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Background Enhancers are non-coding DNA sequences, which when they are bound by specific proteins increase the level of gene transcription. Enhancers activate unique gene expression patterns within cells of different types or under different conditions. Enhancers are key contributors to gene regulation, and causative variants that affect quantitative traits in humans and mice have been located in enhancer regions. However, in the bovine genome, enhancers as well as other regulatory elements are not yet well defined. In this paper, we sought to improve the annotation of bovine enhancer regions by using publicly available mammalian enhancer information. To test if the identified putative bovine enhancer regions are enriched with functional variants that affect milk production traits, we performed genome-wide association studies using imputed whole-genome sequence data followed by meta-analysis and enrichment analysis. Results We produced a library of candidate bovine enhancer regions by using publicly available bovine ChIP-Seq enhancer data in combination with enhancer data that were identified based on sequence homology with human and mouse enhancer databases. We found that imputed whole-genome sequence variants associated with milk production traits in 16,581 dairy cattle were enriched with enhancer regions that were marked by bovine-liver H3K4me3 and H3K27ac histone modifications from both permutation tests and gene set enrichment analysis. Enhancer regions that were identified based on sequence homology with human and mouse enhancer regions were not as strongly enriched with trait-associated sequence variants as the bovine ChIP-Seq candidate enhancer regions. The bovine ChIP-Seq enriched enhancer regions were located near genes and quantitative trait loci that are associated with pregnancy, growth, disease resistance, meat quality and quantity, and milk quality and quantity traits in dairy and beef cattle. Conclusions Our results suggest that sequence variants within enhancer regions that are located in bovine non-coding genomic regions contribute to the variation in complex traits. The level of enrichment was higher in bovine-specific enhancer regions that were identified by detecting histone modifications H3K4me3 and H3K27ac in bovine liver tissues than in enhancer regions identified by sequence homology with human and mouse data. These results highlight the need to use bovine-specific experimental data for the identification of enhancer regions. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:10.1186/s12711-017-0331-4) contains supplementary material, which is available to authorized users.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas zählt zu den aggressivsten soliden Tumoren und ist durch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Standardchemotherapeutika sowie eine infauste Prognose gekennzeichnet. Detaillierte Untersuchungen der zugrunde lie-genden Mechanismen beschreiben eine zentrale Rolle inflammatorischer Signalwege in der Karzinogenese und Progression des Pankreaskarzinoms. In Vorarbeiten konnte un-sere Arbeitsgruppe den inflammatorischen Transkriptionsfaktor NFATc1 als wichtiges Onkogen in der Entzündungs-assoziierten Pankreaskarzinogenese identifizieren. Mole-kulare Analysen in diversen in vitro und in vivo Modellen des Pankreaskarzinoms erga-ben darüber hinaus, dass NFATc1 in einem hohen Prozentsatz humaner Pankreaskar-zinome überexprimiert wird und funktionell mit dem inflammatorischen Transkriptions-faktor STAT3 interagiert, um onkogene Gensignaturen während der Progression des Pankreaskarzinoms zu kontrollieren. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der NFATc1:STAT3-abhängigen Genregu-lation genauer zu untersuchen und die Komplexbildung beider Partner an der DNA zu charakterisieren. Weiterhin sollte die biologische Relevanz eines konditionalen STAT3-Verlusts im Kontext einer pankreasspezifischen KRASG12D- sowie NFATc1-Aktivierung in einem transgenen Mausmodell in vivo analysiert werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen Daten zeigen, dass die NFATc1-ab-hängige transkriptionelle Regulation onkogener Gensignaturen die Bindung des Tran-skriptionsfaktors an Enhancerregionen ausgewählter Zielgene voraussetzt. Im Gegen-satz dazu identifizierten ChIP-Analysen das NFATc1-Partnerprotein STAT3 an den je-weiligen Promotoren NFATc1-kontrollierter Zielgene. Darüber hinaus werden sowohl die NFATc1-Bindung an dessen Zielgenen sowie deren transkriptionelle Aktivierung durch NFATc1 maßgeblich von der Aktivität des IL-6-STAT3-Signalwegs determiniert. Diese Ergebnisse suggerieren eine Enhancer-Promotor-Loop-Formation als Mechanismus der Transkriptionskontrolle onkogener Signaturen durch NFATc1:STAT3 Komplexe. Um die biologische Relevanz dieser Interaktion in vivo zu untersuchen, wurde ein trans-genes Mausmodell generiert, das zusätzlich zu den konstitutiven Aktivierungen von KRASG12D und NFATc1 einen Verlust der STAT3-Expression im Pankreas aufweist. Diese Mäuse zeigten entgegen der Erwartungen eine beschleunigte Pankreaskarzinom-progression und eine deutlich verringerte mittlere Überlebenszeit von nur 60 Tagen gegenüber ihren Wurfgeschwistern ohne pankreasspezifischen STAT3-Verlust. Morpholo-gisch waren die Pankreaskarzinome STAT3-defizienter Mäuse durch eine ausgeprägte Zunahme des stromalen Tumoranteils gekennzeichnet. Diese Arbeit unterstreicht die onkogenen Funktionen von NFATc1 in der Karzinogenese und Progression des Pankreaskarzinoms und identifiziert die Komplexbildung mit STAT3 als zentralen transkriptionellen Mechanismus für die Kontrolle onkogener Gensignaturen im inflammations-assoziierten Pankreaskarzinom. Trotz der Charakterisierung von NFATc1 als vielversprechende Zielstruktur in der Behandlung des Pankreaskarzinoms existieren bis dato keine therapeutischen Strategien, die eine spezifische pharmakologi-sche Inhibition von NFATc1 in der Tumorzelle ermöglichen. Vor dem Hintergrund erfolgsversprechender Daten einer aktuellen klinischen Studie zur Inhibition des Jak/STAT3-Signalwegs in der Therapie des Pankreaskarzinoms und der hier beschriebenen zentralen Funktion von STAT3 in der NFATc1-abhängigen Tran-skriptionskontrolle erscheint die pharmakologische Inhibition des NFATc1-Partnerpro-teins STAT3 ein vielversprechender indirekter therapeutischer Ansatz für die Blockade der NFATc1-vermittelten Tumorprogression zu sein. Die beschleunigte Tumorprogres-sion im STAT3-defizienten in vivo Modell auf der Basis einer konstitutiven NFATc1-Akti-vierung hingegen deutet darauf hin, dass eine Inhibition des Jak/STAT3-Signalwegs v.a. in NFATc1-negativen Pankreaskarzinomen wirksam sein könnte und unterstreicht somit die Notwendigkeit der molekularen Stratifizierung für die Therapie dieser heterogenen Tumorerkrankung.

