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In this thesis different aspects of symbiotic interactions in the holobiont Hydra were investigated. The outer mucus-like layer of Hydra’s glycocalyx was identified as the natural habitat of the bacterial microbiota. To investigate the molecular composition of the glycocalyx an integrative transcriptomic and proteomic approach was applied and resulted in the identification of 79 candidate genes. Among these a family of putative antimicrobial peptides (AMPs) was identified and further characterized. Antimicrobial activity is not restricted to epithelium-derived peptides in Hydra. Members of all major neuropeptide classes were shown to possess antimicrobial activity. In particular, a specific neuropeptide, termed NDA-1, was shown to affect the spatial distribution of Hydra’s main colonizer, the Gram-negative Curvibacter sp., suggesting a role for distinct nerve cells in the spatial organization of the microbiota along the Hydra’s body axis. The green hydra, Hydra viridissima, is not only host to bacteria, but in addition harbors unicellular photosynthetic algae of the genus Chlorella in its endodermal epithelial cells. Genome sequencing of the endosymbiont Chlorella sp. A99 and microarray transcriptional profiling of the hydra host were performed. The results indicate a metabolic co-dependence with Chlorella providing the photosynthetic product maltose to Hydra, which in turn up-regulates glutamine synthetase expression to supply the algae with nitrogen in form of glutamine. Interestingly, photosynthesis activity of Chlorella seems to affect not only host gene expression, but also the bacterial microbiota. This work provides the first detailed description of the H. viridissima microbiota and shows that the bacterial community composition fluctuates in light-dependent manner indicating that the photosynthetic activity of endosymbiotic Chlorella algae modulates the bacterial microbiota in the green Hydra holobiont. In dieser Arbeit wurden verschieden Aspekte symbiotischer Interaktionen im Holobiont Hydra untersucht. Die äußere, Mukus-ähnliche Schicht von Hydras Glykokalyx wurde als das natürliche Habitat der bakteriellen Mikrobiota identifiziert. Um die molekulare Zusammensetzung der Glykokalyx zu ermitteln, wurde eine kombinierte Transkriptom- und Proteom-Analyse durchgeführt, die zur Identifizierung von 79 Kandidaten-genen führte. Unter diesen wurde eine Familie putativer antimikrobieller Peptide charakterisiert. Antimikrobielle Aktivität beschränkt sich in Hydra nicht nur auf epitheliale Peptide. Es konnte gezeigt werden, dass Mitglieder aller Hauptklassen von Neuropeptiden antimikrobielle Aktivität besitzen und ein spezielles Neuropeptid, NDA 1, die räumliche Verteilung des Gram-negativen Hauptkolonisierers Curvibacter sp. beeinflusst. Dies deutet auf eine Funktion von Neuronen bei der räumlichen Organisation der Mikrobiota entlang der Hydra Körperachse hin. Die grüne Hydra, Hydra viridissima, ist nicht nur Wirt für Bakterien, sondern beherbergt auch einzellige, photosynthetische Algen der Art Chlorella in den endodermalen Epithelzellen. Es wurde eine Genomsequenzierung des Endosymbionten Chlorella sp. A99 und eine Transkriptionsanalyse des Hydra Wirts durchgeführt. Die Ergebnisse weisen auf eine metabolische Abhängigkeit hin, wobei Chlorella das Photosyntheseprodukt Maltose an Hydra liefert, woraufhin der Polyp die Glutaminsynthetase-Expression hochreguliert, um die Alge mit Stickstoff in Form von Glutamin zu versorgen. Interessanterweise beeinflusst die photosynthetische Aktivität von Chlorella nicht nur die Genexpression des Hydra Wirts, sondern auch die bakterielle Mikrobiota. Diese Arbeit beinhaltet die erste detaillierte Beschreibung der H. viridissima Mikrobiota, wobei die bakterielle Zusammensetzung Licht-abhängigen Fluktuationen unterliegt. Dies deutet darauf hin, dass die photosynthetische Aktivität der endosymbiotischen Alge die bakterielle Mikrobiota im H. viridissima Holobiont moduliert

Die Expression des Fas-Liganden wird u.a. durch posttranslationale Modifikationen reguliert, z.B. durch proteolytische Prozessierung. Die Aktivierung von T-Zellen durch TPA/Ionomycin bzw. T-Zellrezeptor/CD3/CD28-Stimulation führt zum gesteigerten Shedding durch die Metalloproteasen ADAM10 und/oder ADAM17. TZR/CD3/CD28-Aktivierung führt weiterhin zu einer partiellen Translokation der Proteasen und des FasL zu Detergenz-resistenten Membranen (DRMs). The expression of the death factor Fas Ligand in T cells is tightly controlled by several posttranslational modifications, e.g. proteolytic processing. Activation of T cells by TPA/Ionomycin or activation of the T cell receptor (TCR)/CD3/CD28-complex increases FasL proteolysis by ADAM10 and/or ADAM17. Moreover, TCR/CD3/CD28-stimulation results in partial translocation of ADAM10, ADAM17 and FasL to detergent-resistent membranes (DRMs).

