und ASXL1 konnte keine signifikante Assoziation gezeigt werden.Mutiertes DNMT3A hatte keinen Einfluss auf das Ansprechen der Induktionstherapie. Im Weiteren konnte gezeigt werden, dass mutiertes DNMT3A keinen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben hatten. Jedoch ist mutiertes DNMT3A mit einem signifikant schlechteren ereignisfreien und rezidivfreien Überleben assoziiert. In Zusammenschau gehören DNMT3A Mutationen zu den rekurrenten Mutationen in der AML. Auch wenn für diese Mutationen in den meisten Studien keine wesentliche prognostische Bedeutung beschrieben werden konnte, spielen diese im Kontext der klonalen Hämatopoese und dem Progressionsrisiko in eine AML eine wesentliche Rolle, welche weiter erforscht werden sollte.

Die Messung der minimalen Resterkrankung (MRD) mittels quantitativer real-time PCR (RQ-PCR) hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen und wird bereits routinemäßig bei verschiedenen genetischen Alterationen eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die prognostische Bedeutung dieses Verfahrens bei AML-Patienten mit DNMT3A-Mutation (DNMT3Amut) untersucht. Mittels Sanger-Sequenzierung erfolgte die Identifizierung der DNMT3A-R882 Mutationen aus DNA von Knochenmark- (KM) und Blutproben (PB) von Patienten der AMLSG 09-09-Studie. Bei diesen 58 Patienten wurde mit Hilfe der RQ-PCR das MRD-Monitoring durchgeführt. Zur Erweiterung der Probenanzahl wurden zusätzlich die MRD-Verläufe von 87 Patienten der AMLGS 07-04- und 14 Patienten der AML HD98A-Studie hinzugezogen, sodass in der studienübergreifenden statistischen Analyse 1331 Proben zur Verfügung standen. Wir untersuchten den Zusammenhang der DNMT3Amut-Transkriptlevel zu den verschiedenen Therapiezeitpunkten auf die klinischen Endpunkte wie das Gesamtüberleben (OS) und die Remissionsdauer (RD). Dabei erfolgte die Analyse des prognostischen Einflusses anhand mehrerer Methoden: als Log10-transformierte Variable, anhand der Differenzierung zwischen RQ-PCR-Positivität und -Negativität sowie mittels Quartilanalyse. Hierbei konnten wir jedoch keine signifikante Korrelation feststellen. Interessanterweise wurden unter der Therapie nur sehr wenige Patienten RQ-PCR-negativ (4/75 Proben nach Therapieende). In der Differenzierung von KM- und PB-Proben konnten wir signifikant höhere Transkriptlevel in den KM- als in den PB-Proben nach Induktion I (p=0.01), Konsolidierung I (p=0.0003) und II (p=0.01) nachweisen. Zusammenfassend können wir anhand unserer Daten DNMT3Amut nicht als klassischen MRD-Marker zum Therapiemonitoring empfehlen. Dies wird ebenfalls durch den geringen Anteil an RQ-PCR-negativen Patienten unterstrichen, welcher auf die Persistenz der DNMT3A-Mutation zurückzuführen ist. Dahingehend unterstützen unsere Daten bisherige Studien, in denen DNMT3Amut als präleukämische Mutation nachgewiesen wurde und damit die sog. CHIP, die „clonal hematopoesis of indeterminate potential“. Weiterhin wird es interessant sein, das Monitoring von DNTM3A-Mutationen im Kontext der neuen zielgerichteten Therapien oder allogenen Stammzelltransplantation zu untersuchen mit der Frage, ob es möglich ist, den leukämischen Klon zu eradizieren.

Introduction: Despite intensive induction and consolidation therapy in newly diagnosed patients with acute myeloid leukemia (AML), approximately half of the younger patients and about 80−90% of the older patients relapse and the majority of patients will succumb to their disease. The prognostic impact of clinical characteristics and genetic abnormalities, which are mostly assessed at initial diagnosis, is less clear. Currently, there is no commonly accepted standard for salvage treatment. Allogeneic hematopoietic cell transplantation (HCT) offers the highest chance of cure in this clinical circumstance. A study in 667 relapsed younger adults (15−60 years) of the HOVON study group revealed a longer relapse-free interval after first complete remission (CR1), presence of a core binding factor (CBF) AML at diagnosis, lower age at relapse and no previous stem-cell transplantation during first-line therapy as factors associated with more favorable prognosis. More recently, additional favorable genetic markers have been reported, such as biallelic CEBPA mutations and the genotype mutated NPM1 in the absence of FLT3-ITD. Methods: In the current study, we evaluated pretreatment characteristics and type of salvage strategy in 1307 adult AML patients enrolled on five prospective first-line treatment trials of the German−Austrian AML Study Group (AMLSG) who experienced a relapse. Between 1993 and 2009, 3324 adults were enrolled on five prospective treatment trials of the AMLSG for newly diagnosed AML (excluding acute promyelocytic leukemia): AMLHD93, AMLHD98A, AMLHD98B, AMLSG 06-04 and AMLSG 07-04. These studies were approved by the institutional review boards of the participating centers. All patients gave informed consent to pretreatment cytogenetic and molecular genetic analyses as well as to treatment within the trials according to the Declaration of Helsinki. The present study included all patients treated in the above protocols who subsequently relapsed. Response assessment followed the standard criteria. However, we report here on complete remission (CR) and CR with incomplete hematological recovery (CRi) as combined response end point, as full hematological recovery was frequently not achieved before the initiation of subsequent treatment (particularly allogeneic HCT). Overall survival was defined here as time between the date of relapse and death or last follow-up. At initial diagnosis chromosome banding analysis and molecular genetics were performed centrally in the AMLSG Laboratory for Cytogenetic and Molecular Diagnosis, and in a subset of patients sequencing data were available. Pairwise comparisons between patient subgroups were performed by the Mann−Whitney or Kruskal−Wallis test for continuous variables and by Fisher’s exact test for categorical variables; multivariable logistic regression models were used to test the influence of covariates on response to salvage therapy. The Kaplan−Meier method was used to estimate the distribution of overall survival and an extended Cox model was used to evaluate prognostic variables. All statistical analyses were performed with the statistical software environment R, version 2.14.0, using the R packages rms, version 3.3-1, and cmprsk, version 2.2-2. Results/discussion: Of the 3324 patients, 2170 (63%) achieved a CR1; a total of 1307 patients relapsed (n=953 after intensive chemotherapy, n=79 after autologous HCT and n=275 after allogeneic HCT). Median duration of CR1 was 274.5 days (range, 31 days−11.4 years). Of 1307 relapsed patients, 1120 patients (median age, 53.6 years; range, 18−82.1) received different salvage regimens and 187 patients (median age, 60.5 years; range, 25.0–85.3) received only palliative care including hydroxyurea. Median and 24-month survival of patients who received salvage therapy versus those who had palliative care were 7.89 months and 27.3% (95% confidence interval (CI), 24.8–30.2%), and 1.58 months and 3.7% (95% CI, 1.7–8.0%), respectively, underlining the very limited prognosis in patients experiencing AML relapse particularly in the absence of specific antineoplastic treatment. Salvage therapy included intensive chemotherapy (n=907, 81.0%), non-intensive chemotherapy including demethylating agents and low-dose cytarabine (n=62, 5.5%), direct allogeneic HCT (n=100, 8.9%), donor lymphocyte infusions (DLI) alone (n=17) or in combination with low-dose chemotherapy (n=13) in patients transplanted in CR1 (n=30, 2.7%) and investigational therapy (n=21 1.9%). Following salvage therapy, response (CR/CRi) was achieved overall in 430 of 1120 patients (38.4%) and according to applied treatment after intensive chemotherapy in 36.8%, after direct allogeneic HCT without prior salvage therapy in 73%, after non-intensive therapy in 11.3%, after investigational therapy in 19.0% and after DLI in 40%. In order to identify prognostic factors that may inform on CR/CRi achievement after intensive salvage therapy, we performed a logistic regression model with the end point CR/CRi after salvage therapy (n=907). This model revealed CR duration >18 months (odds ratio (OR), 1.58; P=0.01), biallelic CEBPA mutation (OR, 2.15; P=0.04) and CBF-AML (OR, 2.20; P0; n=257, CR rate 54%). This simple score may be helpful in decision making, pro or against intensive salvage therapy in relapsed patients. Allogeneic HCT was performed in 537 of 1120 (48%) patients receiving intensive therapy (48%); this includes 100 patients receiving direct allogeneic HCT without prior salvage therapy. The median time interval from diagnosis to allogeneic HCT was 78 days (range, 3−509 days) after relapse, with three patients receiving their transplant beyond 1 year after relapse. The donor types were as follows: n=146 matched related, n=366 matched unrelated and n=22 haplo-identical donors; n=3 were cord blood grafts. Allogeneic HCT was performed with refractory disease after salvage therapy in 247 patients, in CR/CRi after salvage therapy in 190 patients, and in 100 patients directly without salvage. Multivariable analysis on overall survival using an Andersen−Gill regression model taking into account the time dependency of allogeneic HCT on all intensively treated patients (n=1120) revealed CR1 duration 18 months (HR, 0.82, P=0.03), biallelic CEBPA mutation (HR, 0.54, P=0.004), CBF-AML (HR, 0.48, P0. Conclusion: The results of our study in relapsed AML indicate that response to salvage therapy is associated with specific genetic disease entities (CBF-AML, AML with biallelic CEBPA mutation), longer CR1 duration, absence of adverse cytogenetics and FLT3-ITD. A score integrating these factors into three groups is prognostic for the probability of achievement of a CR/CRi after intensive salvage chemotherapy and for survival after relapse in the whole group and in patients receiving direct allogeneic HCT without prior salvage therapy. FLT3-ITD appears to be an unfavorable prognostic marker in all analyses, underlining the need for targeted therapies in these patients.