The ductal adenocarcinoma of the pancreas is one of the most aggressive solid tumors and known for both its resistance against common chemotherapeutics and its poor prog-nosis. Detailed analysis of the mechanism that leads to the development of pancreatic cancer have underlined the significance of inflammatory pathways in development and progression of this malignancy. Existing data published by our group has identified NFATc1 as an important player in the inflammation-driven carcinogenesis of the pan-creas. Furthermore, molecular analyses of both in vivo and in vitro models have shown that NFATc1 is expressed in the majority of human pancreatic adenocarcinomas and interacts with the inflammatory transcription factor STAT3. Together, they control the expression of oncogenes during the progression of pancreatic cancer. As a consequence, the aims of this thesis were not only to examine the detailed mech-anisms of NFATc1:STAT3 dependent gene regulation, but also to scrutinize the biologi-cal relevance of this oncogenic complex in a transgenic mouse model with a conditional loss of STAT3 in the context of KRASG12D and NFATc1 activation in the pancreas. The data published in this thesis show that the NFATc1 dependent transcriptional regu-lation of oncogenic signatures is the consequence of an enhancer augmented binging of NFATc1. In contrast to that, ChIP-analysis identified that the NFATc1 binding partner STAT3 preferably binds to promoter regions of NFATc1 controlled target genes. Further-more, both the NFATc1 binding to the target genes and their transcriptional activation are strongly regulated by the Interleukin-6-STAT3-pathway. These results propose en-hancer-promotor-loop-formation as a likely mechanism of NFATc1:STAT3 dependent transcriptional control of oncogene expression in pancreatic cancer. To underline the biological significance of these findings in vivo, we created a transgenic mouse model with constitutive activations of KRAS and NFATc1 and a loss of pancreatic STAT3 expression. Surprisingly, these mice showed a more rapid pancreatic cancer pro-gression and a median survival time of only 60 days compared to their littermates without a pancreatic loss of STAT3. Morphologically, the tumors of the STAT3 depriviant mice where hallmarked with a sig-nificant increase in the proportion of tumor stroma. The results presented here underline the oncogenic function of NFATc1 in pancreatic cancer development and progression and identified complex formation with STAT3 as a central transcriptional mechanism in the control of oncogenic gene signatures in inflam-mation-induced pancreatic cancer. Despite of the identification of NFATc1 as a promising target in pancreatic cancer therapy, therapeutic strategies to pharmacologically in-hibit NFATc1 activity in pancreatic cancer cells are missing. In the context of promising clinical trials dealing with the inhibition of the JAK/STAT3 pathway in the therapy of pan-creatic cancer and the herein described central role of STAT3 in NFATc1 dependent transcription, the pharmacological inhibition of the NFATc1 binding partner STAT3 seems to be a promising indirect therapeutic target to block NFATc1 mediated pancreatic cancer progression. Contrarily, the accelerated tumor progression in the STAT3-deficient mouse model in the setting of a constitutive NFATc1 activation suggests that the inhibi-tion of the JAK/STAT3 pathway is only efficient in NFATc1-negative pancreatic cancers. These finding underline the necessity of a molecular therapeutic stratification of pancre-atic cancer patients., Das duktale Adenokarzinom des Pankreas zählt zu den aggressivsten soliden Tumoren und ist durch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Standardchemotherapeutika sowie eine infauste Prognose gekennzeichnet. Detaillierte Untersuchungen der zugrunde lie-genden Mechanismen beschreiben eine zentrale Rolle inflammatorischer Signalwege in der Karzinogenese und Progression des Pankreaskarzinoms. In Vorarbeiten konnte un-sere Arbeitsgruppe den inflammatorischen Transkriptionsfaktor NFATc1 als wichtiges Onkogen in der Entzündungs-assoziierten Pankreaskarzinogenese identifizieren. Mole-kulare Analysen in diversen in vitro und in vivo Modellen des Pankreaskarzinoms erga-ben darüber hinaus, dass NFATc1 in einem hohen Prozentsatz humaner Pankreaskar-zinome überexprimiert wird und funktionell mit dem inflammatorischen Transkriptions-faktor STAT3 interagiert, um onkogene Gensignaturen während der Progression des Pankreaskarzinoms zu kontrollieren. