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Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur möglichen therapeutischen Bedeutung von IGFBP3 (Insulin-like-Growth Factor Binding Protein 3) beim Lungenkrebs in vitro durchgeführt. Es handelt sich bei IGFBP3 um das Hauptbin- dungsprotein für IGF (Insulin-like-Growth Factor), welches nachweißlich Einfluss auf die Regulation des IGF-Signalwegs und damit auf Zellwachstum, Zellprolifera- tion und Apoptose hat. Für die Untersuchungen wurde die NSCLC-Zelllinie H1299 stabil mit einem Vektor für das Gen IGFBP3 transfiziert. Als Kontrolle dienten einerseits die H1299-Zellen ohne Vektor, wie auch Zellen, welche nur den Vektor ohne cDNA enthielten. Bei den Untersuchungen sollte geklärt werden, inwieweit die Überexpression von IGFBP3 die Proliferation, Migration, Invasion und die Chemosensitivität von NSCLC (non small cell lung cancer) Zellen beeinflusst. Ziel war die Beantwortung der Frage, ob IGFBP3 die tumorgenen Eigenschaften von Lungenkarzinomzellen verändern kann und dadurch ein neues und interessantes Forschungsobjekt für die Therapie von Lungentumoren darstellt.:INHALTSVERZEICHNIS 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 3 1 EINFÜHRUNG 5 1.1 Lungenkrebs 5 1.1.1 Histologische Einteilung 6 1.1.2 Stadieneinteilung und Therapieoptionen 7 1.1.3 Zugelassenes Chemotherapeutikum Cisplatin 8 1.2 Tumorgene Eigenschaften 9 1.2.1 Tumorentstehung und Proliferation 9 1.2.2 Invasion 10 1.2.3 Migration 11 1.2.4 Angiogenese 12 1.3 IGF-Achse 12 1.3.1 IGF und IGF-Rezeptoren 13 1.3.2 IGF-Signalweg 14 1.3.3 IGFBPs 16 1.3.3.1 Struktur von IGFBP3 17 1.3.3.2 Funktionale Rolle von IGFBP3 18 1.4 Zellkulturen 19 1.4.1 NSCLC-Zelllinie H1299 20 1.4.2 pIRES-EGFP-Vektor 20 2 ZIELSTELLUNG 21 3 MATERIALIEN & METHODEN 23 3.1 Verwendete Materialien 23 3.1.1 Zelllinie & Vektor (Tab. 1) 23 3.1.2 Zellmedien (Tab. 2) 23 3.1.3 Chemikalien & Reagenzien (Tab. 3) 23 3.1.4 Gebrauchslösungen & Gele (Tab. 4) 25 3.1.5 Kommerzielle Assays / Kits (Tab. 5) 25 3.1.6 Laborbedarf, Geräte & Software (Tab. 6) 26 3.2 Methoden 29 3.2.1 Kultivieren der Zelllinie 29 3.2.1.1 Auftauen der Zellen 29 3.2.1.2 Umsetzen, Splitten und Passagieren der Zellen 30 3.2.1.3 Bestimmung der Transfektionsrate & Sortieren von Zellen 30 3.2.1.4 Zellen zählen 31 3.2.2 Versuchsaufbau Nachweis IGFBP3 Produktion und Einfluss auf das 2D-Wachstum 32 3.2.3 Versuchsaufbau Nachweis IGF-1-Bindung durch IGFBP3 32 3.2.4 Versuchsaufbau Bestimmung der 3D Proliferation & der Invasion 33 3.2.5 Versuchsaufbau Bestimmung der Migration 34 3.2.6 Zelllysate und Überstände für ELISA-Versuche 343.2.7 ELISA-Verfahren 35 3.2.8 BCA-Protein Assay 36 3.2.9 Versuchsaufbau Einfluss von IGFBP3 auf die Chemosensitivität 37 3.2.10 LDH-Test 37 3.2.11 MTT-Test 38 3.2.12 Bildaufnahmen und Statistische Auswertung 38 4 ERGEBNISSE 39 4.1 Nachweis der Produktion von IGFBP3 39 4.2 Verminderung von freiem IGF-1 nach Überexpression von IGFBP3 41 4.3 Einfluss von IGFBP3 auf das Zellwachstum 43 4.3.1 IGFBP3 hat keinen Einfluss auf das 2D – Wachstum 43 4.3.2 IGFBP3 vermindert die 3D - Proliferation 45 4.4 IGFBP3 vermindert