Ziel dieser Doktorarbeit war die systematische Überprüfung und Validierung differentiell exprimierter GPCRs und GPCR-bezogener Proteine, die als neue potentielle Therapieziele die Diagnose und Behandlung des Magenkarzinoms verbessern könnten. Im Ergebnis konnte die tumorbiologische Bedeutung von CXCL12, CXCR4, FZD7, ADAM17 und LGR5 im Magenkarzinom bestätigt werden. Die Erkenntnisse über die Verbreitung, Lokalisation und Funktion des Stammzellmarkers LGR5 in dieser Arbeit tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen der Entstehung und Progression des Magenkarzinoms bei. LGR5 könnte daher als vielfältig einsetzbarer Biomarker die Identifizierung und Charakterisierung von Krebsstammzellpopulationen in hepato-gastrointestinalen Tumoren ermöglichen und so zur Entwicklung effektiver und zielgerichteter Krebstherapien führen. The aim of this doctoral thesis was to systematically review and validate differentially expressed GPCRs and GPCR-related proteins which may serve as new potential therapeutic targets to improve the quality of diagnosis and treatment in gastric carcinoma. The systematic analysis confirmed a tumorbiological relevance of CXCL12, CXCR4, FZD7, ADAM17, and LGR5 in gastric cancer. Insights of the prevalence, histoanatomical distribution, and function of the stem cell marker LGR5 led to a better understanding of molecular mechanisms in gastric cancer development and progression. LGR5 therefore may serve as a broadly applicable biomarker, facilitating the identification and characterization of cancer stem cell populations in hepato-gastrointestinal tumors and thus enable the development of more effective and targeted cancer therapies.

Die Schleimhaut des Darmtraktes ist charakterisiert durch komplexe metabolische und immunologische Prozesse und wird gesteuert durch hochdynamische Genexpressions-Programme. Mit der Verfügbarkeit von next generation sequencing und ihrer Nutzbarkeit für die Analyse von RNA-Sequenzen wurde die Genauigkeit über die globale Architektur des Transkriptoms gegenüber anderen Methoden wie microarrays auf eine neue Ebene befördert. Basierend auf dem 3‘ Oligo-dT priming von polyadenylierten Boten-RNA gefolgt von reverser Transkription und einem sogenannten template switch wurde eine Methode für RNA-Seq auf der Life Technologies SOLiD Plattform etabliert. Dieser Ansatz zeigte zuverlässige Informationen über das untersuchte Gewebe, z. B. in Bezug auf Genexpression und der Beobachtung von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen im Genom. In dieser Arbeit wird über die Tiefencharakterisierung des polyadenylierten Transkriptoms in zwei nah verwandten, dennoch unterschiedlichen Geweben des murinen Intestinaltrakts (Dünn- und Dickdarm) berichtet. Eine gewebespezifische Architektur des Transkriptoms und die Präsenz von zuvor nicht bekannten Bereichen transkriptioneller Aktivität wurden gefunden. Im ersten Schritt wurden Signaturen von 20.541 NCBI-RefSeq-Transkripten im Darm identifiziert (74,1 % der annotierten Gene), davon fanden sich 16.742 in beiden untersuchten Geweben. Obwohl die Mehrheit der Sequenzen annotierten Genen zugeordnet werden konnten, fanden sich 27.543 nicht-annotierte, transkriptionell aktive Regionen im Genom im Widerspruch zur aktuellen Genannotationen von RefSeq oder Ensembl. Unter Nutzung eines zweiten, unabhängigen, strangspezifischen Protokolls konnten 20.966 dieser Befunde bestätigt werden, die Mehrheit davon in direkter Nähe zu bekannten Genen. In der Folge wurden die Befunde bezüglich ihrer Nähe zu beschriebenen Exon-Elementen kategorisiert. Regionale Unterschiede zwischen Dünn- und Dickdarm dieser transkriptionell-aktiven, aber nicht annotierten Elemente wurden untersucht. Die vorliegende Arbeit demonstriert die Komplexität eines typischen intestinalen mRNA-Transkriptoms von Säugetieren anhand einer strangspezifischen Auflösung bis hin zur Einzelbase. Die Analysen zeigten zum ersten Mal ein strangspezifisches Bild von nicht-annotierten, transkriptionell aktiven Bereichen in zwei Geweben und repräsentieren eine Ressource für weitere Untersuchungen transkriptioneller Prozesse, welche zur molekularen Gewebeidentität beitragen. Die mittels RNA-Seq in dieser Arbeit erhobenen Daten waren von hoher, zuvor nicht zugänglicher Qualität, so dass RNA-Seq in der Zukunft vermutlich die neue Standardmethode für die genomweite Untersuchung des Transkriptoms darstellen wird. The intestinal mucosa is characterized by complex metabolic and immunological processes driven highly dynamic gene expression programs. With the advent of next generation sequencing and its utilization for the analysis of the RNA sequence space, the level of detail on the global architecture of the transcriptome reached a new order of magnitude compared to other methods like microarrays. A method for RNA-Seq based on 3’ oligo-dT priming of polyadenylated messenger RNA followed by reverse transcription and a template switch was established on the Life Technologies SOLiD platform. This approach showed robust information about the characterized tissue, for example in terms of gene expression and the observation of non-annotated transcriptionally active regions of the genome. This thesis reports the ultra-deep characterization of the polyadenylated transcriptome in two closely related, yet distinct regions of the mouse