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der NFATc1:STAT3-abhängigen Genregu-lation genauer zu untersuchen und die Komplexbildung beider Partner an der DNA zu charakterisieren. Weiterhin sollte die biologische Relevanz eines konditionalen STAT3-Verlusts im Kontext einer pankreasspezifischen KRASG12D- sowie NFATc1-Aktivierung in einem transgenen Mausmodell in vivo analysiert werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit gewonnen Daten zeigen, dass die NFATc1-ab-hängige transkriptionelle Regulation onkogener Gensignaturen die Bindung des Tran-skriptionsfaktors an Enhancerregionen ausgewählter Zielgene voraussetzt. Im Gegen-satz dazu identifizierten ChIP-Analysen das NFATc1-Partnerprotein STAT3 an den je-weiligen Promotoren NFATc1-kontrollierter Zielgene. Darüber hinaus werden sowohl die NFATc1-Bindung an dessen Zielgenen sowie deren transkriptionelle Aktivierung durch NFATc1 maßgeblich von der Aktivität des IL-6-STAT3-Signalwegs determiniert. Diese Ergebnisse suggerieren eine Enhancer-Promotor-Loop-Formation als Mechanismus der Transkriptionskontrolle onkogener Signaturen durch NFATc1:STAT3 Komplexe. Um die biologische Relevanz dieser Interaktion in vivo zu untersuchen, wurde ein trans-genes Mausmodell generiert, das zusätzlich zu den konstitutiven Aktivierungen von KRASG12D und NFATc1 einen Verlust der STAT3-Expression im Pankreas aufweist. Diese Mäuse zeigten entgegen der Erwartungen eine beschleunigte Pankreaskarzinom-progression und eine deutlich verringerte mittlere Überlebenszeit von nur 60 Tagen gegenüber ihren Wurfgeschwistern ohne pankreasspezifischen STAT3-Verlust. Morpholo-gisch waren die Pankreaskarzinome STAT3-defizienter Mäuse durch eine ausgeprägte Zunahme des stromalen Tumoranteils gekennzeichnet. Diese Arbeit unterstreicht die onkogenen Funktionen von NFATc1 in der Karzinogenese und Progression des Pankreaskarzinoms und identifiziert die Komplexbildung mit STAT3 als zentralen transkriptionellen Mechanismus für die Kontrolle onkogener Gensignaturen im inflammations-assoziierten Pankreaskarzinom. Trotz der Charakterisierung von NFATc1 als vielversprechende Zielstruktur in der Behandlung des Pankreaskarzinoms existieren bis dato keine therapeutischen Strategien, die eine spezifische pharmakologi-sche Inhibition von NFATc1 in der Tumorzelle ermöglichen. Vor dem Hintergrund erfolgsversprechender Daten einer aktuellen klinischen Studie zur Inhibition des Jak/STAT3-Signalwegs in der Therapie des Pankreaskarzinoms und der hier beschriebenen zentralen Funktion von STAT3 in der NFATc1-abhängigen Tran-skriptionskontrolle erscheint die pharmakologische Inhibition des NFATc1-Partnerpro-teins STAT3 ein vielversprechender indirekter therapeutischer Ansatz für die Blockade der NFATc1-vermittelten Tumorprogression zu sein. Die beschleunigte Tumorprogres-sion im STAT3-defizienten in vivo Modell auf der Basis einer konstitutiven NFATc1-Akti-vierung hingegen deutet darauf hin, dass eine Inhibition des Jak/STAT3-Signalwegs v.a. in NFATc1-negativen Pankreaskarzinomen wirksam sein könnte und unterstreicht somit die Notwendigkeit der molekularen Stratifizierung für die Therapie dieser heterogenen Tumorerkrankung.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden experimentell spleißregulatorische Motive in der Nähe einer 5′-Spleißstelle in drei verschiedenen Zellkulturmodellen quantitativ evaluiert und entsprechend ihres Einflusses auf die Spleißaktivität klassifiziert. Insgesamt konnten 1812 Enhancer- und 2803 Silencer-Sequenzen am Beispiel des humanen β-Globingens (HBB) identifiziert werden. In the present work splicing regulatory motifs near the 5′ splice site were quantitatively evaluated and classified according to their impact on splicing activation in three different cell culture models. Altogether 1812 enhancer sequences and 2803 silencer sequences were identified using the example of the human β-globin gene (HBB).