Die Immuntherapie hat in den letzten Jahren einen zunehmend höheren Stellenwert für die Behandlung maligner Tumoren eingenommen. Dabei konnten chimärisierte und humanisierte monoklonale Antikörper die Prognose verschiedener maligner Erkrankungen erheblich verbessern. Dennoch weisen heutige anti-Tumor-Antikörper unter anderem bezüglich ihrer immunstimulierenden Aktivität sowie der Antigenbindung Schwächen auf. Ein Ansatz zur Entwicklung neuer, effizienterer Formate ist dabei die Herstellung bispezifischer Antikörper (bsAb), die nach der Bindung an ihr Zielantigen mit ihrem Effektorarm eine gezieltere Immunaktivierung bewirken, da sie spezifische Rezeptoren aktivieren und eine definierte Population an Effektorzellen rekrutieren können. Durch bsAb kann nicht nur der aktivierende CD16 Rezeptor auf NK Zellen spezifisch aktiviert werden, sondern über Stimulation von CD3 auch eine Immunantwort zytotoxischer T Zellen mit ihrem höheren Effektorpotential induziert werden. Um klinisch relevante, effektive, zielgerichtete neuartige Antikörper zu entwickeln, ist die Identifikation möglichst tumorrestringierter Zielstrukturen von großer Bedeutung. Gegenstand dieser Arbeit ist deshalb die Entwicklung, Herstellung und Charakterisierung neuartiger Immunrezeptor Fusionsproteine, welche mit ihrem Immunrezeptoranteil (aus der extrazellulären Domäne von NKG2D) die Zielantigene NKG2D Liganden (NKG2DL) binden. Der Effektorarm der Fusionsproteine besteht aus einem Antikörperfragment, welches entweder gegen CD16 (Aktivierung des FcyIIIA Rezeptors auf NK Zellen) oder gegen CD3 (Stimulation von T Zellen) gerichtet ist. Nach erfolgreicher Produktion und Reinigung beider Fusionsproteine erfolgte zuerst eine Charakterisierung der neuen Proteine. So konnten für beide Konstrukte, NKG2D-CD16 und NKG2D-CD3, eine spezifische Bindung sowohl an die Effektor-Seite sowie an die Ziel-Seite nachgewiesen werden. Für NKG2D-CD16 zeigte sich im Vergleich zu einem bereits in Vorarbeiten entwickelten, monospezifischen Fusionsprotein NKG2D-Fc-ADCC in Titrationsexperimenten eine erhöhte Affinität gegenüber dem Fc-Rezeptor auf NK Zellen. Auch die spezifische Bindung der Konstrukte an ihre jeweilige Effektorpopulation konnte gezeigt werden. In Zytotoxic-Assays wurde für beide Konstrukte die gezielte Lysierung der Zielzellen nachgewiesen. Erste funktionelle Daten belegen somit das Anti-Tumor-Potential der beiden Fusionsproteine, welche ein vielversprechendes Therapeutikum für die Immuntherapie darstellen können.

The presented data of this doctoral thesis suggest that the transcription factor GFI1/Gfi1 plays an important role in the progression and manifestation of AML. AML patients with low GFI1 expression in their blasts showed an inferior prognosis and a shortend EFS and OS. Furthermore, the KD of GFI1 resulted in a block of differentiation in the bone marrow of mice. The KO and the KD of GFI1/Gfi1 lead to an enhanced AML progression in the MLL-AF9 mouse model. In addition, upregulation of Gfi1 resulted in an increase of differentiation of bone marrow cells and a decrease of monocytosis in a persisting AML. It could be shown that the KO of Gfi1 impeded AML progression whereas the KD of GFI1 accelerated AML progression in the NUP98/HOXD13 mouse model. In cooperation with the the IRCM in Canada it could also be shown that H3K9 acetylation at GFI1 target genes is increased in the bone marrow of GFI1-KD-NUP98/HOXD13 mice. Further analysis of gene expression (Gene Set Enrichement Analysis) showed an upregulation of those genes that belong to "cluster 5" which were defined by Valk et al. as a subgroup of AML patients with poor prognosis. These data suggest, that the GFI1-KD-NUP98/HOXD13 mice recapitulate the situation of AML patients with an inferior prognosis very well. Moreover, the essential role of GFI1/Gfi1 for AML progression and manifestation in AML1-ETO9a- and CBFB-MYH1- mouse models could be demonstrated. Furthermore the here depicted results open up new vistas in treating AML patients with epigenetic drugs. As well as in murine as in human leucemic bone marrow cells it could be shown that cells with low GFI1 expression responded better to the treatment with the HATi CTK7a. This could be also confirmed in first in vivo experiments. Taken together, the presented data suggest that GFI1/Gfi1 plays a level- and dose-dependent role in progression of AML in the here used mouse models and that different GFI1/Gfi1 expression levels could be exploited as new prognostic factor in order to establish a new epigenetic therapy for MDS/AML patients. Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2016