die Invasion der Tumorzellen 48 4.5 IGFBP3 hat keinen Einfluss auf die Migration der Tumorzellen 49 4.6 Einfluss von IGFBP3 auf die Bildung von Angiogenesefaktoren VEGF und bFGF 50 4.7 IGFBP3 hemmt die Freisetzung von MMP-1 52 4.8 Einfluss von IGFBP3 auf die Chemosensitivität 53 4.8.1 Einfluss von IGFBP3 auf 2D- Kulturen nach Zugabe von Cisplatin 53 4.8.2 Einfluss von IGFBP3 auf die 3D- Proliferation nach Zugabe von Cisplatin 56 5 DISKUSSION 59 5.1 Überexpression von IGFBP3 und Verminderung von freiem IGF-1 59 5.2 Wachstum (2D und 3D) 60 5.3 Invasion und MMP-1 62 5.4 Migration 63 5.5 Veränderungen bei der Produktion von Angiogenesefaktoren 64 5.6 Veränderungen bei der Chemosensitivität der H1299- Zellen 65 5.7 Therapeutische Bedeutung von IGFBP3 bei NSCLC 67 6 ZUSAMMENFASSUNG 70 7 LITERATURVERZEICHNIS 73 8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 75 9 TABELLENVERZEICHNIS 75 10 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 76 11 LEBENSLAUF 77 12 DANKSAGUNG 78

Eines der charakteristischen Merkmale des Neuroblastoms stellt seine einzigartige biologische Heterogenität dar, die eine genaue Ausage des weiteren klinischen Verlaufes stark erschwert. Bestimmte prognostisch wirksame klinische, molekularbiologische und genetische Faktoren, wie zum Beispiel Alter bei Erstdiagnose, Tumorstadium, MYCN-Amplifikation und 1p Deletion, werden seit längerem zur Risikostratifizierung genutzt. Bereits in anderen Tumorerkrankungen konnte nun der Einfluß einer Telomerlängenveränderung auf das Gesamtüberleben von Patienten nachgewiesen werden. Telomere sichern die genomische Integrität und bestimmen maßgeblich die proliferative Kapazität jeder somatischen Zelle. Aktuelle Forschungsergebnisse legen die Vermutung nahe, dass Veränderungen der Telomerlänge auch in Neuroblastomen einen prognostischen Effekt auf das Gesamtüberleben haben. In diesem Kontext untersucht die vorliegende Arbeit den Zusammenhang zwischen Telomerlänge und Gesamtüberleben in 420 MYCN nicht-amplifizierten primären Neuroblastomen mit Erstdiagnosen von 1983-2001. Hierfür wurden die relativen Telomerlängen mithilfe einer neu etablierten monochromen multiplex q-RT-PCR ermittelt. Anschließend wurden diese sowohl mit ausgesuchten klinischen Variablen (Alter bei Erstdiagnose, Tumorstadium, Primärlokalisation des Tumors, Histologie, Geschlecht und Rezidivauftreten) korreliert als auch auf ihren Einfluß auf das Gesamt- und ereignisfreie Überleben untersucht. In Korrelation mit den klinischen Parametern konnte zwischen Alter bei Erstdiagnose und Telomerlänge ein eindeutiger Zusammenhang nachgewiesen werden. Je älter die Patienten bei Erstdiagnose, desto höher war sowohl der Anteil verlängerter Telomere als auch der extremer Telomerlängenveränderungen. Neuroblastome mit verlängerten Telomeren zeigten in der gleichen Altersgruppe ein verringertes Gesamtüberleben der betroffenen Patienten verglichen mit Neuroblastomen mit verkürzten Telomeren. Somit könnte eine Telomerlängenveränderung, insbesondere verlängerte Telomere, im klinischen Alltag als Hinweis auf einen prognostisch ungünstigen Verlauf genutzt werden.