Der Transkriptionsfaktor Sox10 spielt während der Embryogenese zu verschiedenen Zeitpunkten und in unterschiedlichsten Geweben eine entscheidende Rolle. In den letzten Jahren wurden Regulation und Position dieses bedeutenden Transkriptionsfaktors im genregulatorischen Netzwerk der Neuralleistenentwicklung genauer analysiert. Durch die hier vorliegenden Untersuchungen konnte nun gezeigt werden, dass die kontinuierliche Sox10-Expression in der Neuralleiste zum Teil über einen autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus sicher gestellt wird, an dem der 0,4 kb lange Sox10-Enhancer U3 maßgeblich beteiligt ist. Dabei bindet Sox10 drei von neun putativen Sox-Bindestellen innerhalb des U3-Enhancers als Monomer und nutzt zwei weitere benachbarte Sox-Bindestellen, um als Dimer an den U3-Enhancer zu binden. Anhand transgener Mäuse konnte der Beweis erbracht werden, dass die identifizierten Sox-Bindestellen innerhalb des U3-Enhancers eine essentielle Rolle für die Aufrechterhaltung der U3-Aktivität spielen. Dabei stellte sich heraus, dass eine der monomeren Bindungsstellen eine herausragende Rolle übernimmt. Um den U3-Enhancer zu aktivieren, wirkt Sox10 synergistisch mit den Neuralleisten-assoziierten Transkriptionsfaktoren Pax3, FoxD3 und AP2α sowie mit den in der Schwann-Zell-Entwicklung wichtigen Faktoren Krox20 und Sox2. Der Synergismus zwischen FoxD3 und Sox10 beruht auf einer Sox10-abhängigen Rekrutierung von FoxD3 an den U3-Enhancer. Die Transkriptionsfaktoren AP2α und Sox10 binden dagegen unabhängig voneinander an benachbarte Stellen im U3-Enhancer. Zusätzlich konnte sowohl für FoxD3 als auch für AP2α eine Protein-Protein Interaktion mit der Dimerisierungsdomäne und der angrenzenden DNA-bindenden Domäne des Sox10-Proteins nachgewiesen werden. Erstmals ließ sich eine Protein-Protein Wechselwirkung mit der K2-Domäne des Sox10-Proteins nachweisen. Dies betraf das AP2α-Protein. Im Rahmen dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Autoregulation und Synergismus zwei entscheidende Mechanismen für die Aufrechterhaltung der Sox10-Expression und die funktionelle Aktivität des Sox10-Proteins im genregulatorischen Netzwerk der Neuralleistenentwicklung sind. The transcription factor Sox10 plays a critical role during embryogenesis at different times and in different tissues. In recent years, regulation of this important transcription factor and its position in the gene regulatory network of neural crest development were analyzed in detail. In the present study continuous Sox10 expression in the neural crest was shown to be maintained, at least partly through an autoregulatory feedback mechanism, which involves the 0.4 kb long Sox10 enhancer U3. Sox10 binds three of nine putative Sox binding sites within the U3 enhancer as a monomer and uses two additional adjacent Sox-binding sites to bind as a dimer. Using transgenic mice evidence was obtained that the identified Sox-binding sites within the U3 enhancer play an essential role in maintaining U3 activity. One of the monomeric binding sites was found to play a particularly prominent role. Sox10 acts synergistically with the neural crest-associated transcription factors Pax3, FoxD3 and AP2α and with the Schwann celll factors Krox20 and Sox2 to activate the U3 enhancer. The synergism between FoxD3 and Sox10 is based on a Sox10-dependent recruitment of FoxD3 to the U3 enhancer. In contrast, transcription factors Sox10 and AP2α bind independently to adjacent sites within the U3 region. In addition, a physical interaction with the dimerization domain and the adjacent DNA-binding domain of the Sox10 protein could be detected for both FoxD3 and AP2α. For AP2α an additional interaction was detected with the K2 domain of the Sox10 protein. This is the first interaction known to be mediated by the K2 domain of Sox10. In summary, this study identified autoregulation and synergism as two important mechanisms for maintenance of expression and functional activity of the Sox10 protein within the gene regulatory network of neural crest development.

Hintergrund und Ziele: Die Sox-Proteine der Gruppe E sind an den verschiedensten Facetten der embryonalen Entwicklung neuraler Strukturen beteiligt. Vor allem Sox9 und Sox10 konnten in den letzten Jahren in ihrer Funktion und Expression diesbezüglich genauer charakterisiert werden. Im sich entwickelnden embryonalen ZNS und PNS der Maus wurden zudem in der unmittelbaren genomischen Region von Sox10 evolutionär konservierte Regionen (EKR) identifiziert, welche in der Lage sind, als Enhancer die qualitative und quantitative Sox10-Expression zu kontrollieren. Besondere Aufmerksamkeit in dieser Arbeit galt hierbei der EKR U2, welche als einzige Aktivität im ZNS, genauer gesagt in Oligodendrozytenvorläufern, zeigte. Methoden: Um die EKR U2 in einem in vivo Modell analysieren zu können, wurde zunächst die EKR U2 vor einem Hsp68 Minimalpromotor, zusammen mit einem lacZ Reportergen kloniert. Daraufhin folgte die Mikroinjektion in befruchtete murine Oozyten, aus welchen dann transgene Mäuse hervorgingen. Diese zeigten die Expression des lacZ Genprodukts, der ß-Galaktosidase, unter der Kontrolle der EKR U2. In Gewebeschnitten dieser Mäuse konnte, mit Hilfe des X-Gal Färbesystems und immunhistochemischen Untersuchungen das zeitliche und räumliche Aktivitätsmuster der EKR U2 genau charakterisiert werden. In Zellkulturexperimenten und Luziferase-Reportergen-Aktivitätstests wurde die Beeinflussung der Aktivität der EKR U2 durch verschiedene Transkriptionsfaktoren in vitro geprüft. An Sox9-defizienten Mäusen ließ sich in vivo die Beeinflussung der