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Diabetic retinopathy is one of the major causes of blindness worldwide. Among the wide range of potential therapies for type 2 diabetes, inhibitors of the dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) like sitagliptin have proven to be highly useful and effective, but their effect in the context of disease-associated retinopathy remains to be elucidated. Both in vitro and in vivo data regarding the interactions of sitagliptin with the barrier of retinal endothelial cells (REC) are inconsistent and a potentially higher risk for diabetic retinopathy and macular edema due to a dysregulated endothelial barrier cannot be excluded. Barrier properties of immortalized endothelial cells of the bovine retina (iBREC) were therefore investigated by continuous monitoring of the cell index (CI) in presence of sitagliptin (10 ��� 1000 nM). After remaining stable at first, the CI declined significantly and persistently. Following on from the research group���s preliminary investigations, the focus of this thesis was crucial proteins for transcellular and paracellular stability and adhesion of the cells to the extracellular matrix. Interestingly, the expression of the tight-junction protein claudin-1 ��� important for paracellular tightness ��� visualized by western blot imaging was increased after exposure to sitagliptin. In contrast, expressions of CD29 and CD9 ��� both relevant adhesion proteins ��� decreased. Furthermore, immunofluorescent staining detected less CD9 at the plasma membrane. In summary, it can be stated that the declined CI most likely derives from a dysfunctional adherence of iBREC to the extracellular matrix and rather not from dysregulated cell-cell-interactions. These results demonstrate that inhibitors of DPP-4 have the potential to destabilize the retinal endothelial barrier in vitro, and could therefore provoke diabetic retinopathy in vivo., Die diabetische Retinopathie ist eine der f��hrenden Erblindungsursachen weltweit. Inhibitoren der Dipeptidylpeptidase-4 (DPP-4) wie Sitagliptin sind eine wichtige Wirkstoffgruppe bei der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2, die Datenlage hinsichtlich einer durch DPP-4-Therapie induzierten Barrierest��rung retinaler Endothelzellen in vivo und in vitro ist jedoch widerspr��chlich. Im Rahmen von Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurden kontinuierliche Zellindexmessungen an immortalisierten retinalen Endothelzellen vom Rind (iBREC) durchgef��hrt. Diese haben gezeigt, dass Sitagliptin (10-1000 nM) zu einem kontinuierlichen und signifikanten Abfall des Zellindex f��hrt. Darauf aufbauend wurden im Rahmen dieser Dissertation f��r eine intakte Endothelzellbarriere relevante Proteine n��her untersucht: Durch Western-Blot-Analysen konnte ein Anstieg des f��r Zell-Zell-Kontakte wichtigen ���tight-junction���-Proteins Claudin-1 beobachtet werden. Die Expression der an Zell-Matrix-Interaktionen beteiligten Adh��sionsproteine CD29 und CD9 fiel nach Inkubation mit dem DPP-4-Inhibitor Sitagliptin ab. Immunfluoreszenzf��rbungen zeigten au��erdem eine verminderte Expression von CD9 in der Plasmamembran. Der erniedrigte Zellindex von iBREC durch Sitagliptin beruht somit im Wesentlichen auf einer schlechteren Adh��sion der Zellen an der extrazellul��ren Matrix und weniger auf einem verst��rkten parazellul��ren Fluss aufgrund gesch��digter Zell-Zell-Kontakte. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass der DPP-4-Inhibitor Sitagliptin in vitro die retinale Endothelzellbarriere destabilisiert und somit in vivo die Entstehung einer diabetischen Retinopathie beg��nstigen k��nnte.