intestinal tract (small intestine and colon). The tissue-specific transcriptomal architecture and the presence of novel transcriptionally active regions were assessed. In the first step, signatures of 20,541 NCBI RefSeq transcripts could be identified in the intestine (74.1% of annotated genes), thereof 16,742 are common in both tissues. Although the majority of reads could be linked to annotated genes, 27,543 non-annotated transcriptionally active regions not consistent with current gene annotations in RefSeq or Ensembl were identified. By use of a second independent strand-specific RNA-Seq protocol, 20,966 of these nTARs were confirmed, most of them in vicinity of known genes. This thesis further categorized the findings by their relative adjacency to described exonic elements and investigated regional differences of novel transcribed elements in small intestine and colon. The current study demonstrates the complexity of an archetypal mammalian intestinal mRNA transcriptome in high resolution and identifies novel transcriptionally active regions at strand-specific, single base resolution. The analysis for the first time shows a strand-specific comparative picture of non-annotated transcriptionally active regions in two tissues and represents a resource for further investigation of the transcriptional processes that contribute to molecular tissue identity. RNA-Seq generated data showed high, to date unseen quality. This suggests that RNA-Seq will be the new standard method for genome-wide analysis of the transcriptome.

Im ersten Teil der Dissertation wird ein Tertiärstrukturmodell der p28 Untereinheit von IL-27, sowie ein Modell der Interaktion von p28 und dem Rezeptor gp130 vorgestellt. Laut Modell beruht die Interaktion auf einer im Vergleich zu IL-6 erhöhten Affinität zwischen den Aminosäureresten der AB Schleife von p28 und dem N-Terminus von gp130. Der zweite Teil der Dissertation behandelt das Designer-Peptid C3, besteht aus rekombinierten Primärstruktursegmenten der humanen Beta-Defensine 2 und 3. C3 verfügt über eine im Vergleich zu den Ursprungsmolekülen erhöhte antimikrobielle Aktivität. Um den Wirkmechanismus des Peptids zu bestimmen, wurde die Tertiärstruktur von C3 mittels homonuklearer 2D-NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Die ermittelte Tertiärstruktur weist eine hohe strukturelle Verwandtschaft zu den Beta-Defensinen auf, verfügt aber über eine erhöhte Flexibilität bei hoher kationischer Ladungsdichte.

In der Therapie von epithelialen Karzinomen spielt die Behandlung mit Antigen-spezifischen Antikörpern eine große Rolle. Bei der Entwicklung von therapeutischen Antikörpern erwies sich der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (EGFR) als geeignete Zielstruktur. Endogen exprimiert erfüllt er wichtige physiologische Funktionen bei der Entwicklung und Aufrechterhaltung der Epithelien. Die Überexpression des EGFR führt zu einem konstitutiven Anschalten von karzinomfördernden Signalwegen. Zwar sind die bisher klinisch erprobten Antikörper vom IgG-Isotyp, jedoch verfügen Antikörper vom IgA-Isotyp über interessante Eigenschaften. Im Gegensatz zu IgG- rekrutieren IgA-Antikörper keine NK-Zellen und aktivieren Monozyten und besonders effektiv Granulozyten. Diese stellen zwei für die Bekämpfung von soliden Tumoren wichtige und prozentual größere Effektorzellpopulationen dar. Zusätzlich ließe sich das Potential dieser Zellen durch Zugabe von Cytokinen (GM-CSF, G-CSF) weiter steigern. Im Unterschied zu IgG- diffundieren IgA-Antikörper in ihrer dimeren Form schneller durch Basalmembranen und werden durch Transzytose auf Epithelien transportiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Verfahren für die Produktion und Aufreinigung von rekombinanten EGFR-gerichteten IgA-Antikörpern etabliert werden. Somit wird es nun möglich, ausreichende Mengen für klinische Anwendungen herzustellen. An den C-Terminus der J-Kette wurde eine Penta-Histidin-Markierung fusioniert. Dadurch war es möglich dimeres IgA spezifisch aufzureinigen und die Inkorporation der J-Kette nachzuverfolgen. Die weitere biochemische Charakterisierung ergab, dass die aufgereinigten Konstrukte aus korrekt zusammengebauten hochreinen monomerem und dimerem IgA bestanden. Die Charakterisierung der funktionellen Eigenschaften zeigte, dass die hergestellten IgA-Antikörper vergleichbar zu Kontrollantikörpern an EGFR und FcαRI banden sowie die Ligandenbindung blockierten, das Tumorzellwachstum inhibierten und antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxicität (ADCC) vermittelten. Zum ersten Mal konnte gezeigt werden, dass hochreines definiertes monomeres und insbesondere dimeres IgA in der Lage waren Granulozyten und Monozyten zu rekrutieren. Dabei war der IgA2-Isotyp am effektivsten im Induzieren von ADCC. Dimeres IgA war in seiner direkten und indirekten Wirkung auf Tumorzellen effektiver als monomeres IgA. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass dimeres IgA durch die Bindung an den pIgR mittels Transzytose eine Epithelzellschicht durchquerte. Darüber hinaus konnte für alle IgA-Antikörper gezeigt werden, dass sie nicht das Komplementsystem für die Lyse von Tumorzellen induzieren konnten. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit wichtige Voraussetzungen für nachfolgende (in vivo-) Experimente geschaffen werden.