Die akute myeloische Leukämie ist trotz Fortschritten in der Therapie weiterhin eine Erkrankung mit geringer Heilungschance und hoher Rezidivrate nach Therapie. Bei der Suche nach zielgerichteten Therapien haben wir mittels RNA interference (RNAi) Screens die Rezeptortyrosinkinase (RTK) RET (Rearranged during Transfection) als potentielle Zielstruktur identifiziert. Gegenstand meiner Arbeit war es näher zu untersuchen, ob und inwiefern RET in der akuten myeloischen Leukämie (AML)- Pathogenese von Bedeutung ist, und aufgrund der geringen Heilungsrate auch nach eventuellen Therapiestrategien zu suchen. In meiner Arbeit befasste ich mich zunächst damit, ob Leukämiezellen RET exprimieren. Ich konnte zeigen, dass insbesondere myelomonozytär differenzierte AML-Zelllinien des FAB (French-American-British)- Subtyps M5 ein hohes RET9- und RET51-Expressionslevel besitzen. Dies stimmt auch mit der vorhandenen Literatur überein. Im Gegensatz hierzu fand ich in gesunden Mono- und Granulozyten nur RET9- und keine RET51-Expression. Dies legt eine mögliche spezifische Rolle von RET51 in der Pathogenese der AML nahe. Weitere Untersuchungen mit der Frage nach der funktionellen Bedeutung der beiden Isoformen sollten sich anschliessen. Um eine Signalkaskade zu starten, muss RET über einen Liganden aktiviert werden, und in der Folge kommt es zu einer Phosphorylierung verschiedener Tyrosinreste von RET. Diese Phosphorylierung und somit die Aktivität von RET wollte ich in AML-Zelllinien nachweisen. In MOLM-14, einer AML-Zelllinie, konnte ich eine allgemeine Phosphorylierung von RET zeigen und durch RPI-1, einen Inhibitor von RET, in der Folge eine Dephosphorylierung von RET erzielen. Übertragen konnte ich damit die Aktivität von RET in dieser Zelllinie beweisen. Bei dem Blick auf den spezifischen Tyrosinrest 905 waren wir mit der Detektion nicht erfolgreich. Hier würde sich der Tyrosinrest 1062 als nächster Punkt empfehlen. Nach der Aktivität von RET war es weiter wichtig zu untersuchen, ob AML-Zellen von der RET-Expression abhängig sind. Ich konnte mittels RNAi beweisen, dass alle Zellen mit positivem RET durch die Suppression von RET nicht mehr weiter wachsen, was eine Abhängigkeit der Zellen von RET erkennen lässt. Auch mit RPI-1 liess sich die Abhängigkeit bestätigen. Am empfindlichsten reagierten die Zelllinien mit weiteren RTK-Mutationen, weniger empfindlich diejenigen mit einer RAS (Rat sarcoma virus oncogen)- Mutation. Somit scheinen auch die weiteren Mutationen einer Zelllinie eine Rolle im Bezug auf das Wachstum von AML-Zelllinien zu spielen. Wichtig wäre nun zu wissen, ob die Zellen durch die Suppression von RET in Apoptose gehen oder ob eine verminderte Proliferation der Zellen resultiert. Wie sich die Signalwege von RET verhalten, war ebenfalls Gegenstand meiner Untersuchungen. Bei den Experimenten zum Signaling von RET konnten wir zwei Wege herausarbeiten, die eine übergeordnete Rolle zu spielen scheinen. In allen von uns untersuchten Zelllinien wurde durch die Blockierung von RET PKC (Protein kinase C) alpha hochreguliert. Die Hochregulierung von PKCalpha ist eventuell somit ein kompensatorischer Versuch der Zelle, sich aufrecht zu erhalten. Bei FLT3 (Fms-related tyrosine kinase 3)- mutierten Zelllinien, einer anderen Rezeptortyrosinkinase, führte die Blockierung von RET scheinbar zu einer Aktivitätsverminderung von STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5). Eine Ableitung hiervon kann sein, dass STAT5, wie bisher noch nicht bekannt, als direkter Effektor des Signalings von RET vorkommt, oder dass RET und FLT3 vielleicht auch direkt miteinander interagieren und STAT5 so beeinflussen. Für AKT (V-akt murine thymoma viral oncogene homolog), ERK (Elk-related tyrosine kinase) und STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) konnte aus unseren Daten keine zentrale Aussage abgeleitet werden. Den möglichen Cross-Talk von RET und FLT3 wollten wir noch weiter beleuchten. Unsere Experimente hierzu zeigten, dass durch die Kombination von RPI-1 und PKC412, einem FLT3-Inhibitor, eine additive bzw. synergistische Wirkung auf RET-positive, FLT3-mutierte Zelllinien erzielt werden konnte. Bei einem weiteren Versuch mit einer Kombination aus RET-knockdown (KD) und PKC412 konnten wir ebenfalls die beste Proliferationshemmung im Vergleich zu den einzelnen Behandlungen erzielen. Dies könnte spezifisch für Patienten mit einer FLT3-Mutation einen therapeutischen Vorteil bringen. Die Phosphorylierung von FLT3 konnte durch einen KD von RET nicht beeinflusst werden. Jedoch zeigte sich bei der spezifischen Phosphorylierungsstelle Tyr842, die im Aktivierungsloop von FLT3 liegt, eine verminderte Phosphorylierung. Dies erweckt ebenfalls den starken Verdacht, dass RET und FLT3 interagieren. Tyr591 war in meinen Untersuchungen nicht detektierbar. Weitere Phosphorylierungsstellen könnten Gegenstand weiterer Experimente sein.

IDH1 (Isocitrate dehydrogenase 1) und IDH2 (Isocitrate dehydrogenase 2) Mutationen stellen rekurrente genetische Alterationen bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) dar: Der Anteil an IDH1 und IDH2 Mutationen bei der AML liegt bei 15%-20%. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, an einem großen Kollektiv (n=920) jüngerer AML Patienten (

Introduction Paramunity-inducing-Factors (PINDs) consist of attenuated/inactivated viruses of various poxvirus-genera, used in veterinary medicine as non-antigen-specific, non-immunising stimulators of the innate immune system against infectious and malignant diseases. Their danger-signaling-interactions were tested for their capacity to improve leukemic antigen-presentation on DC generated from AML-patients’ blasts (‘DCleu’) and DC-stimulation/activation of antileukemic T-cells. Methods We analyzed, whether the addition of PINDs during DC cultures (15 healthy, 22 leukemic donors) and mixed lymphocyte culture (MLC, n = 15) with autologous (n = 6), allogeneic (n = 2) or T-cells after stem cell transplantation (SCT; n = 7) would alter the quality and quantity of DC, the composition of T-cell-subsets, and/or their antileukemic functionality (AF) as studied by FACS and functional Fluorolysis-cytotoxicity-assays. Results Effects on 1. DC-cultures: PINDs in DC-cultures lead to increased proportions of mature DC and DCleu, but reduced proportions of viable and overall, as well as TLR4- and TLR9-expressing DC. 2. MLC: PINDs increased early (CD8+) T-cell activation (CD69+), but reduced proportions of effector-T-cells after MLC 3. AF: Presence of PINDs in DC- and MLC-cultures reduced T-cells’ as well as innate cells’ antileukemic functionality. 4. Cytokine-release profile: Supernatants from PIND-treated DC- and MLC-cultures resembled an inhibitory microenvironment, correlating with impaired blast lysis. Conclusions Our data shows that addition of PINDs to DC-cultures and MLC result in a “blast-protective-capacity” leading to impaired AF, likely due to changes in the composition of T-/innate effector cells and the induction of an inhibitory microenvironment. PINDs might be promising in treating infectious diseases, but cannot be recommended for the treatment of AML-patients due to their inhibitory influence on antileukemic functionality.