Die vorliegende medizinische Dissertation untersucht nicht-invasive bildgebende Verfahren wie die konventionelle Sonographie, die Acoustic radiation force impulse (ARFI)-Elastographie sowie die Transiente Elastographie (TE) zur Detektion von Komplikationen in der Frühphase nach allogener Stammzelltransplantation. Dem kurativen Therapieansatz der Stammzelltransplantation steht ein hohes Komplikationspotential gegenüber. Besonders hepatobiliär treten Graft-versus-host Erkrankungen (GvHD) sowie Gefäßkomplikationen (VOD) auf. Der bisherige diagnostische Goldstandard, die Leberbiopsie, ist als invasives Verfahren mit einer hohen Intra- und Inter-Untersucher-Variabilität sowie der geringen Repräsentativität als Screeningmethode ungeeignet. Die Elastographieverfahren ARFI und TE als nicht-invasive Alternativen ermitteln die Lebergewebesteifigkeit als Surrogatparameter fibrotischer Veränderungen und wurden bereits in zahlreichen Studien als geeignete Diagnoseverfahren für Leberfibrose und -zirrhose unterschiedlicher Ätiologie definiert. Ziel dieser prospektiven Pilotstudie war die Evaluation der genannten Methoden zur Detektion von Frühkomplikationen nach allogener Stammzelltransplantation. Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass sowohl die konventionelle Sonographie als auch die Transiente Elastographie pathologische Organveränderungen vor allem des hepatobiliären Systems detektieren können. Allerdings erscheinen diese Veränderungen unspezifisch. Es bestehen keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten mit und ohne Komplikationen. Anders bei der ARFI-Elastographie. Hier zeigten die Messwerte im linken Leberlappen signifikant höhere Werte bei Patienten mit Komplikationen. Zusammenfassend ist die ARFI-Elastographie zur Prädiktion möglicher Komplikationen nach allogener Stammzelltransplantation geeignet, sollte allerdings mit anderen diagnostischen Verfahren ergänzt werden.:III. Inhaltsverzeichnis I. Vorbemerkungen 2 II. Bibliographische Beschreibung 3 III. Inhaltsverzeichnis 4 IV. Abkürzungsverzeichnis 5 1. Einleitung 1.1. Hämatopoetische Stammzelltransplantation 6 2. Komplikationen nach allogener Stammzelltransplantation und deren Diagnostik 2.1. Akute Komplikationen 8 2.2. Akute und chronische Graft-versus-host Erkrankung 9 2.3. Hepatobiliäre Komplikationen 12 2.3.1. Veno-occlusive disease 12 2.3.2. Drug-induced liver injury 14 2.3.3. Problematik der Diagnostik 16 3. Risikostratifizierung bei Stammzelltransplantation 16 3.1. Karnovsky Index und Eastern Cooperative Oncology Group Index 16 3.2. Hematopoietic cell transplantation comorbidity index 17 3.3. Leberspezifisches Risikoassessment 18 4. Nicht-invasive Leberdiagnostik 19 4.1. Konventionelle Sonographie 19 4.2. Elastographie 20 4.2.1. Transiente Elastographie 21 4.2.2. Acoustic radiation force impulse imaging 22 5. Prospektive Studie: Sonographische Evaluation von Komplikationen in der Frühphase nach allogener Stammzelltransplantation 23 5.1. Methodik 24 5.2. Eigener Arbeitsanteil 24 6. Publikationsmanuskript 25 7. Zusammenfassung 32 8. Literaturverzeichnis 36 9. Selbständigkeitserklärung 44 10. Lebenslauf 45 11. Danksagung 46