Aktivität der EKR U2 durch Sox9 bestimmen. Ergebnisse und Beobachtungen: Die Aktivität der EKR U2 beginnt im Rückenmark der Maus am Embryonaltag E12.5 in bereits spezifizierten Oligodendrozytenvorläufern. Nach der Geburt erlischt sie wieder, während die Sox10-Expression in ausgereiften Oligodendrozyten erhalten bleibt. U2 wird demzufolge in Oligodendrozytenvorläufern nach der Spezifizierung aktiv, wenn diese aus der pMN-Domäne in die Mantelzone migrieren und Sox9 und Sox10 beginnen, die Expression von PDGF-Ra zu regulieren. Die Aktivität endet mit der Ausdifferenzierung der Oligodendrozyten, also genau zu dem Zeitpunkt, wenn Sox10 seiner Funktion in der Aktivierung der Expression von Myelingenen gerecht wird. In Zellkulturexperimenten und Luziferase-Reportergen-Aktivitätstests ließ sich für zahlreiche in Oligodendrozytenvorläufern vorkommende Transkriptionsfaktoren (Olig1, Olig2, Sox9, Sox10, GTX) kein Einfluß auf die Aktivität der EKR U2 nachweisen. Auch scheint Sox9 nicht direkt die Sox10-Expression in vivo über die EKR U2 zu kontrollieren, wie im Sox9-Defizienz-Mausmodell nachgewiesen werden konnte. Somit sind die EKR U2 regulierenden Faktoren noch nicht identifiziert. Praktische Schlussfolgerungen: Es konnte gezeigt werden, dass die EKR U2 die Sox10-Expression in Oligodendrozytenvorläufern erklären kann, nicht aber für die Induktion von Sox10 im Rahmen der Spezifizierung oder für die kontinuierliche Expression in reifen Oligodendrozyten verantwortlich ist. Purpose: E-group Sox proteins play a crucial role in the embryonic development of neural structures. In this context, the expression and function of Sox9 and Sox10 have been characterized over the last few years. Furthermore, evolutionary conserved regions (ECRs) were identified in the immediate genomic environment of murine Sox10, which are able to control the qualitative and quantitative Sox10 expression as enhancers. The major focus of this thesis was on the ECR U2 because it is the only ECR that is active in oligodendrocyte precursors of the central nervous system (CNS). Methods: In order to analyse the ECR in an in vivo model, the ECR U2 was combined with an Hsp68 minimal promoter and a lacZ reporter gene in a transgenic construct. Transgenic mice were generated by microinjection of the construct in fertilized oocytes. These mice showed expression of the lacZ gene product, ß-galactosidase, under the control of the ECR U2. With X-Gal staining and immunhistochemical studies on tissue sections of these mice, I was able to characterize the temporal and spatial activity pattern of ECR U2. Cell culture experiments and luciferase assays were applied to analyse the influence of numerous transcription factors on the activity of ECR U2 in vitro. Additionally, Sox9 knockout mice were used to analyse the influence of Sox9 on the ECR U2 in vivo. Results: Activity of ECR U2 in the spinal cord begins on day 12.5 of mouse embryogenesis in already specified oligodendrocyte precursors. It gradually extinguishes again after birth, whereas Sox10 expression continues in mature oligodendrocytes. U2 thus starts to get active after the specification of oligodendrocyte precursors and during their migration from the pMN-domain to the white matter, exactly at the time when Sox9 and Sox10 regulate the expression of PDGF-Ra. The activity ends with the maturation of oligodendrocytes, precisely at the moment, when Sox10 starts to function as an activator of myelin gene expresssion. Cell culture experiments and luciferase assays, failed to detect an influence of numerous in oligodendrocyte precursors occuring transcription factors (Olig1, Olig2, Sox9, Sox10, GTX) on the activity of ECR U2. No evidence was obtained in Sox9 knockout mice, that Sox9 directly controls Sox10 expression in vivo via ECR U2. Factors that regulate the activity of U2 thus remain to be identified. Conclusion: I showed that the ECR U2 controls Sox10 expression in oligodendrocyte precursors, but is neither responsible for Sox10 induction during oligodendrocyte specification, nor for continued Sox10 expression in mature oligodendrocytes.

Sox8 wird während der Entwicklung in einer Vielzahl verschiedener Gewebe und im geringeren Umfang auch im Erwachsenenalter exprimiert. Die für diese Expression verantwortlichen regulatorischen Elemente waren bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnten potentielle Enhancer von Sox8 auf der Grundlage von Sequenzhomologien zwischen Säugern und Vögeln in einem 220 kb Intervall identifiziert werden. Drei von insgesamt sieben detektierten evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Sequenzen verursachten in transgenen Mäuseembryonen ein Sox8-spezifisches Expressionsmuster des LacZ-Reportergens und sind daher wahrscheinlich Enhancer von Sox8. Diese regulatorischen Elemente waren im Gesichtsmesenchym, dem ersten Schlundbogen, in Neuralleistenderivaten, sowie dem Nervensystem, dem Auge und den Extremitäten aktiv. Es gab allerdings auch Expressionsorte von Sox8, die durch die Aktivität der drei Enhancer nicht abgedeckt wurden. Daher ist davon auszugehen, dass noch zusätzliche Enhancer existieren, die entweder zwischen Säugern und Vögeln nicht konserviert sind oder die außerhalb der untersuchten 220 kb Region liegen. Die Promotorregion von Sox8 zeigte nur im zentralen Nervensystem eine schwache Expression des Reportergens. Die Sox8-Expression wird demnach hauptsächlich von Enhancern und nicht vom Promotor gesteuert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Gewichtsreduktion Sox8-defizienter Mäuse im Erwachsenenalter untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das