Identifikation und funktionelle Analyse von Genen, die den Lebenszyklus von Aurelia aurita kontrollieren

Das Mantelzell-Lymphom ist eine maligne Erkrankung des lymphatischen Sytems und gehört zu den B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen. Als primäre genetische Veränderung tragen fast alle Mantelzell Lymphome die charakteristische Translokation t(11;14)(q13;q32), infolgedessen Cyclin D1 in den Tumorzellen überexprimiert wird. Anhand von transgenen Mausmodellen konnte allerdings gezeigt werden, dass diese strukturelle Aberration für eine maligne Transformation nicht ausreichend ist. Vielmehr spielen zusätzliche sekundäre genetische Veränderungen bei der Entstehung und Progression des Mantelzell-Lymphoms eine entscheidende Rolle. Diese tragen möglicherweise über gonosomale Effekte auch zu der bislang noch ungeklärten Prädominanz des männlichen Geschlechts bei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei verschiedene Microarray Technologien zur genomweiten Identifizierung und Charakterisierung sekundärer Aberrationen bei Mantelzell-Lymphomen eingesetzt. Mit der Gene Identification by Nonsense-mediated mRNA Decay Inhibition (GINI)-Technologie sollten in zwei Mantelzell-Lymphom-Zelllinien potentielle Tumorsuppressorgene identifiziert werden, die durch Nonsense Mutationen inaktiviert werden. Insgesamt wurden 26 solcher Gene mittels GINI detektiert. In den zwei bislang untersuchten Kandidatengenen konnten allerdings keine Nonsense-Mutationen sondern lediglich Spleißvarianten identifiziert werden. Die Ergebnisse der GINI-Analysen führten zu einer kritischen Einschätzung der Methode, die sehr anfällig für falsch-positive Ergebnisse scheint. Des Weiteren wurden in dieser Arbeit die BAC/PAC-basierten ArrayCGH-Daten von 68 primären Mantelzell Lymphomen und neun Mantelzell-Lymphom-Zelllinien bezüglich X chromosomaler Imbalancen ausgewertet. Es konnten eine homozygote Deletion in Xp22.3 und rekurrente Zugewinne in der Chromosomenregion Xq27.3-Xq28 identifiziert werden. Mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) wurden diese Aberrationen bezüglich ihrer Bruchpunkte genauer charakterisiert und die minimal betroffenen Regionen bestimmt. Als dritte Microarray-Technologie wurde das 100K GeneChip® Mapping eingesetzt, mit dem 26 primäre Mantelzell-Lymphome und sechs Mantelzell-Lymphom-Zelllinien analysiert wurden. Mit dieser Technologie konnte die Auflösung gegenüber der BAC/PAC-basierten ArrayCGH deutlich verbessert werden. Genomweit ließen sich mit Hilfe der 100K GeneChip®-Arrays neben bereits bekannten Imbalancen 12 neue Regionen mit rekurrenten Zugewinnen oder Verlusten identifizieren. In die Aberrationen waren Gene mit typischen Tumorsuppressor- und Onkogeneigenschaften involviert, wie beispielweise FOXP1, MYCBP2, CDKN2AIP, ING/P33, und CDKN1B/P27. Des Weiteren ließ sich mit dieser zur Genotypisierung geeigneten Technologie erstmals zeigen, dass partielle uniparentale Disomien (pUPD) bei Mantelzell-Lymphomen rekurrent auftreten und hier einen alternativen Mechanismus der Tumorsuppressorgen-Inaktivierung darstellen. Vor allem durch die Detektion von 21 kleinen High-Level-Amplifikationen und 21 mittels PCR oder FISH bestätigten homozygoten Deletionen konnten eine Reihe neuer potentieller Tumorsuppressor- und Onkogene identifiziert werden, wie z.B. das amplifizierte MAP6-Gen oder die deletierten Gene MAP2, MOBKL2B, IFNK, GRIN2B und FGF14. Anschließende zytogenetische, molekulargenetische und epigenetische Untersuchungen ausgesuchter Aberrationen und Kandidatengene lieferten Hinweise, dass rekurrente Veränderungen von Genen, die für Mikrotubuli-assoziierte Proteine wie MAP2, MAP6 und TP53 kodieren, in die Pathogenese des Mantelzell-Lymphoms involviert sind. Neunzehn primäre Mantelzell-Lymphome