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) lokalisieren in einer komplex- zusammengesetzten Mikroumgebung, die essentiell für die HSC-Regulation ist. Bei einer akuten myeloischen Leukämie (AML) resultiert aus einer klonalen Transformation eine Expansion maligner Progenitorzellen, die das Knochenmark infiltrieren und mit mesenchymalen Stromazellen (BM-MSC) der Mikroumgebung interagieren. Zahlreiche Studien untersuchten Aberrationen in AML-Zellen, während molekulare Alterationen in BM-MSC von AML-Patienten (AML BM-MSC) und deren putativ pathophysiologische Rolle weitestgehend unergründet blieben. Um molekulare Alteration der AML-Mikroumgebung zu untersuchen, wurden AML BM-MSC zu verschiedenen Zeitpunkten des AML-Krankheitsverlaufs isoliert und in vitro expandiert. AML BM-MSC wurden auf genetischer, transkriptioneller und epigenetischer (DNA-Methylierung) Ebene mittels Hochdurchsatzplattformen (Illumina und Affymetrix) untersucht und mit Kontrollen gesunder Spender (GS BM-MSC) verglichen. Die Gesamtexomsequenzierung der AML BM-MSC von 21 Patienten zeigte ein unspezifisches Muster genetischer Alterationen. In AML BM-MSC wurden, verglichen mit GS BM-MSC, mehr Mutationen identifiziert. Hingegen trugen AML BM-MSC eine geringere Mutationslast als die korrespondierenden hämatopoetischen Zellen. Die aberranten Genexpressions- und DNA-Methylierungsmuster der AML BM-MSC zeigten eine signifikante Anreicherung zellulärer Komponenten mit einer Implikation in der Stroma-Leukämie- Interaktion: Chemokine, Zelladhäsionsmoleküle und Proteoglycane. Beide molekulare Ebenen, die globale Genexpression und die DNA-Methylierung der AML BM-MSC, spiegelten eine Deregulierung zellulärer Prozesse der Endozytose und des Metabolismus wider. Die generierten Genexpressions- und DNA- Methylierungssignaturen zeigten zudem deutlichere Aberrationen im Kontrast zu GS BM-MSC als im Vergleich zwischen Verlaufsproben von Patienten in der AML- Progression. Eine überexprimierte Komponente der AML-Mikroumgebung, welche aus den transkriptionellen Profilen hervorging, war das Proteoglycan Lumican. Eine stabile Überexpression von Lumican alterierte die Proliferation und Morphologie der Stromazelllinie HS-5, hatte hingegen keinen Einfluss auf die Apoptoserate in HS-5 Zellen. Weiterhin wurden der Immunophänotyp (CD33-CD45-CD73+CD105+CD271+/-) sowie die Proliferationskapazitäten der frühen Passagen der AML BM-MSC in vitro Kultur untersucht. Eine CD271+ Population war hierbei hochvariabel (0-81 % der Gesamtpopulationen). AML BM-MSC zeigten gegenüber GS BM-MSC keine signifikant verschiedenen in vitro-Expansionszeiten. Die vorliegende Arbeit präsentiert eine umfassende Analyse genetischer, transkriptioneller und epigenetischer Alterationen in AML BM-MSC. Die aberranten molekularen Signaturen der AML BM-MSC zeichnen das Bild einer global alterierten AML-Mikroumgebung und bieten eine Plattform für die Identifizierung neuer putativer Zielmoleküle für nischenspezifische Therapieansätze., Hematopoeitic stem cells (HSCs) are sheltered in the bone marrow (BM) microenvironment, a multicellular compartment containing mesenchymal stromal cells (BM-MSC), which are essential for HSC repopulation and differentiation. In acute myeloid leukemia (AML), a clonal transformation event gives rise to the accumulation of malignant myeloid progenitors that infiltrate the bone marrow cavity and interact with BM-MSC. Numerous studies have focused on molecular aberrations of AML cells, while molecular alterations in BM-MSC derived from AML patients (AML BM-MSC) and their putative pathophysiological role in leukemogenesis remain elusive. In order to unravel molecular alterations in the AML microenvironment, AML BM-MSC were isolated and expanded in vitro from different time points of disease progression. In addition, healthy donor controls (HD BM-MSC) were obtained. Both AML BM-MSC and HD BM- MSC were molecularly profiled on genetic, transcriptional, and epigenetic (DNA methylation) levels using Illumina and Affymetrix high throughput platforms. Whole exome sequencing of AML BM-MSC of 21 patients revealed a nonspecific mutational pattern and a higher frequency of genetic lesions in AML BM-MSC than in HD BM-MSC. Moreover, AML BM-MSC exhibited less genetic lesions than the hematopoietic counterparts (AML cells). Aberrant transcriptional patterns of AML BM-MSC were enriched in putative stroma-leukemia interaction molecules: chemokines, adhesion molecules and proteoglycans. Both molecular levels, aberrant gene expression and DNA methylation, were enriched in genes associated with endocytosis and metabolic pathways indicating an imbalance of these processes in the AML microenvironment. Compared to patient-matched serial AML BM-MSC samples in the course of the disease, AML BM-MSC showed the most significant changes in contrast to HD BM-MSC. Proteoglycan Lumican, a putative target with significant overexpression in AML BM-MSC transcriptional profiles, was chosen for further investigations. Lumican overexpression impaired the proliferation and altered the morphology of stromal cell line HS-5 but did not influence the apoptotic rate in HS-5 cells. Furthermore, AML BM-MSC were characterized with regard to immunophenotype (CD33-CD45-CD73+CD105+CD271+/-) and to expansion capacities of the early in vitro culture. A CD271+ population was highly variable (0-81 % of total cell population). AML BM-MSC showed similar expansion times compared to HD BM-MSC. The thesis provides a comprehensive analysis of genetic, transcriptional, and DNA methylation alterations in AML BM-MSC. Furthermore, this approach provides a platform for the identification of putative targets for future niche directed therapies.

Diese Arbeit untersucht den Einfluss verschiedener Salvagetherapien und der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (allo-HCT) auf das Ansprechen und Gesamtüberleben bei primär refraktärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Zwischen 1993 und 2009 wurden 3324 Patienten in 5 prospektiven Behandlungsstudien der deutsch-österreichischen AML-Studiengruppe eingeschlossen. Nach der ersten Induktionstherapie mit Idarubicin, Cytarabin und Etoposid hatten 845 Patienten eine primär refraktäre Erkrankung; 721 dieser Patienten (Median Alter 55 Jahre) erhielten eine intensive Salvagetherapie und 124 Patienten nur „best supportive care“ (Median Alter 68 Jahre). Die folgenden Salvagetherapien wurden eingesetzt: „7 + 3“-basiert (n = 59); Hochdosiertes Cytarabin (HiDAC), kombiniert mit Mitoxantron (HAM, n = 529), all-trans-Retinsäure (A-HAM) (n = 226), all-trans-Retinsäure und Gemtuzumab-Ozogamicin (GO-A-HAM) N = 129) oder mit Fludarabin (FLA) (n = 73); andere intensive Therapien (n = 67); experimentelle Behandlung (n = 26). Die allogen transplantierten Patienten (n = 382) hatten im Vergleich zu allen anderen Patienten ein signifikant besseres Überleben (Mantel-Byar-Test, p

Das Monitoring der Minimalen Resterkrankung (MRD) mit Hilfe der „real-time“ quantitativen „reverse trascriptase polymerase chain reaction“ (RQ-PCR) ist zu einem wichtigen diagnostischen Mittel im Management von Patienten mit AML geworden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der prognostische Wert des MRD Monitorings bei Patienten mit AML mit einer NPM1 Mutation (NPM1mut) evaluiert. Hierzu wurde durch ein spezifisches Design von Primern und Sonden ein real-time RT-PCR-Assay zur Quantifizierung der häufigsten NPM1 Mutationen, A, B und D entwickelt. Insgesamt wurden 1682 Proben von 245 unter intensiver Behandlung stehender junger, erwachsener AML Patienten (16 bis 60 Jahre) mit NPM1mut untersucht. Des Weiteren untersuchten wir vergleichend 264 gepaarte Proben aus DNA und RNA um zu prüfen, welches Ausgangsmaterial eine höhere Sensitivität bzw. Aussagekraft erlaubt. Ein weiterer wichtiger Aspekt dieser Arbeit war es zu untersuchen, in wie weit auch Proben aus dem peripheren Blut anstelle von Knochenmark für ein aussagekräftiges MRD Monitoring verwendet werden können. Hierzu wurden weitere 410 Probenpaare (PB und KM) analysiert. Wir konnten zeigen, dass die NPM1mut Transkriptlevel als kontinuierliche Variable signifikant mit der Prognose assoziiert waren; dies zeigte sich für unterschiedlich untersuchte Therapiezeitpunkte. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Patienten die nach der Doppelinduktionstherapie RQ-PCR negativ (kein NPM1mut Transkript nachweisbar) wurden, eine signifikant niedrigere CIR Rate von 6,5% nach 4 Jahren im Vergleich zu RQ-PCR positiven Patienten (53%, p200 NPM1mut/104ABL Kopien), der mit einer hohen Rezidivwahrscheinlichkeit assoziiert war. Weiterhin untersuchten wir vergleichend die NPM1mut Kopienzahl/Transkriptlevel in korrespondierenden DNA- und RNA-Proben zu verschiedenen Therapiezeitpunkten. Die NPM1mut Kopienzahl in DNA Proben und die Transkriptlevel in RNA Proben korrelierten hochsignifikant (r=0.454, 2α