Fettgewebe im Sox8-defizienten Tier mit dem Alter zunehmend degeneriert und dieser Verlust deutlich zum geringeren Gewicht der Tiere beiträgt. Systemische Ursachen wie Veränderungen des Hormonhaushalts, des Glukose- oder des Fettmetabolismus lieferten keine Erklärung für den beobachteten Phänotyp. Die Expression des Präadipozytenmarkers Pref-1 zeigte jedoch im adulten Fettgewebe eine deutliche Erhöhung. Ebenso war in vitro die adipogene Differenzierung von Sox8-defizienten Fibroblasten beeinträchtigt. Dies konnte durch die Wiedereinführung von Sox8 teilweise revertiert werden. In mesodermalen Vorläuferzellen und undifferenzierten Wildtyp-Fibroblasten war zudem eine starke Sox8-Expression nachweisbar, während in reifen Adipozyten nahezu kein Sox8 exprimiert wurde. Vermutlich besitzt Sox8 eine intrinsische Funktion in Vorläuferzellen, welche den Zellpool des Fettgewebes im Erwachsenenalter auffüllen. Eine Störung dieser Funktion könnte zu einer Degeneration des Fettgewebes in der Sox8-defizienten Maus führen. Damit konnten in der vorliegenden Arbeit wichtige Erkenntnisse bezüglich der Regulation der Sox8-Expression während der Embryonalentwicklung und hinsichtlich der Funktion von Sox8 in der Adipogenese im Erwachsenenalter gewonnen werden. The transcription factor Sox8 is broadly expressed in a majority of tissues during development and in a more restricted pattern during adulthood. Until now, regulatory sequences for Sox8 expression were unknown. In this study, sequence conservation between mammals and birds was used to identify potential regulatory sequences of Sox8 in a 220 kb genomic interval. Three of the seven detected evolutionary conserved sequences caused a lacZ reporter gene to be expressed in a Sox8-specific manner in transgenic mouse embryos and are therefore bona fide Sox8 enhancers. These regulatory elements showed activity in the facial mesenchyme, the first branchial arch, neural crest derivatives as well as the nervous system, the eye, and the limb. However, there were also Sox8 expressing sites that were not covered by the activity of the three enhancers. Therefore additional enhancers must exist that may either be not conserved between mammals and birds or located outside the 220 kb region analyzed in this study. The promoter region of Sox8 drove only weak expression of the lacZ reporter gene in the central nervous system. Thus the Sox8 expression pattern is mainly a consequence of enhancer activity and not of promoter activity. In the second part of the study, weight reduction of adult Sox8-deficient animals was analyzed. It was shown, that the adipose tissue of Sox8-deficient mice progressively degenerates with age. This loss significantly contributes to the reduced weight of these animals. Systemic causes like changes in hormone levels, glucose and fat metabolism did not explain the observed phenotype. However, the expression level of the preadipocyte marker Pref-1 was elevated in adult adipose tissue. Consistently the adipogenic differentiation of Sox8-deficient fibroblasts was impaired in cell culture. This defect could in part be rescued by reintroducing Sox8 into these cells. Furthermore strong Sox8 expression was detected in mesodermal precursors and undifferentiated wildtype fibroblasts, whereas Sox8 was hardly expressed in mature adipocytes. Therefore Sox8 might have an intrinsic function in precursors, which replenish the cell pool of adipose tissue in adulthood. Disturbance of this function might lead to the degeneration of adipose tissue in Sox8-deficient mice. This study has thus led to notable insights into the regulation of Sox8 expression during embryonic development and into the function of Sox8 in adipogenesis during adulthood.

In der vorliegenden Studie wurde die Aktivität von CYP3A4 bei 104 gesunden europäischen Probanden anhand des Abbaus von Alprazolam durch das Enzym vor und nach der Induktion durch Rifampicin gemessen. Anschließend wurden die Promoter- und Enhancerregion des Enzyms sequenziert und der Zusammenhang zwischen Polymorphismen in diesem Bereich und der basalen sowie induzierten Aktivität des Enzyms analysiert. In der Enhancerregion konnten keine Polymorphismen nachgewiesen werden. In der Promoterregion fanden wir die SNPs CYP3A4*1B und CYP3A4*1F. Weitere bekannte oder unbekannte Polymorphismen wurden nicht detektiert. Die Allelfrequenz von CYP3A4*1B betrug in unserem Probandenkollektiv 2,4%. Dieser Polymorphismus hatte weder auf die basale Aktivität noch auf die Aktivität nach Induktion einen Einfluss. CYP3A4*1F wurde mit einer Frequenz von 5,3% nachgewiesen. Auch hier wurde keine relevante Beeinflussung des Alprazolamabbaus beobachtet. Die durch diesen Polymorphismus entstandene CpG war sowohl in den Leukozytenproben aller Probanden als auch in sieben zusätzlich untersuchten Leberproben methyliert. Dieses Ergebnis stützt die These, dass die Promoter- und besonders die Enhancerregion von CYP3A4 aufgrund ihrer hohen Relevanz für die Funktion des Enzyms stark konserviert sind. Des Weiteren lässt sich feststellen, dass die Methylierung von CpGs offensichtlich ein verhältnismäßig unspezifischer Vorgang ist, da selbst neu auftretende potentielle Methylierungspositionen im Genom vollständig methyliert werden., In this study the activity of CYP3A4 was measured at 104 healthy european subjects by the degradation of alprazolam through the enzyme before and after induction ba rifampicin. Afterwards the promoter and enhancer region of the enzyme was sequenced and the correlation between the polymorphisms in this region and the basal and induced activity were analyzed. There