Das Neuroblastom ist der dritthäufigste maligne Tumor im Kindesalter und ist für 15% der Todesfälle durch Krebs bei Kindern unter 14 Jahren verantwortlich. Viele molekularbiologische Vorgänge, die zu der heterogenen Prognose der Patienten beitragen, sind noch nicht verstanden. Als Hauptrisikomerkmal stellt sich die Amplifikation und erhöhte Expression von MYCN dar. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Prof. Christiansen zeigte MYCN Einfluss auf die Genregion von Thyroid Cancer 1 (TC1), das als neuer Marker für maligne Schilddrüsenkarzinome erkannt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurden erste Untersuchungen zur prognostischen Bedeutung von TC1 im Neuroblastom, sowie die Charakterisierung eines TC1 Überexpressionsphänotyps humaner Neuroblastomzelllinien unter Einfluss von MYCN durchgeführt. Es wurde ein Überexpressionsvektor von TC1 in die Neuroblastomzelllinie SH-EP eingebracht, welche über ein aktivierbares MYCN- Konstrukt verfügt. Dieser neue Phänotyp wurde bezüglich der Proliferation, des Zellzyklus und der Apoptose im Vergleich zu einer Kontrollzelllinie ohne Überexpression untersucht. Eine In-silico Recherche in der Versteeg Neuroblastomdatenbank ergab eine deutlich bessere Überlebenswahrscheinlichkeit für Patientin mit hoher TC1 Expression. Es konnte gezeigt werden, dass MYCN Amplifikation und Expression in einem Panel von Neuroblastom Zelllinien nicht mit der TC1 Expression korrelieren. Die spezifische Aktivierung von MYCN führte hingegen zu einer Expressionssteigerung von TC1. Weiterhin zeigte sich, dass eine TC1 Überexpression die Proliferation hemmt, indem es die MYCN induzierte G1- S- Phasen- Transition inhibiert. TC1 zeigt antiproliferative Eigenschaften im Zellkulturmodell und stellt sich als neuer prognostisch günstiger Parameter im Neuroblastom dar.

Im Rahmen der Dissertation wurde ein Verfahren zur Quantifizierung monosomer Zellpopulationen innerhalb eines disomen Normalgewebes auf Basis der Pyrosequenzierung von Einzelbasenmutationen etabliert und hinsichtlich seiner Genauigkeit untersucht. Dabei liegt ein besonderer Schwerpunkt auf der Entwicklung eines Verfahrens zur Festlegung von Grenzwerten für die Detektion monosomer Population sowie für genetisch heterogene Subpopulationen. Zur Bestimmung der Genauigkeit wurden Mischreihen von DNA zweier Genotypen angefertigt und das Allelverhältnis durch Pyrosequenzierung gemessen. Diese Ergebnisse wurden genutzt, um Grenzwerte für die Detektion von LOH3-positiven Zellen im UMM estzulegen. In diesen Vorversuchen konnte die Anwendbarkeit der Analysemethode für Proben aus UMM sowohl aus Enukleations wie auch aus Feinnadelaspirationspräparaten demonstriert werden. Es wurde dann in einem weiteren Schritt analysiert, wie viele differente Loci für eine korrekte Diskriminierung zweier Genotypen analysiert werden müssen. Hier wurde gezeigt, dass zum einen die Anzahl der untersuchten SNP aber auch das gemessene Allelverhältnis maßgeblichen Einfluss auf die Genauigkeit der Analyse haben. Basierend auf diesen Daten wurde ein Verfahren entwickelt, das aus der gewünschten Genauigkeit eine Berechnung des Umfangs eines zu etablierenden SNP-Panels ermöglichte.