Hintergrund: Bei der Akuten Myeloischen Leukämie (AML) sind molekulargenetische und zytogenetische Aberrationen die wichtigsten AML- assoziierten prognostischen Faktoren. Weiterhin gibt es Hinweise darauf, dass auch die biologische Reife der AML, welche immunzytologisch durch die Expression bestimmter Antigenmuster reflektiert wird, prognostische Relevanz haben kann. Bisher fehlen jedoch Untersuchungen zum Einfluss des AML- Reifegrades auf die Prognose innerhalb der einzelnen molekulargenetisch- zytogenetisch definierten AML-Risikogruppen nach European LeukemiaNet (ELN). Ziel: Ziel der Arbeit war die Klärung der Frage, ob der immunzytologisch (durchflusszytometrisch) ermittelte Reifegrad einer AML nur bestimmte zytogenetische bzw. molekulargenetische Phänotypen reflektiert oder ob dieser auch innerhalb der verschiedenen AML-Risikogruppen nach ELN prognostische Relevanz hat. Material und Methoden: 300 an der Charité-Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow Klinikum, im Zeitraum 01/2003 – 04/2012 diagnostizierte AML-Patienten wurden hinsichtlich ihrer durchflusszytometrischen Zellreife und ihrer Risikogruppen-Zuordnung nach ELN analysiert. Dazu wurde ein durchflusszytometrischer „Reifescore“ entwickelt, welcher auf der quantitativen Expression weniger Progenitorzellmerkmale (CD34, CD117 und TdT) beruht. Mittels dieses immunphänotypischen „Reifescores“ wurden die Patienten in „reife AML“ (AML-R) oder „unreife AML“ (AML-U) unterteilt. Der Einfluss dieses „Reifescores“ auf die klinischen Parameter komplette Remission (CR / CRi), Rückfall-freies Überleben (RFS) und Gesamtüberleben (OS) wurde dann sowohl in der Gesamtkohorte als auch in den einzelnen Risikogruppen nach ELN untersucht. Ergebnisse: Im Gesamtkollektiv zeigten AML-R im Vergleich zu AML-U ein signifikant längeres RFS und OS (p < 0,001). In der Gruppe der AML-R zeigte sich eine Anhäufung von Niedrigrisiko-Aberrationen (NPM1, PML-RARA), während in der Gruppe der AML-U gehäuft Hochrisiko-Aberrationen (monosomaler und komplex-aberranter Karyotyp, -5, (del)5q, -7) beobachtet werden konnten. Interessanterweise fand sich der Unterschied in RFS und OS aber auch innerhalb der einzelnen ELN-Risikogruppen, wobei hier – am ehesten fallzahlbedingt – in der intermediären Risikogruppe nach ELN statistische Signifikanz erreicht wurde (RFS: 7,0 Jahre (AML-R) vs. 3,3 Jahre (AML-U); p = 0,002; OS: 5,1 Jahre (AML-R) vs. 3,0 Jahre (AML-U); p = 0,022). Im Gegensatz dazu fand sich kein Zusammenhang zwischen dem Reifegrad der AML und der CR / CRi-Rate. Schlussfolgerung: Die vorliegenden Daten geben einen ersten Hinweis darauf, dass der in dieser Arbeit entwickelte durchflusszytometrische „Reifescore“ für die AML eine weitere prognostische Stratifizierung innerhalb der einzelnen Risikogruppen nach ELN erlaubt. Die Ergebnisse sollten in einer größeren Patientengruppe prospektiv evaluiert werden. Der durchflusszytometrische „Reifescore“ könnte insbesondere in der intermediären Risikogruppe nach ELN ein zusätzliches Kriterium für die Wahl einer adäquaten Postremissionstherapie werden., Background: In Acute Myeloid Leukemia (AML), molecular genetic and cytogenetic changes in leukemic blasts are the strongest AML-related prognostic factors and the basis for the European LeukemiaNet (ELN) risk classification. Additionally, it has been suggested that individual surface antigen patterns, which reflect maturity or immaturity may also have prognostic relevance. However, there are no prior studies analyzing the impact of blast maturity within the different ELN risk groups. Objective: The aim of this study was to clarify whether AML blast maturity as measured by flow cytometry only reflects specific cytogenetic or molecular phenotypes or whether it also has a prognostic value within the different ELN risk groups. Materials and Methods: 300 patients newly diagnosed with AML from 01/2003 through 04/2012 at Charité – University Medical Center Berlin, Campus Virchow Klinikum, were analyzed with regard to their flow cytometric cell maturity and their ELN risk group. For this purpose, a quantitative flow cytometric score based on CD34, CD117 and TdT antigen expression has been developed and patients were classified as “mature” (AML-R) or “immature” (AML-U). The influence of this maturity score on clinical parameters such as remission rate (CR / CRi rate), relapse-free survival (RFS), and overall survival (OS) was evaluated for both the total cohort and the different ELN risk groups. Results: AML-R showed a significantly longer RFS and OS than AML-U (p < 0,001). Significant accumulation of good-risk mutations (NPM1, PML-RARA) was observed in patients with AML-R; high-risk phenotypes (monosomal and complex aberrant karyotype, -5, (del)5q, -7) were frequently seen in AML-U. However, the differences in RFS and OS in favor of AML-R were also confirmed within the different ELN risk groups, particularly within the group “intermediate risk”, in which this difference was statistically significant (RFS: 7.0 vs. 3.3 years; p = 0,002; OS: 5.1 vs. 3.0 years; p = 0,022). In contrast, no correlation was observed between CR / CRi rate and blast maturity (p > 0,050). Conclusion: The present data show that our flow cytometric score might allow further prognostic stratification within the different ELN risk groups. Our results should be confirmed in a prospective trial in a larger cohort of AML patients. In the future, the flow cytometric score might become an additional criterion for the choice of the most appropriate post remission therapy in AML, particularly within the intermediate risk group according to ELN.

Genetische Veränderungen gehören zu den wichtigsten Erkrankungs-spezifischen Risikofaktoren bei Patienten mit Akuter Myeloischer Leukämie (AML) oder Myelodysplastischem Syndrom (MDS). In der vorliegenden Arbeit wurde der prognostische Stellenwert der Einteilung des genetischen Risikoprofils anhand der Monosomalen Karyotyp (MK) Klassifikation auf das Ergebnis der allogenen Stammzelltransplantation (SZT) untersucht und mit der Klassifikation der South-Western Oncology Group/Eastern-Cooperative Oncology Group (SWOG/ECOG) verglichen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass das genetische Risikoprofil der Monosomalen Karyotyp Klassifikation geeignet ist, das OS bzw. DFS einzuschätzen. Aber auch die SWOG/ECOG Einteilung stellt ein geeignetes Instrument zur Voraussage des OS und DFS dar. Das Gesamtergebnis in den Untersuchungen der genetischen Risikoprofile (MK und SWOG/ECOG) in den beiden Subgruppen MAC vs. RIC untermauert die prognostische Bedeutung beider genetischer Risikoeinteilungen. Insgesamt zeigt sich jedoch, dass für die Gruppe an Patienten mit AML in CR die MK Klassifikation überlegen sein könnte., The genetic profile is among the strongest disease-specific factors predicting overall outcome. In 2008, the monosomal karyotype classification was established and helped to further sub-divide the heterogeneous group of patients with an unfavorable genetic risk profile. In the present thesis, the prognostic impact of the monosomal karyotype classification was assessed in patients with AML or MDS undergoing allogeneic stem cell transplantation at the Charité University Medical Center and compared to the genetic risk classification of the South-Western Oncology Group/Eastern-Cooperative Oncology Group (SWOG/ECOG). The present results underline the ability of the genetic risk grouping of MK as a suitable instrument to assess OS and DFS. Furthermore, the cytogenetic risk grouping by the SWOG/ECOG system remains a good classification to subdivide AML patients in subgroups with different OS and DFS. The overall results of the analysis of both cytogenetic risk classifications (SWOG/ECOG vs. MK) in the subgroups MAC and RIC support the prognostic impact of both classifications. Overall, for patients with AML in CR the MK classification might be superior to the SWOG/ECOG classification and a better predictor of OS and DFS.

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine maligne Erkrankung des hämatopoetischen Systems. Eine Vielzahl von AML-Patienten zeigen im Knochenmark eine hohe Expression des Zellzyklusregulationsproteins Zyklin A1. Hieraus resultierte die Vermutung, dass Zyklin A1 an der Entstehung dieser Erkrankung beteiligt sein könnte. In der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression von Zyklin A1 und seiner Interaktionspartner in AML-Knochenmarkproben analysiert und mit den Expressionswerten in normalem Knochenmark verglichen. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte eine funktionelle Charakterisierung dieser Proteine. Zyklin A1 und alle untersuchten Interaktionspartner des Zyklin A1-CDK2-Komplexes werden im Knochenmark von AML-Patienten in unterschiedlicher Intensität exprimiert. Zudem zeigten einige der Proteine in der funktionellen Analyse einen Einfluss auf Zellproliferation und -differenzierung. Die Daten bilden die Grundlage für weitergehende Untersuchungen eines möglichen Einflusses von Zyklin A1 bzw. seiner Interaktionspartner auf die Entstehung einer AML.