und fünf Mantelzell-Lymphom-Zelllinien zeigten Veränderungen in einem dieser drei Gene. Mit der Detektion rekurrenter X chromosomaler Deletionen der pseudoautosomalen Region 1 in Verbindung mit häufigen Verlusten des Y Chromosoms konnte außerdem eine geschlechtschromosomale Aberration identifiziert werden, die mit der charakteristischen Prädominanz des männlichen Geschlechts bei Mantelzell-Lymphomen assoziiert sein könnte. Somit konnten in dieser Arbeit 1. verschiedene neue Tumorsuppressor- und Onkogenkandidaten identifiziert und initial charakterisiert werden, 2. pUPD als neuer molekularer Mechanismus der Mantelzell-Lymphom-Genese nachgewiesen werden, 3. Veränderungen Mikrotubuli-assoziierter Gene als neuer Pathomechanismus bei Mantelzell-Lymphomen beschrieben werden sowie 4. ein pseudoautosomaler Genort identifiziert und eingegrenzt werden, der möglicherweise mit der männlichen Prädominanz bei Mantelzell-Lymphomen assoziiert ist. Diese Erkenntnisse und darauf aufbauende weiterführende Studien könnten zu einem besseren Verständnis der genetischen Ursachen sowie zu einer verbesserten Prognoseabschätzung und Therapie bei Mantelzell-Lymphomen beitragen.

Die Aktivierung von Onkogenen durch Translokationen oder somatische Mutationen trägt wesentlich zur Pathogenese von Lymphomen bei. Im Verbundprojekt „Molekulare Mechanismen maligner Lymphome“ generierte Genexpressionsprofile und molekularzytogenetische Daten ermöglichten eine Klassifizierung von 228 histologisch diagnostizierten aggressiven B-Zell-Lymphomen in molekulare Burkitt-Lymphome (mBL), non-mBL sowie eine Intermediate-Gruppe. Im Fokus dieser Arbeit stand die Mutationsanalyse der klonal rearrangierten Immunglobulinschwerkettengene (IgH) in den molekularen Gruppen, um mögliche weitere Subgruppen zu identifizieren und einen Zusammenhang zwischen somatischer Hypermutation, genetischer Instabilität und charakteristischen Gen-Translokationen in verschiedenen Stadien der B-Zell-Ontogenese herzustellen. Der Einfluss der somatischen Hypermutation auf bekannte, für die Pathogenese aggressiver Lymphome relevante Proto-Onkogene (c-MYC, BCL6, c-REL) sowie eine mögliche prognostische Bedeutung stellten eine weitere zentrale Frage dar. Die Mutationsanalyse wurde mittels eines kombinierten Verfahrens aus PCR, Denaturierender Hochleistungs-Flüssigchromatographie (dHPLC), Klonierung und Sequenzierung von DNA-Fragmenten spezifischer Genregionen der genannten IgH- sowie Proto-Onkogene durchgeführt. Innerhalb der molekularen Gruppen konnten anhand der Ergebnisse der IgH-Mutationsanalyse weitere Subgruppen unterschiedlicher Genese definiert werden. Die Gruppe der paediatrischen mBL weist trotz eines übereinstimmenden Genexpressionsprofils mit adulten mBL offensichtlich eine andere Genese auf, die vermutlich auf die Aktivierung des lymphatischen Systems durch Infektionen, Vakzine oder Autoantigene zurückzuführen ist. Die Gruppe der MYC.pos Lymphome konnte anhand des IgH-Mutationsstatus in weitere molekulare Subgruppen differenziert werden, die im Rahmen der Lymphomentstehung zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine chromosomale Schädigung erfahren. Die Ergebnisse lassen einen sequenziellen Ablauf von Chromosomentranslokationen (primäres und sekundäres Bruchereignis) und darauf basierend verschiedene Mechanismen der malignen Transformation vermuten. Daraus ergeben sich auch wichtige Implikationen für die Prognose aggressiver Lymphome. Die Ergebnisse belegen, dass die Präsenz einer aberranten somatischen Hypermutationsmaschinerie und ihr Einfluss auf verschiedene Onkogene offensichtlich einen potenten Mechanismus für die maligne Transformation lymphatischer B-Zellen darstellt, der wahrscheinlich auch die Aktivierung bislang unbekannter Onkogene einschließt.

