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Eine wichtige Struktur f��r die Entwicklung neuronaler Netzwerke ist der axonale Wachstumskegel. Er folgt speziellen Wachstumsfaktoren, um seine Zielregion zu erreichen. Einer der Wachstumsfaktoren ist der vascukar endothelial growth factor (VEGF). Die Studie sollte untersuchen, ob VEGF eine Wirkung auf die Proteine Cofilin und Arp-2/3 im Wachstumskegel hat. Wachstumskegel wurden mit VEGF stimuliert und es wurden verschiedene immunhistochemische sowie morphometrische Untersuchungen unter verschiedenen Bedingungen durchgef��hrt. Durch gezielte Stimulation und Inhibition wurden neue Erkenntnisse ��ber die Signalkaskaden im axonalen Wachskegel nach VEGF-Stimulation gewonnen. Es konnte gezeigt werden, dass VEGF die Verteilung von Cofilin beeinflusst und die Regulierung abh��ngig von LIMK erfolgt. Wachstumskegel mit konstitutiv inaktivem Cofilin zeigten kein Wachstum. Weiterhin wurde gezeigt, dass der Arp2/3-Komplex durch VEGF beeinflusst wird und dabei von N-WASP abh��ngig ist.

Das invasive Potential maligner Gliome beeinflusst maßgeblich die schlechte Prognose dieser Tumorentität. Migration und Invasion von Tumorzellen werden entscheidend durch die Cofilin-vermittelte Umstrukturierung des Aktin-Zytoskeletts geprägt, die durch die Aktivität antagonistischer Cofilin-Kinasen und -Phosphatasen reguliert wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte ein progressiver Expressionsverlust der Cofilin-Phosphatase Chronophin mit ansteigendem Malignitätsgrad astrozytärer Gliome aufgezeigt werden, der mit einer Zunahme der Phosphorylierung von Cofilin einhergeht. In den entsprechenden Gewebeproben gelang gleichzeitig der Nachweis einer gesteigerten Expression der Cofilin-Kinase LIMK-2. Genetische und epigenetische Analysen des Chronophin-Locus konnten eine Hypermethylierung im Bereich der Promotorregion der Phosphatase identifizieren, die möglicherweise dem Verlust von Chronophin in Glioblastom-Gewebeproben zugrunde liegt. In Glioblastom-Zelllinien, die unterschiedliche Expressionsmuster von Chronophin aufwiesen, konnten hingegen keine molekularen Alterationen festgestellt werden. Untersuchungen des Einflusses von ROCK- und LIMK-Inhibitoren auf Glioblastomzellen konnten ausgeprägte Veränderungen der Zellmorphologie dokumentieren, wobei erstmals die Induktion eines stellate cell-Phänotyps unter Einfluss des LIMK-Inhibitors BMS-5 beschrieben wird. Während ROCK- und LIMK-Inhibitoren keinen Einfluss auf die 2D-Motilität der Tumorzellen hatten, wiesen die Glioblastomzellen in Abhängigkeit ihrer basalen Cofilin-Aktivität eine verstärkte bzw. verminderte 3D-Invasivität auf. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstreichen die Bedeutung des Cofilin-Signalweges für die Migration und Invasion von Gliomzellen, zeigen neue Angriffspunkte in der Therapie maligner Gliome auf und warnen zugleich vor einem unkritischen Einsatz neuer Wirkstoffe., The invasive potential of malignant gliomas is the main reason for the dismal prognosis of this tumor entity. Migration and invasion of tumor cells is crucially determined by the cofilin dependent reorganization of the actin cytoskeleton regulated by the activity of antagonistic cofilin kinases and phosphatases. This study revealed a progressive loss of expression of the cofilin phosphatase chronophin with increasing malignancy grade of astrocytic glioma, accompanied by an increase of cofilin phosphorylation. Moreover, the analyzed glioma specimens were characterized by a simultaneous increase of expression of the cofilin kinase LIMK-2. Integrated genetic and epigenetic analysis of the chronophin locus identified an aberrant promoter methylation as a possible mechanism leading to chronophin down-regulation in glioblastoma tissue samples. In contrast, molecular alterations of the chronophin locus were undetectable in glioblastoma cell lines characterized by different chronophin expression levels. Analysis of glioblastoma cells demonstrated striking effects of ROCK and LIMK inhibitors on cell morphology, providing first evidence of the induction of a stellate cell-phenotype by the LIMK inhibitor BMS-5. While ROCK and LIMK inhibitors had no detectable effect on the 2D motility of the tumor cells, the inhibitors increased or decreased the 3D-invasiveness of the glioma cells depending on their basal cofilin activity. The findings of this study stress the importance of the cofilin signaling pathway as a key regulator of glioma migration and invasion, indicate novel targets for glioma therapy, but also warn against a noncritical use of new drugs.

Das Cyclase-assoziierte-Protein (CAP) und seine Homologen sind G-Actin-sequestrierende Proteine. Die strukturelle Charakterisierung des D. discoideum CAP-Proteins erfolgte im Rahmen dieser Arbeit mittels magnetischer Kernresonanzspektroskopie. Dabei lag der Schwerpunkt in der Bestimmung der dreidimensionalen Struktur der stabilen N-terminalen Teildomäne des CAP-Proteins mit Hilfe von Distanzgeometrie- und molekulardynamischen Algorithmen. Die ermittelte Struktur stellt ein Bündel von sechs alpha-Helices dar, die antiparallel zueinander gerichtet sind. Dies dient als erste Annährung zur Aufklärung der strukturellen Bindungseigenschaften zwischen dem CAP-Protein und die Adenylyl-Cyclase. Des Weiteren wurde das D. discoideum Actin-bindende Protein 1 (DAip1) auch hier untersucht. Das DAip1 gehört zur Familie der „WD-repeat-Proteine“. Es ist ein F-Actin-bindendes Protein, das gemeinsam mit Cofilin den Turnover von Actin reguliert. Das DAip1 wurde in den Zellen von D. discoideum überexprimiert und aus dem Zell-Lysat gereinigt, so dass das reine Protein für die Kristallzüchtung erhältlich war. Die Erzeugung von DAip1-Einkristallen liefert den Ausgangspunkt zur Charakterisierung von DAip1 mittels Röntgenstrukturanalyse. Damit ergibt sich die Möglichkeit strukturelle Informationen sowohl über die Bindungsaffinität zu Cofilin als auch über die Interaktionen mit Actin zu gewinnen. The Dictyostelium discoideum cyclase associated protein (CAP) and its homologues of the higher and lower eukaryotic organisms are G-actin sequestering proteins. Our structural characterization of D. discoideum CAP was carried out using NMR spectroscopical methods, with the final aim to determine the three-dimensional structure of the amino-terminal core domain of CAP. The CAP-N structure consists of a bundle of six anti-parallels alpha-helices. A model of the full length of CAP was also proposed as a first approach to describe the binding properties between CAP and adenylyl cyclase. A second actin binding protein studied here was the D. discoideum actin binding protein 1 (DAip1), which belongs to the family of the „WD-repeat proteins“. It is an F-actin binding protein that interacts with cofilin in the cell cortex and regulates the actin turnover. DAip1 has been overexpressed in the cells of D. discoideum and was purified using ion exchange chromatography methods. An analytical gel filtration was used to obtain pure DAip1 samples that could be used for crystallization. The crystallization of DAip1 is the starting point of characterization of DAip1 using the X-ray crystallography method and should provide structural information about the binding activity of DAip1 to cofilin and actin.