We aimed at evaluating ASXL1mut in 740 AML with intermediate risk karyotype for frequency, association with other mutations and impact on outcome. Five hundred fifty-three cases had a normal karyotype (NK) and 187 had intermediate risk aberrant cytogenetics. Overall, ASXL1mut were detected in 127/740 patients (17.2%). ASXL1mut were more frequent in males than in females (23.5% vs 9.9%, P

Acute myelogenous leukemia (AML) is a heterogeneous clonal disorder resulting from uncontrolled proliferation of hematopoietic progenitor or stem cells, leading to disruption of normal hematopoiesis and bone marrow failure. In addition to genetic aberrations, epigenetic changes are of particular importance as an alternative mechanism of transcriptional inactivation of cancer-related genes in hematopoietic malignancies. In order to examine if promoter hypermethylation plays a role in leukemia progression or relapse methylation-specific PCR was used to assess the methylation status of 9 cancer-related genes at diagnosis and relapse in 14 AML patients. Aberrant CpG island methylation was a frequent event in the study cohort. At diagnosis 50.0% (7/14) of patient samples showed at least 1 methylated gene, whereas 92.9% (13/14) of samples from patients with relapsed AML were methylated. At diagnosis, the median number of methylated genes per patient sample was 1.6, which increased to 2.4 at relapse. There was a high level of concordance between hypermethylated genes at diagnosis and relapse indicating that patterns of aberrant methylation are largely maintained. In addition to those stable methylation patterns this analysis showed an increased number of hypermethylated genes in 64.3 % (9/14) of AML patients at relapse. These results demonstrate an increased frequency of CpG island hypermethylation at time of relapse and therefore suggest that aberrant DNA methylation may be involved in the progression of AML. Stable methylation patterns indicate a survival of leukemia stem cells (LSC) after induction chemotherapy. These persisting LSCs are the origin of a subsequent relapse. In clinical practice profiles of hypermethylated CpG islands may serve as potential biomarkers for minimal residual disease. Furthermore, DNA methylation is pharmacologically reversible, predicting them as a potential therapeutic target.

Taking into account the essential role of the JAK-STAT signaling pathway as well as the role of SOCS proteins in the regulation of physiological haematopoiesis, SOCS3 represents a potential tumor suppressor gene in leukemogenesis. In the presented research a proportion of 31.96% of methylated SOCS3 genes were detected in the examined AML patient group. A distinct correlation between SOCS3 methylation and the prognostic groups “favourable”, “intermediate” and “unfavourable” could be found. Only 5% of patients in the cytogenetic favourable risk group showed SOCS3 hypermethylation, whereas the percentage of methylated genes in the intermediate group was 38%. In the unfavourable group the proportion rose to 54% of examined specimens. In addition to these findings, patients with AML of FAB subtype M4/M4eo, which is associated with a favourable or intermediate prognosis, showed a significantly lower rate of hypermethylation of the SOCS3 promoter region with a p-value of 0.003. No correlation was found with SOCS3 hypermethylation or other FAB subtypes nor with age, gender, kind of specimen (bone marrow biopsy, bone marrow aspiration, peripheral blood) or time of survival. The cohort of patients with AML arising from previous myelodysplastic syndrome displayed a significantly higher incidence of SOCS3 methylation with a p-value of 0.0034. In the future the identification of the methylation status could provide a tool for guiding more focused use of demethylating therapeutic agents. The fact that epigenetic changes like promoter hypermethylation manifest early in the process of leukemogenesis can be used in the early detection of AML. With an incidence of nearly 32% of SOCS3 hypermethylation in AML patients the screening of patients at risk could constitute another field of application of the analysis of methylation status. The presented research contributes to the completion of a methylation profile of leukemic diseases and therefore might further the understanding of the complex process of carcinogenesis.

Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal disorder resulting from uncontrolled proliferation of hematopoietic stem cells. Important genetic findings in AML comprise chromosomal translocations involving different transcription factors and activating point mutations in multiple signal transduction pathways. Hypermethylation of CpG islands within gene promoter regions in collaboration with deacetylation and other histone modifications is associated with transcriptional inactivation and represents, in addition to genetic aberrations, an important mechanism of gene silencing in human cancers. Inter-α-trypsin inhibitors are serum proteases consisting of one light chain, bikunin, and two homologous heavy chains (ITIHs), which stabilize the extracellular matrix (ECM). The putative tumor suppressor gene ITIH5 is the most recent member of the ITIH family and has been reported to be downregulated by DNA hypermethylation in breast cancer. In this study, we determined the methylation status of the promoter-associated CpG island of ITIH5 in both AML cell lines and primary AML patient samples. Methylation specific polymerase chain reaction analysis revealed that the ITIH5 promoter region was hypermethylated in the AML cell lines HL60 and KG-1a. Treatment of cell lines that carry a hypermethylated ITIH5 gene with the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine resulted in partial promoter demethylation. We then analyzed the ITIH5 methylation status in primary mononuclear cells obtained from 104 patients with newly diagnosed AML. The frequency of aberrant methylation among the primary patient samples was 14.4% (15 of 104). Among clinical prognostic parameters, we found no significant correlation between hypermethylation of ITIH5 and cytogenetics, elevated serum levels of lactate dehydrogenase, French–American–British subtype, gender, age, peripheral blood cell counts, and overall survival (p=0.08). Since there was a trend toward an association between increased WBC and ITIH5 promoter hypermethylation (p=0.24), we hypothesize that epigenetic dysregulation of ITIH5 may result in an impaired interaction between the leukemic clone and its’ surrounding ECM in the bone marrow. Additionally, the OS curve implies a slight, but not statistically significant advantage for patients who carry a hypermethylated ITIH5 promoter. Concluding, ITIH5 promoter hypermethylation is a novel epigenetic event in AML that may contribute to leukemogenesis by interfering with the interaction between the ECM and the leukemic clone. Though ITIH5 promoter hypermethylation does not appear to be an independent prognostic factor in AML, as it was recently demonstrated in breast cancer.

ALL und AML sind die häufigsten bösartigen Erkrankungen im Kindesalter. Die Behandlung besteht aus einer Polychemotherapie im Rahmen eines multimodalen Therapiekonzeptes. Eine besondere therapeutische Hürde stellt dabei die Resistenz von an einem Tumorrezidiv erkrankten Patienten gegenüber den konventionellen Chemotherapeutika dar. Cisplatin und dessen Analoga sind eine in der Krebstherapie bewährte Klasse, die jedoch mit vielen Nebenwirkungen behaftet ist und bis heute in der Leukämie-Therapie im Kindesalter keine Anwendung findet. Im Fokus der Forschung stehen aktuell unter anderem metallorganische Verbindungen wie beispielsweise Eisen, Ruthenium oder Titanium-Komplexe. Das Ziel ist, neue Wirkstoffe zu entwickeln, die gezielt in den malignen Zellen Apoptose induzieren und dabei idealerweise nebenwirkungsärmer sind als die bisher eingesetzten Substanzen. In dieser Arbeit habe ich die biologische Aktivität Carbonyl-substiutierter Titanocene und deren Wirkung auf maligne Zellen untersucht. Es wurden 17 verschiedene Verbindungen auf ihr antiproliferatives und zytotoxisches Potential untersucht und eine erste Struktur-Wirkungs-Beziehung aufgestellt. Die Versuche erfolgten in vitro mit verschiedenen Tumorzelllinien, ex vivo mit humanen Lymphozyten und in vivo im Mausmodell. Elf der untersuchten Substanzen zeigten eine deutliche Apoptoseinduktion und Proliferationshemmung. Auch in Lymphoblasten von an AML oder ALL erkrankten Kindern zeigten die getesteten Verbindungen teilweise eine Überlegenheit gegenüber den in der Therapie eingesetzten Substanzen. Die beiden potentesten Substanzen (IW283 und IW293) wurden bezüglich des jeweiligen Apoptosepathways untersucht. Beide entfalten ihre Wirkung FADD-unabhängig über den mitochondrialen Pathway. IW283 wurde zusätzlich im Mausmodell getestet. Es zeigte bei einer verhältnismäßig starken Toxizität im Gastrointestinaltrakt die Fähigkeit, das Tumorwachstum um 30% im Vergleich zur Kontrollgruppe zu verlangsamen. Mit der fluoreszierenden Substanz IW293 wurde untersucht, wo die Verbindung intrazellulär angereichert wird. Außerdem wurde an einer gegen Doxorubicin resistenten Zelllinie gezeigt, dass in Tumorzellen Resistenzen gegen herkömmliche Zytostatika von IW283 und IW293 überwunden werden können., Polychemotherapy as part of a multimodal therapy concept. One of the main obstacles that prevent successful therapy are mechanisms of resistance of cancer cells against certain established drugs. Cisplatin and its analogues are a tried and tested class of antitumor agents, though its shortcomings consist of severe side effects as well as instability and short half-life in the human body. Various research teams are currently focusing on different organometallic compounds such as iron, ruthenium or titanium-complexes substituted with various ligands modulating the efficacy. Pharmacological studies aim at identifying new lead compounds that induce apoptosis specifically in malignant cells. Higher efficacy and availablity are ideally less prone to evoke adverse effects than today’s clinically approved substances. In my thesis I investigated the biological activity of carbonyl- substituted titanocenes and their effect on malignant cells. 17 different compounds were tested in respect of their anti-proliferative and cytotoxic potential. A first structure-response-relationship was established. We conducted in vitro experiments with different human cancer cell lines, ex vivo experiments with human leukemia cells and finally in vivo studies in mice. Eleven of the tested substances induced apoptosis to a considerable degree and showed a remarkable ability to inhibit proliferation. Ex vivo some of the compounds proved superior to substances used in current chemotherapy. Two of the most promising titanocenes (namely IW283 and IW293) were studied in regards to the apoptotic pathway induced by these substances. Both substances acted independently from FADD and apoptosis is induced via the mitochondrial pathway. In addition to mechanistic studies, IW283 was tested in a mouse model, using BJAB-xenografts. While showing relatively high cytotoxicity in the gastrointestinal tract, the agent was able to slow down tumor progression by 30% in comparison to the untreated control. The fluorescent compound IW293 was used to determine the intracellular target. By means of a doxorubicin resistant cell line (BJAB 7-CCA) I showed that both IW283 and IW293 induce apoptosis in resistant cells. Of the tested titanocenes especially IW283 and IW293 showed very promising results and further research should be done to tap the full potential of these substances.