Neben der hochspezifischen zellvermittelten Immunantwort höherer Organismen besitzen sowohl Wirbeltiere als auch Wirbellose Mechanismen zur unspezifischen Abwehr von Pathogenen. Schlüsselmoleküle dieser so genannten angeborenen Immunantwort sind die antimikrobiellen Peptide. Die Seescheide Ciona intestinalis ist als am Meeresgrund lebender Filtrierer einer ständigen Infektionsgefahr durch im Meerwasser lebende Mikroben ausgesetzt. Es ist daher anzunehmen, dass C. intestinalis ein effizientes Abwehrsystem aufweist, das den Besitz hoch wirksamer antimikrobieller Effektormoleküle einschließt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mehrere antimikrobielle Peptide aus verschiedenen Geweben von C. intestinalis gereinigt werden, für die eine besondere Barrierefunktion gegen eindringende Mikroorganismen angenommen wurde. Allerdings konnte die Primärstruktur der isolierten Peptide jeweils nur teilweise aufgeklärt werden. Gründe hierfür waren posttranslationale Modifikationen sowie die Existenz einer kryptischen Art und die damit verbundenen Probleme bei massenspektrometrischen Analysen und Edman-Sequenzierungen. Daraufhin wurde eine Methode der in silico Analyse entwickelt, über die in der EST-Datenbank von C. intestinalis zwei Genfamilien (Ci-mam und Ci-pap) identifiziert werden konnten, deren einzelne Mitglieder für mutmaßliche Vorläufermoleküle antimikrobieller Peptide codieren. Diese Annahme wurde durch die Ergebnisse einer semiquantitativen RT-PCR Analyse gestützt, wonach die Transkriptionsrate einiger Mitglieder der beiden Genfamilien nach Immunstimulation in Hämozyten deutlich hochreguliert wurde. Die beiden abgeleiteten synthetischen Peptide Ci-MAM-A24 und Ci-PAP-A22 wiesen eine starke Aktivität gegen eine Reihe von grampositiven und gramnegativen Bakterien auf einschließlich Pathogenen des Menschen und mariner Wirbelloser. Außerdem waren beide Peptide aktiv gegen den opportunistisch humanpathogenen Pilz Candida albicans. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass grampositive und gramnegative Bakterien von beiden Peptiden durch die Permeabilisierung ihrer zytoplasmatischen Membran getötet werden. Die Wirksamkeit der Peptide blieb bei verschiedenen pH-Werten bestehen und insbesondere zeigte sich die antibakterielle Aktivität von Ci-MAM-A24 außergewöhnlich tolerant gegenüber erhöhten Salzkonzentrationen. Dagegen waren die Peptide praktisch nicht zytolytisch gegen Erythrozyten von Säugetieren. Die Kombination dieser Eigenschaften macht die beiden synthetischen Peptide zu viel versprechenden Kandidaten für die Entwicklung neuartiger Antibiotika. Immunozytochemische Analysen und in situ Hybridisierungen ergaben, dass die entsprechenden natürlichen Peptide Ci-MAM-A und Ci-PAP-A in univakuolären Granulozyten synthetisiert und in dem charakteristischen großen Kompartiment dieser Zellen gespeichert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass im Genom von C. intestinalis keine Gene identifiziert wurden, deren Produkte antimikrobiellen Peptiden anderer Organismen ähneln, stellen die beiden beschriebenen Peptidfamilien höchst wahrscheinlich wichtige Effektormoleküle der Hämozyten zur Abwehr mikrobieller Infektionen bei Seescheiden dar.

TGF-β1 ist ein Zytokin, das an der Regulation verschiedenster biologischer Prozesse beteiligt ist und u.a. die Bildung der extrazellulären Matrix durch die Induktion des kleinen leucin-reichen Proteoglykans Biglykan (BGN) fördert. Die intrazelluläre Signaltransduktion, die zur Aktivierung des BGN Gens führt, ist sehr komplex und abhängig von der Aktivierung des Smad- (Chen et al., 2002) und des p38-MAPK-Signalweges (Ungefroren et al., 2003), wobei beide über das „stress response“ Gen GADD45β miteinander verknüpft sind (Ungefroren et al., 2005). Unter Einsatz verschiedener kinase-defizienter und kinase-aktiver Mutanten sowie spezifischer pharmakologischer Inhibitoren in der TGF-β responsiven Pankreaskarzinomzelllinie Panc-1 konnte gezeigt werden, dass die Kinaseaktivität und die Smad-aktivierende Funktion des TGF-β Typ I Rezeptors (ALK5) für die Induktion der BGN-Expression erforderlich sind. Durch Experimente, in denen Panc-1-Zellen in Suspension kultiviert oder mit dem Zytoskelett zerstörenden Toxin Cytochalasin D behandelt wurden, konnte gezeigt werden, dass der TGF-β-Effekt auf BGN abhängig von