were no polymorphisms found in the enhancer region. In the promoter region we found the SNPs CYP3A4*1B and CYP3A4*1F. Further known or unknown polymorphisms were not detected. The allel frequency of CYP3A4*1B was 2.4%. This polymorphism had no influence to the activity of the enzyme neither before nor after induction. CYP3A4*1F was measured with an allel frequency of 5.3%. It had as well no relevant influence on the degradation of alprazolam by the enzyme. CYP3A4*1F leads to a new CpG island. This was both in the leucocytes of the tested subjects and in seven additionally tested liver probes fully methylized. This result shows that the promoter and enhancer region of CYP3A4 has a high relevance for the function of this enzyme and therefore it is highly conserved through evolution. Furthermore this study shows that the methylation of CpGs is a quite unspecific process, because even new appearing potential methylation positions are fully methylized.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gene expression and replication are regulated by the promoter/enhancer located in the U3 region of the proviral 5′ long terminal repeat (LTR). The binding of cellular transcription factors to specific regulatory sites in the 5′ LTR is a key event in the replication cycle of HIV-1. Since transcriptional activity is regulated by the posttranslational modification of transcription factors with the monosaccharide O-linked N -acetyl- d -glucosamine ( O -GlcNAc), we evaluated whether increased O -GlcNAcylation affects HIV-1 transcription. In the present study we demonstrate that treatment of HIV-1-infected lymphocytes with the O -GlcNAcylation-enhancing agent glucosamine (GlcN) repressed viral transcription in a dose-dependent manner. Overexpression of O -GlcNAc transferase (OGT), the sole known enzyme catalyzing the addition of O -GlcNAc to proteins, specifically inhibited the activity of the HIV-1 LTR promoter in different T-cell lines and in primary CD4 + T lymphocytes. Inhibition of HIV-1 LTR activity in infected T cells was most efficient (>95%) when OGT was recombinantly overexpressed prior to infection. O -GlcNAcylation of the transcription factor Sp1 and the presence of Sp1-binding sites in the LTR were found to be crucial for this inhibitory effect. From this study, we conclude that O -GlcNAcylation of Sp1 inhibits the activity of the HIV-1 LTR promoter. Modulation of Sp1 O -GlcNAcylation may play a role in the regulation of HIV-1 latency and activation and links viral replication to the glucose metabolism of the host cell. Hence, the establishment of a metabolic treatment might supplement the repertoire of antiretroviral therapies against AIDS.

Die phänotypischen Unterschiede von Zellen und deren Antwort und Anpassung an Umwelteinflüsse wird unter anderem durch Regulation der Gentranskription gewährleistet. Der in Vertebraten ubiquitär exprimierte und hoch konservierte Transkriptionsfaktor CTCF ist auf vielfältige Weise in die Regulation der Expression genetischer Information involviert. Die Tatsache, dass CTCF in höheren Eukaryoten der einzig bekannte Faktor ist, der Enhancer-Blockade vermitteln kann, verdeutlicht seine große Bedeutung. Dabei werden Gene von unerwünschten Enhancer-Einflüssen abgeschirmt, die für die Regulation anderer Gene verantwortlich sind. CTCF-Bindestellen können sich in enger räumlicher Nachbarschaft zu Bindestellen für den Thyroidhormon-Rezeptor (TR), einem Mitglied der Familie der Kernhormonrezeptoren befinden. Für diese kombinierten Bindestellen wurde bereits gezeigt, dass Thyroidhormon (T3) die Enhancer-Blockade regulieren kann. Es stellt sich die Frage, durch welche Faktoren die hormonsensitive Enhancer-Blockade reguliert wird, und ob weitere benachbarte Bindestellen für CTCF und TR im Genom existieren. In der vorliegenden Arbeit konnte mit E6-AP ein zusätzlicher Cofaktor von CTCT und TR identifiziert werden. GST Pulldown-Experimente zeigen eine in vitro-Interaktion von E6-AP mit CTCF und in der Anwesenheit von Hormon mit TR. E6-AP übt zwei voneinander unabhängige Funktionen aus. Zum einen ist es ein Coaktivator für Kernhormonrezeptoren, zum anderen fungiert E6-AP als E3-Ubiquitin-Ligase. In Studien, bei denen E6-AP im Enhancer-Blockade-Assay überexprimiert wurde, zeigt sich ein geringer Einfluss auf die Enhancer-Blockade. Des Weiteren wurden 126 durch den TR regulierte Gene mittels in silico-Analysen auf kombinierte CTCF- und TR-Bindestellen untersucht. Dabei konnten 17 Gene identifiziert werden, die eine benachbarte Bindestelle von CTCF und TR haben. Die Durchführung von EMSA-Experimenten verifizierte bei 10 kombinierten Bindestellen eine in vitro-Interaktion mit der jeweiligen Sonde. Die neu identifizierten Elemente wurden in ein Vektorsystem integriert, welches es erlaubt, diese auf ihre Funktionalität hin in Bezug auf hormonsensitive Enhancer-Blockade zu untersuchen. Dabei zeigt das benachbarte Bindeelement des ERRα-Gens Enhancer-Blockade, die durch die Zugabe von T3 aufgehoben wird. Wie schon für die Bindestellen F1 und F2 aus dem Hühner-Lysozym-Silencer gezeigt wurde, ist auch bei der kombinierten Bindestelle des ERRα Gens die Vermittlung einer funktionellen Enhancer-Blockade in der Abwesenheit von Hormon unmittelbar von der Präsenz des TR abhängig