AML1/ETO und Flt3-ITD stellen zwei der häufigsten Mutationen in der AML dar. Diese kommen wiederum nur in weniger als 5% der Fälle gemeinsam vor. Die zugrunde liegende Ursache fand sich in der negativen Regulation des durch Flt3-ITD initiierten Signaltransduktionsweges via STAT5. Die Beeinträchtigung der STAT5-Phosphorylierung führt funktionell zur Wachstumsinhibition und hat Auswirkungen auf alle Stufen von Transkription und Translation STAT5-abhängiger Gene.

The GATA-4, -5 and -6 group of genes is characterized by its role as proliferation and differentiation regulators in endodermal and mesodermal tissue. Despite indications of GATA-4 and -6 involvement in hematopoiesis, up until now only methylation analyses of the GATA-4, -5 and-6 transcription factors exist in solid tumors. As such, on the basis of MSP analyses, the present study offered the interesting possibility of examining the relevance of aberrant promoter methylation of the GATA-4, -5 and -6 transcription factors in the pathogenesis of AML (acute myeloid leukemia). Aberrant methylation of the GATA-4 promoter region was detected in 20.5% of the 73 AML patient samples. The methylation frequencies of the GATA-5 and -6 promoter regions were 1.4% and 2.7%. The GATA-4 methylation frequency, which was the highest with 20.5%, suggests that methylation-caused inactivation of GATA-4 increases the differentiation blocking of myeloid blast cells and as such may contribute to the malignant transformation of hematopoietic cell clones in AML. The FAB subtypes M1 and M4 mostly feature an unmethylated GATA-4 promoter region. This means that here, epigenetic modification of GATA-4 seems to have less pathogenic significance. Furthermore, the present study highlights a trend towards an inverse correlation between patient age and the methylation status of the GATA-4 promoter region. This potential correlation should however be evaluated in studies with larger patient collectives. Up until now, numerous clinical trials concerning the use of the demethylating drugs AZA and DAC have been able to show promising results in the treatment of AML and MDS patients. This study, in addition to the methylation analysis of hematopoietic cell lines, has reviewed the effect of DAC on the GATA-4, -5 and -6 methylation status of the Raji cell line. For each of the three GATA transcription factors, it was possible to demonstrate a partial demethylation of the promoter region in the Raji hematopoietic cell line. As a consequence, an aberrant methylation of the GATA-4, -5 and-6 promoters could be used as a biomarker for AML diagnosis, prognosis and therapy. An analysis of the mutations of the GATA-4, -5 and-6 transcription factors could contribute to the evaluation of a link between epigenetic and genetic alterations in the pathogenesis of AML.

Immunotherapeutic strategies may be a treatment option in patients with refractory acute myelogenous leukemia (AML) or, in cases of complete remission after conventional therapy regimens, may help to reduce disease recurrence or delay time to progression. Evidence suggests a key role of dendritic cells (DCs) in cancer immunotherapy due to their capacity to present tumour antigens to effector cells. We generated cytokine-induced killer (CIK) cells from healthy donors and examined their responses in vitro in an LDH release assay against three cell lines and allogeneic HLA non-matched blasts from three patients with de novo AML after coincubation with autologous peripheral blood monocyte-derived DCs. Although DCs were unable to enhance CIK cell effects against all three cell lines tested, the cytotoxic activity against the patients’ AML cells increased after coculture with mature DCs, which was significant in two of three patients. However, neither prior pulsing of the DCs with blast cell lysates nor with leukemic cell-derived total RNA further enhanced the lytic capacity of the CIK cells. On the contrary, pulsing reduced or even reversed the cytotoxic activity of the effector cells. This decrease of allogeneic cytotoxicity led us to conclude that monocyte-derived DCs may be useful in autologous or allogeneic vaccine strategies for the treatment of AML or in priming donor lymphocytes in vitro, but unfractionated antigens as pulsing agents may have inhibitory effects on T cell efficiency and their employment in immunotherapeutic strategies for AML seems questionable., GMS German Medical Science; 9:Doc18; ISSN 1612-3174

Das humane amino-enhancer-of-split-Protein (hAES) spielt eine Rolle in der Ausdifferenzierung verschiedenster Zellreihen in der Embryogenese sowie im erwachsenen Organismus. Es gehört zu einer Familie von Korepressoren, die an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt sind. Hierzu gehören ebenso die Proteine TLE 1-4 (transducin-like-enhancer-of-split). Ziel dieser Arbeit war es, die klinische Bedeutung der Expression von hAES herauszustellen. Die Expression des hAES-Proteins wurde an Knochenmarkproben auf einem Tissue-Microarray analysiert. Die Proben wurden auf dem Schnitt mittels Immunhistochemie angefärbt und unter dem Lichtmikroskop ausgewertet. Proben von gesundem Knochenmark dienten als Vergleich. Bei AML-Patienten kommt es zu einer höheren Expression von hAES als bei Gesunden. Des Weiteren war festzustellen, dass Patienten mit einer höheren Expression in der Überlebensanalyse nach Kaplan-Meier ein signifikant besseres Überleben zeigen.

In dieser Arbeit werden die Unterschiede der akuten megakaryoblastären Leukämie bei Kindern mit und ohne Down Syndrom im Hinblick auf ihre Zytostatiksensitivität, der Expression von P-Glykoprotein, der Expression Apoptose-assoziierter Antigene und der Expression von CD7 als Zeichen der Stammzellnähe untersucht. An verschiedenen Zelllinien konnte gezeigt werden, dass die unterschiedliche Expression von P-Glykoprotein sowie ein modifiziertes Apoptoseverhalten eine relevante Rolle in der Zytostatikaresistenz der akuten megakaryoblastären Leukämie mit und ohne Down Syndrom spielen. Dies könnte eine Erklärung für das unterschiedliche Therapieansprechen dieser beiden Entitäten sein.

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist eine Erkrankung des hämatopoetischen Systems und gekennzeichnet durch das klonale Wachstum unreifer hämatopoetischer Vorläuferzellen. Typische genetischen Alterationen in der AML sind Mutationen der Rezeptortyrosinkinase FLT3 und chromosomale Translokationen. Es konnte gezeigt werden, dass das Fusionsprotein PML-RAR? und Flt3-ITD die Expression von Zyklin D1 induzieren. Die Induktion von Zyklin D1 durch Flt3-ITD geschieht über den PI3-Kinase/AKT Signalweg. Amino-terminal Enhancer of Split (AES), ein transkriptioneller De-Repressor, wird durch Fusionsproteine in der AML auf RNA- und Proteinebene heraufreguliert. Es wurde nachgewiesen, dass AES in immortalen Zellen und in Knochenmarkproben von AML Patienten überexprimiert wird. Eine Überexpression von AES in 32D Zellen führt zu gesteigerter Proliferation und Selbsterneuerungsfähigkeit. Eine Herunterregulation mündet in vermindertem Kolonienwachstum.