der Zelladhäsion ist. In einer weiteren Versuchsreihe, in denen Panc-1-Zellen mit einem Rac1-Inhibitor behandelt wurden, konnte deutlich gemacht werden, dass der TGF-β-Effekt auf BGN durch die kleine GTPase Rac1, die auch an der Weiterleitung von Adhäsions-Signalen beteiligt ist, vermittelt wird. Außerdem konnte in dieser Arbeit mit Hilfe von Panc-1-Zellen, die unterschiedliche Rac1-Mutanten (dnRac1, WT-Rac1, caRac1) ektop exprimierten, unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen der Zellen (adhärent oder in Suspension) gezeigt werden, dass Rac1 auf der Ebene von p38 wirkt und keinen Einfluss auf die Smad3-Aktivierung und die GADD45β-Induktion hat. Schließlich konnte durch die pharmakologische Inhibition des NAD(P)H-Oxidase-Komplexes mittels Diphenyleniodoniumchlorid (DPI) gezeigt werden, dass Rac1 seine Funktion bei der p38-Aktivierung als Untereinheit der reaktive Sauerstoffspezies (ROS: „reactive oxygen species“)-produzierenden NAD(P)H-Oxidase ausübt. Dass auch ROS selbst eine wichtige Rolle bei der TGF-β-Regulation von BGN spielen, konnte durch Experimente mit Radikalfängern und Antioxidantien demonstriert werden. Die Vermutung, dass die NAD(P)H-Oxidase als Quelle der ROS-Produktion an diesem Prozess beteiligt ist, wurde weiterhin dadurch unterstützt, dass in den Panc-1-Zellen verschiedene Nox und phox Untereinheiten dieses Enzymkomplexes exprimiert werden. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit die Effekte der TGF-β-Signalwirkung auf das Wachstumsverhalten von Pankreaskarzinomzellen in vitro und auf ihre Tumorigenität in vivo analysiert. Dazu wurden die biochemischen und zellulären Effekte von zwei ALK5-Mutanten nach Überexpression in Panc-1-Zellen untersucht. Diese Mutanten besitzen beide eine intakte Kinase-Domäne, unterscheiden sich aber in ihrer Fähigkeit, Smads zu aktivieren, wobei konstitutiv-aktives RImL45 (caRImL45) aufgrund einer Mutation in der L45-Schleife, im Gegensatz zu konstitutiv-aktivem ALK5 (caALK) keine Smads binden kann. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die stabile Expression von caALK5 (im Gegensatz zu caRImL45) den antiproliferativen Effekt von TGF-β nachahmen konnte, was auf der Fähigkeit dieser Mutante beruht, den Smad-Signalweg zu aktivieren. Im Gegensatz zu den caRImL45-transduzierten Panc-1-Zellen zeigten caALK5-transduzierte Zellen eine epitheliale-mesenchymale Transdifferenzierung (EMT) und eine erhöhte Expression von metastasierungs-assoziierten Genen. Zusätzlich kam es in diesen Zellen zu einem erhöhten Expressionsverhältnis von anti-angiogenen (TSP-1, PAI-1) zu pro-angiogenen Faktoren (VEGF-A). Nach einer orthotopen Transplantation dieser Zellen in immundefiziente Mäuse kam es durch caALK5 im Gegensatz zu caRImL45 zu einer Reduktion des Primärtumorwachstums kam. Allerdings förderte diese Mutante im Gegensatz zu caRImL45 die Bildung von Lebermetastasen, woraus geschlossen werden kann, dass der Smad-Signalweg in Bezug auf den Primärtumor zwar anti-onkogen, in Bezug auf die Metastasenbildung aber pro-onkogen wirkt.

vIL-6 ist ein von dem Virus HHV-8 codiertes Zytokin, dem eine große Bedeutung in HHV-8-assoziierten Erkrankungen zugeschrieben wird. Es signalisiert wie humanes IL-6 durch Bindung an den Rezeptor gp130, wobei vIL-6 im Gegensatz zu humanem IL-6 ohne Beteiligung des spezifischen IL-6R an gp130 binden kann. Zur Untersuchung der pathophysiologischen Bedeutung von vIL-6 wurden vIL-6-transgene Mäuse generiert, die vIL-6 leberspezifisch exprimieren. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinantes vIL-6 nach intraperitonealer Injektion in Mäusen eine Akute-Phase-Reaktion hervorruft. Bei den transgenen Mäusen, die vIL-6 exprimieren, war jedoch weder eine Akute-Phase-Reaktion noch ein vIL-6 induzierter Phänotyp nachweisbar. Neue Erkenntnisse deuten auf eine vorwiegend autokrine Wirkung von vIL-6 hin. So ist vIL-6 in der Lage intrazellulär ein Signal auszulösen. Es wurden daher neue transgene Mäuse generiert, bei denen vIL-6 in Zellen exprimiert wird, die von HHV-8 Infektionen betroffen sind. Erste Ergebnisse deuten bei diesen Mäusen auf einen durch vIL-6 induzierten Phänotyp hin, so dass diese Mäuse als Modell für die pathophysiologischen Eigenschaften von vIL-6 dienen und die Möglichkeit eröffnen könnten, neue, gegen vIL-6 gerichtete Therapieansätze zu testen.