Diese Arbeit beschreibt die Identifikation und initiale Charakterisierung von bisher unbekannten alternativen Transkripten des Tetraspanins CD9, das als Adaptorprotein in der Zellmembran an der Regulation fundamentaler Prozesse wie Zellproliferation, -migration und -adhäsion beteiligt ist und auch den Phänotyp maligner Zellen verschiedener Art wesentlich mitbestimmt. Obwohl keine Spleißvarianten des sehr gut untersuchten CD9 beschrieben worden waren, gab es einige Hinweise auf eine Heterogentität des Proteins, die Ausgangspunkt der Untersuchungen waren. Erste Arbeiten an malignen neuralen Rattenzelllinien, die CD9-Immunreaktivität nicht mit allen anti-CD9-Antikörpern zeigten, führten zur Identifizierung zweier CD9-Transkripte (rCD9 mRNA-B und -C), die anstelle der bekannten mRNA (rCD9 mRNA-A) transkribiert werden. Beide Transkripte enthalten im Vergleich zur rCD9 mRNA-A ein alternatives Exon 1, aber nur die Variante rCD9-C besitzt durch die alternative Sequenz ein potentielles Translationinitiationscodon, dessen Funktionalität durch Expression eines Fusionsproteins mit verstärkt grün fluoreszierendem Protein (EGFP) am C-terminalen Ende experimentell bestätigt werden konnte. Als weiterer Hinweis auf eine mögliche physiologische Bedeutung der translatierbaren Variante rCD9-C kann der Nachweis ihrer Expression in verschiedenen normalen Rattenorganen gewertet werden. Modellrechnungen ergaben, dass diese Variante neben den für Tetraspanine typischen vier Membrandomänen vermutlich eine weitere enthält, wodurch sich eine besondere Struktur mit einem in den extrazellulären Raum ragenden N-Terminus ergibt. Um auch von menschlichen Zellen exprimierte alternative CD9-Transkripte zu identifizieren, erfolgte eine systematische Suche in Sequenzdatenbanken nach auffälligen „Expressed Sequence Tags“ (EST)-Sequenzen. Ausgehend von neun Kandidatensequenzen konnte schließlich die Existenz von vier alternativen CD9-Transkripten (huCD9-2, huCD9-PT-2, huCD9 4b-1 und huCD-7b/7c) bestätigt werden. Diese enthalten ein durchgehendes Leseraster, das nach Translation zu einem funktionellen Protein führen könnte. Berechnungen zur Membrantopologie der Varianten ergaben, dass die alternative CD9 Variante-2 tetraspanintypisch vier, die anderen CD9-Spleißvarianten nur zwei (huCD9-7b/7c), drei (huCD9-4b-1) oder fünf (huCD9-PT-2) Transmembrandomänen (TM) besitzen sollten. Besonderheit der in allen untersuchten Geweben vorkommenden Variante 2 ist eine durch das alternative Exon 3.5 verlängerte intrazelluläre Schleife zwischen TM2 und TM3. Mit fünf Transmembrandomänen ähnelt die Variante PT-2 der Rattenvariante rCD9-C. Das alternative Exon 1.5 führt bei dieser Variante zu einer zusätzlichen intrazellulären Schleife und einer Verlagerung des N-Terminus in den extrazellulären Raum. Interessant ist die ausgeprägte gewebespezifische Expression dieser Variante in adultem Gehirn, Hinterstrangganglien und Ovar, was spezielle Funktionen vermuten lässt. Bei den Varianten huCD9-4b-1 und huCD9-7b/7c kommt es durch ein verlängertes Exon 6 bzw. Exon 3 mit frühem Stopp-Codon nicht zur Ausbildung der zweiten extrazellulären Schleife. Ihre auffälligsten strukturellen Besonderheiten sind die langen C-terminalen Enden. Während der C-Terminus des huCD9-7b/7c tetraspanintypisch in den intrazellulären Raum ragt, müsste er bei huCD9-4b-1 nach den Modellrechnungen extrazellulär lokalisiert sein. Diese beiden Varianten kommen in den meisten der untersuchten menschlichen Geweben und Mammakarzinom-abgeleiteten Zelllinien vor, nicht aber in Plazenta- und gesundem Brustgewebe. Angesichts der grundsätzlichen strukturellen Unterschiede der neu identifizierten CD9-Varianten ist davon auszugehen, dass Proteine dieser Art sich von der bisher bekannten CD9-Form hinsichtlich der Assoziation mit Partnermolekülen sowie der Beeinflussung intrazellulärer Signalwege wesentlich unterscheiden. Obwohl ein experimenteller Nachweis noch aussteht, erscheint plausibel, dass die durch CD9 wesentlich mitbestimmte veränderte Adhäsion und Migration maligner Zellen auch in unterschiedlichen Anteilen der verschiedenen Varianten zum Ausdruck kommt. Es ist zu erwarten, dass die weitere Charakterisierung der neu identifizierten CD9-Transkripte zu einer differenzierteren und möglicherweise erweiterten Sicht der durch CD9 mitregulierten fundamentalen physiologischen Prozesse und ihrer Fehlsteuerung bei malignen und anderen wichtigen Erkrankungen führt.

Glioblastome sind die häufigsten malignen Hirntumoren bei Erwachsenen. Sie zeichnen sich durch starke Migration, Proliferation und Angiogenese aus. In dieser Arbeit wurden Proteine charakterisiert die mittels eines Drosophila melanogaster Glioblastom-Modells identifiziert wurden und vermutlich eine Rolle bei der platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) vermittelten Migration spielen. Sowohl LOX, LOXL1 und LOXL4 als auch CD9 waren in Glioblastomen und humanen Glioblastomzelllinien hochreguliert. Durch Knock-down von LOXL4 bzw. die Inhibition der LOX-Proteine konnte eine Reduktion der Migration in vitro und in vivo erreicht werden. Ein Knock-down von CD9 führte in U343 MG Zellen zu einer Reduktion der Migration und zur Aufhebung der migrationsfördernden Wirkung von PDGF-BB. Mittels PLA konnten Hinweise auf eine potentielle Interaktion von CD9 mit PDGFR gefunden werden. Im Falle beider Proteine weisen die Ergebnisse auf einen Zusammenhang mit der PDGFR-vermittelten Migration hin.