Bei der akuten myeloischen Leukämie finden sich gehäuft balancierte Translokationen, die zur Entstehung von Fusionsproteinen führen. Meist sind Transkriptionsfaktoren betroffen, die die myeloische Differenzierung regulieren. Zyklin D1 spielt als Onkogen eine wichtige Rolle in der Pathogenese zahlreicher solider Tumoren, Leukämien und Lymphome. Zyklin D1-überexprimierende Zellen passieren schneller den Übergang von der G1-Phase in die S-Phase und proliferieren schneller. Eine Induktion von Zyklin D1 durch AML-assoziierte Fusionsproteine über den Wnt-Signalweg konnte bereits gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden Wnt-unabhängige Mechanismen der Zyklin D1 Induktion durch AML-assoziierte Fusionsproteine und die sich daraus ergebenden Einflüsse auf die Proliferation myeloischer Zellen untersucht. Zusammenfassend konnte neben einer Wnt-unabhängigen Regulation von Zyklin D1 durch AML1-ETO auch dessen wachstumsfördernde biologische Funktionen im myeloischen Zellsystem charakterisiert werden.

Die Ausprägung des „Multidrug- Resistance- Phänotyp“ und die darauf beruhende Überexpression von Transportproteinen, welche ist ein wesentlicher prognostischer Faktor auf das Therapieansprechen einer Chemotherapie. Hier wurde ein durch das MDR1- Gen kodierte und am besten charakterisierte Transportprotein, das P – Glykoprotein vom Typ 1 untersucht. In entzündlichen Geweben und verschiedenen Tumorarten kommt es vermehrt zu einer verstärkten Cycloxygenase-2 Expression. Ergebnisse dieser Arbeit deuten auch in AML- Blasten auf eine vermehrte COX- 2 Expression hin, und dass die COX-2 eine wichtige Rolle in der Doxorubicin vermittelten Pgp- Überexpression spielt. Die pharmakologische Hemmung der Pgp Funktion, mittels selektiver COX-2 Inhibitoren stellt ein völlig neues Prinzip der Resistenzintervention dar. Die Therapie der AML könnte durch den Einsatz von COX-2 präferentiellen Inhibitoren, bei erhöhter Selektivität nebenwirkungsarm optimiert werden.

STI571 ist ein selektiver Inhibitor der Rezeptortyrosinkinasen c-abl, Bcr/Abl, Platelet-derived-growth-factor-Receptor und c-kit. Es kommt bereits bei der chronischen myeloischen Leukämie sowie bei der akuten lymphatischen Leukämie zum Einsatz. Da auch bei der akuten myeloischen Leukämie die meisten Blasten nachweisbar die Rezeptortyrosinkinase c-kit auf ihrer Oberfläche exprimieren, erscheint die gezielte Hemmung wirkungsvoll. 8 Patienten mit einer refraktären oder rezidivierten AML wurden mit STI571 behandelt. Insgesamt 3 von 8 Patienten reagierten mit einer signifikanten Reduktion der Blasteninfiltration im Knochenmark; in einem Fall kam es zu einer kompletten Blastenfreiheit bei gleichzeitiger Knochenmarkregeneration. Der klinische Vorteil dieser Therapie für stark vortherapierte Patienten ist gering. Größere Studien zur Bedeutung der Tyrosinkinaseinhibitoren bei der AML erscheinen gerechtfertigt.

Bei derzeitigen Therapieoptionen der akuten myeloischen Leukämie, (Letalität 60%) sind alternative Therapiestrategien angezeigt. Eine Immuntherapie mit dendritschen Zellen, aus Blasten der Patienten wäre denkbar. Zuvor konnte unsere Arbeitsgruppe eine spezifische Zytoxizität gegenüber AML-Blasten nach T-Zell-Stimulation mit BDDC nicht zeigen, in dieser Arbeit sollten mögliche Unterschiede im Zytokinexpressionsmuster herausgearbeitet werden. DC wurden aus Monozyten gesunder Spender, aus AML-Blasten und aus murinem Knochenmark hergestellt, durchflusszytometrisch, morphologisch auf DC-typische Merkmale untersucht, ohne signifikante Unterschiede in der Zytokin-Expression, welches sich nicht als Erklärungsmodell für die fehlende immunstimulatorische Wirkung von BDDC gegenüber autologen AML-Blasten erwies. Analysen möglicher immunsupprimierender Zellen in der autologen T-Zellpopulation (Treg) von AML-Patienten, (Immun-escape Phänomenen bei Tumorpatienten), erscheinen angebracht.

Aktivierende Mutationen in der Rezeptortyrosinkinase FLT3 stellen die häufigste genetische Alteration bei der akut myeloischen Leukämie (AML) dar. In dieser Arbeit wurde das onkogene Potential von neu beschriebenen, bislang noch nicht charakterisierten AML-assoziierten FLT3-Mutanten im Zellmodell nachgewiesen. Ferner wurde die Sensitivität verschiedener FLT3-Mutanten gegenüber selektiven FLT3-Tyrosinkinaseinhibitoren untersucht. Die Empfindlichkeit der untersuchten FLT3-Mutanten gegenüber FLT3-Tyrosinkinaseinhibitoren erwies sich als stark abhängig von der Art der Mutation im FLT3-Rezeptor.Die Untersuchung verschiedener FLT3-Mutanten in einem murinen Knochenmarktransplantationsmodell zeigte, dass Längenmutationen innerhalb der juxtamembranären Domäne der FLT3-Rezeptortyrosinkinase (FLT3-ITD) zu einer myeloproliferativen Erkrankung führen, wohingegen aktivierende Mutationen im Bereich der Tyrosinkinasedomäne (TKD) des FLT3-Rezeptors lymphatische Erkrankungen hervorrufen. Activating mutations of the FLT3 receptor tyrosine kinase are the most common genetic alteration in acute myeloid leukemia (AML). Here, the transforming potential of newly described, AML-associated FLT3 receptor mutants was demonstrated. Moreover, the sensitivity of different activating FLT3 receptor mutants towards several FLT3 tyrosine kinase inhibitors was investigated. The results indicate that these inhibitors have distinct activities against different mutants.Furthermore, the role of several FLT3 mutants in vivo was examined using a murine bone marrow transduction/ transplantation model. Mice that received a transplant of FLT3-ITD transduced bone marrow developed a myeloproliferative disease, whereas the tyrosine kinase domain mutants induced a lymphoid disorder in mice.

Ziel der Arbeit war die genomweite Analyse der Expression von Rezeptortyrosinkinasen bei der akuten myeloischen Leukämie mittels Real-time-RT-PCR. Im Vergleich zu CD34+ Stammzellen und normalem Knochenmark ergab sich bei der AML eine signifikante Überexpression der Rezeptoren c-KIT, CSF1R, FLT3, EPHB6 und LTK. Weitere Analysen zeigten in den myeloblastär differenzierten AML Subtypen FAB M1 und M2 eine signifikant höhere Expression von TRK A, IGF1R, c-KIT, EPHB6 und PTK7 als in den monozytär differenzierten Subtypen FAB M4 und M5, in denen CSF1R und EPHB3 stärker exprimiert wurden. Durch Kaplan-Meier-Überlebensanalysen ließ sich eine Korrelation zwischen hoher Expression von CSF1R, DDR1, INSR, AXL und RET und einer schlechten Prognose bei AML feststellen, wohingegen eine hohe c-KIT Expression mit einer signifikant besseren Prognose einherging. Die leukämogene Deletionsmutante deltaTRK A konnte in keiner der 57 mittels konventioneller PCR analysierten AML Proben nachgewiesen werden.

Die Angiopoietine und ihr Rezeptor Tie-2 spielen eine zentrale Rolle in der Angiogenese solider Tumoren. Ihre Bedeutung für die Angiogenese der AML ist unklar. Wir untersuchten die Expression von Ang-1, Ang-2 und Tie-2 im Knochenmark von AML-Patienten und Kontrollpersonen mittels APAAP-Immunhistochemie. Die Expression von Ang-2 und Tie-2 war im Knochenmark der AML-Patienten signifikant höher als bei Kontrollpersonen. Ang-1 wurde dagegen in beiden Kollektiven gleich stark exprimiert, so dass die Ratio der Ang-2- zu Ang-1-Expression im Knochenmark der AML-Patienten deutlich zugunsten von Ang-2 verschoben war. Sowohl die Ang-2-Expression als auch die Ang-2/Ang-1 Ratio korrelierten mit der Mikrogefäßdichte im Gesamtkollektiv. Der Umschlag der Angiopoietin-Balance könnte eine entscheidende Bedeutung für die AML-induzierte Neovaskularisation haben. Damit wäre das Tie-2/Angiopoietin-System möglicherweise ein geeigneter Angriffspunkt antiangiogener Therapiestrategien in der Behandlung der AML.