(Keine Zusammenfassung in deutscher Sprache vorhanden.) (No summary in German language.) Almost nothing is known about the molecular mechanisms, underlying allorecognition in invertebrates. In this work two different approaches were used to get insights into how the urochordate Ciona intestinalis distinguishes self from non-self. In the first approach a yeast two-hybrid system was used to search for the ligand of the previously identified Nk-cell receptor ciCD94-1. This is of a particular interest, because the conventional ligands of CD94 in jawed vertebrates are MHC-class I proteins (HLA-E), which have not been identified outside the jawed vertebrates so far. Therefore, the goal of this approach was the identification of a presumably novel ligand for the conserved CD94-like receptor in Ciona. Within the five identified possible candidate ligands, according to the results of the controls and its protein structure, one protein seems to be a good potential interaction partner of ciCD94-1. Nevertheless the interaction shown in the yeast two-hybrid system has to be proven by an independent method. In the second approach a new unbiased screening method based on suppression subtractive hybridization was established to identify variable, proteins which are present in ovaries of Ciona intestinalis and which may be responsible for self-incompatibility reactions. Several groups of variable molecules were identified. Two of them were selected for further detailed analysis. One group of proteins shows homology to the self sterility receptor HrVC70 from Halocynthia roretzi and the other one shows structural similarity to complement receptors of vertebrates. All candidates proved to be more variable than the control genes, therefore they belong to a class of variable genes in Ciona intestinalis. The genes, showing homology to HrVC70, were shown to be expressed in oocytes. The other gene (vCRL1) with structural similarities to complement receptors showed an exceptional high inter- and intraindividual variability. Due to the fact, that vCRL1 is expressed in follicle cells, vCRL1 seems to be a good candidate gene for a self sterility receptor in Ciona intestinalis. Therefore, complement-like proteins may play a role in self/non-self recognition in urochordates

Für maligne Erkrankungen des hämatopoetischen Systems stellt die allogene Knochenmarktransplantation ein gut etabliertes Therapieverfahren dar. Der kurative Effekt einer solchen Behandlung liegt in der Erkennung und Zerstörung maligner Zellen durch im Transplantat enthaltene immunkompetente Zellen (Graft-versus-Leukämie (GvL)-Effekt). Hauptnebenwirkung der Knochenmarktransplantation stellt die Graft-versus-host Erkrankung (GvHD) dar, eine Immunreaktion der transplantierten Zellen gegen Empfängergewebe. Diese kann einen schweren bis tödlichen Verlauf nehmen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren geprüft, T-Zellen in vitro aufgrund von Proliferationsunterschieden gegenüber allogenen Stimuli zu trennen. Die Separation erfolgte mittels einer Farbstoffverdünnungsmethode („CFSE“) und anschließender FACS-Sortierung. Zytotoxizitätsmessungen zeigen, dass in vitro proliferierende Zellen („low“) im Gegensatz zur ruhenden Zellfraktion („high“) zytolytische Aktivität gegenüber Rezipientenzellen zeigen. Im Kontext allogener Knochen-marktransplantation im Mausmodell wurden die in vivo-Effekte der erhaltenen T-Zellpopulationen untersucht. Im Gegensatz zu alloreaktiven T-Zellen („low“) induzieren in vitro ruhende Zellen in zwei unterschiedlichen Transplantationsmodellen keine GvHD. Eine verbleibende Reaktivität der „high“-Zellen gegenüber unverwandten Antigenen konnte nach Reisolation demonstriert werden. Jedoch vermitteln die transplantierten „high“-Zellen – im MHC-identen Modellsystem – keine Tumorabstoßung (Verlust des GvL-Effektes). Die Gewinnung tumorreaktiver T-Zellen mittels dieses Separationsverfahrens und deren Transplantation scheinen jedoch erfolgversprechend, da durch Transfer dieser T-Zellen die Induktion einer GvHD vermieden werden kann, bei erwiesener Tumorreaktivität.

Die vorliegende Arbeit umfasst eine weiterführende Charakterisierung des TNF-R1 und seiner nachgeschalteten Signalwege in Abhängigkeit von den einzelnen zytoplasmatischen Domänen. Nach Bindung von TNF am TNF-R1 kommt es zur Internalisierung des Rezeptors und Bildung eines DISC (Zelltod induzierender Signalkomplex). Für diesen Schritt ist die Internalisierung essentiell. Es konnte neu gezeigt werden, dass, neben direkter Aktivierung von Caspase 3 und des mitochondrialen Signalweges, auch Proteine des endolysosomalen Kompartiments aktiviert werden. So wird die Protease Cathepsin D durch freigesetztes Ceramid aktiviert und ist dann in der Lage das proapoptotische Bcl2-Protein Bid zu aktivieren und so den mitochondrialen Weg der Apoptose zu induzieren. Weiter konnte gezeigt werden, dass durch Deletion der Internalisierungsdomäne des TNF-R1 der Rezeptor in der Plasmamembran verweilt und so über die neutrale SMase-Domäne die N-SMase aktivieren kann. Dieser Schritt führt zur Aktivierung der Caspase 3 und somit ebenfalls zur Apoptose der Zelle.