Die Transkriptionsfaktorfamilie der Sox-Proteine ist durch grundlegende Funktionen in der Entwicklung verschiedener Zelltypen, Gewebe und Organe gekennzeichnet. So ist der Transkriptionsfaktor Sox10 in der Neuralleiste und deren Derivaten sowie in Oligodendrozyten des zentralen Nervensystems exprimiert und ist in diesen Geweben entscheidend an Determinierungs- und Differenzierungsvorgängen beteiligt. Mutationen im Sox10-Gen verursachen schwere Neurocristopathien. Um zu verstehen, wie die Sox10-Genexpression während der Entwicklung reguliert wird, wurden im Rahmen dieser Arbeit evolutionär konservierte, nicht-kodierende Regionen im Sox10-Genlocus identifiziert. Insgesamt sieben Regionen wiesen eine Sequenzhomologie von mehr als 70% über mindestens 100 bp zwischen verschiedenen Säugergenomen und dem des Huhns auf. Keine dieser Regionen zeigte hingegen eine signifikante Sequenzkonservierung gegenüber Xenopus laevis, Danio rerio oder Fugu rubripes. Die genregulatorischen Aktivitäten der entsprechenden Sequenzen aus der Maus wurden anschließend in transgenen Mausmodellen analysiert. Fünf der sieben identifizierten Regionen führten zu einer Reportergenexpression in verschiedenen Sox10 exprimierenden Zelltypen und Geweben, wenn sie in einem Transgen einem Hsp68 Minimalpromotor und einem LacZ Reportergen vorgeschaltet sind. Sie vermitteln die Sox10 Genexpression im sich entwickelnden Innenohr, in Oligodendrozyten und in verschiedenen Neuralleistenderivaten, inklusive des peripheren Nervensystems und der chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks. Interessanterweise weisen die evolutionär konservierten, nicht-kodierenden Regionen zeitlich und räumlich überlappende Aktivitäten auf. Sie werden zudem in Gelretardierungsexperimenten von ähnlichen Kombinationen von Transkriptionsfaktoren gebunden. Untersuchungen an U1 als einem dieser Enhancer zeigten darüberhinaus, dass seine Aktivität in Sox10 defizienten Embryonen stark vermindert ist. Damit trägt Sox10 über einen positiven, autoregulatorischen Rückkopplungsmechanismus zum Erhalt der eigenen Genexpression bei. Die Identifikation von Sox Bindestellen in diesem Enhancer und deren Mutationsanalysen deuten darauf hin, dass dieser Einfluss von Sox10 direkt ist. Die Summe aller nachgewiesenen Enhanceraktivitäten ist ausreichend, um die essentiellen Merkmale der Sox10 Expression während der frühen Embryogenese quantitativ und qualitativ wiederzugeben. The Sox family of transcriptional regulators is characterised by essential functions in the development of several cell types, tissues and organs. Sox10 is expressed in the neural crest, its derivatives, as well as in oligodendrocytes of the central nervous system. It plays an important role in these tissues during determination and differentiation processes. Sox10 mutations are associated with severe neurocristopathies. In order to understand how Sox10 expression is regulated during development evolutionary conserved non-coding sequences were identified in the Sox10 genomic region. Seven regions exhibited a greater than 70% sequence identity over at least 100 bp between mammalian genomes and the chicken genome. In contrast none of these regions exhibited a significant degree of conservation in Xenopus laevis, Danio rerio or Fugu rubripes. Each of these regions was then studied for its gene regulatory activities in transgenic mouse models. By linking the corresponding mouse sequences to a lacZ marker gene under the control of a hsp68 minimal promoter, five of seven regulatory regions were found to direct marker gene expression to Sox10 expressing cell types and tissues. These enhancers mediate Sox10 expression in the developing inner ear, in oligodendrocytes, and in several neural crest derivatives including the peripheral nervous system and chromaffine cells of the adrenal gland. Interestingly, they exhibit overlapping spatiotemporal activities and share binding sites in gelshift experiments for similar combinations of transcription factors. Additional analyses on U1 as one of these enhancers showed that its regulatory activity in Sox10 deficient embryos is strongly reduced. Therefore Sox10 seems to play a role in maintaing its own expression by a positive autoregulatory feedback mechanism. The identification of Sox binding sites in U1 and mutation analyses argue that the effect of Sox10 on U1 activity is direct. The combined enhancer activities are sufficient to explain the essential characteristics of Sox10 expression in early development both quantitatively and qualitatively.

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Fragestellung Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis, Das Ziel der hier vorliegenden Versuchsreihe war es, in Form einer kontrollierten, randomisierten Studie den Einfluss wassergefilterter Infrarot-A-Strahlung auf das Penetrationsverhalten topisch applizierter Substanzen innerhalb des Stratum corneum beurteilen zu können. Hierzu wurde die Verteilung von Fluoreszenzfarbstoffen innerhalb des Stratum corneum, mit oder ohne Einwirkung von wIRA, mittels zweier nicht-invasiver optischer Methoden aufgezeigt. Die Hautpenetrationsstudie wurde an 12 hautgesunden männlichen Probanden im Alter zwischen 19 und 30 durchgeführt. 3 Untersuchungstermine (Modus A, B und C für jeden Probanden) im Abstand von je einer Woche wurden festgelegt. In allen 3 Modi fand die Applikation der Fluoreszenzfarbstoffe, hydrophiles Natriumfluoreszein und lipophiles Curcumin, statt: In Modus A erfolgte die Substanzpenetration ohne jegliche wIRA- Bestrahlung, in Modus B wurde die Haut vor dem Auftragen der jeweiligen Substanz für 30 Minuten mit wIRA bestrahlt, in Modus C wurde die Applikationsfläche erst nach dem Auftragen und somit zeitgleich zum Penetrationsprozess für 30 Minuten mit wIRA bestrahlt. Nach der Penetrationszeit von jeweils 30 Minuten wurden die Hautareale mittels Laser- Scan-Mikroskopie untersucht und die oberflächlichen Hornhautschichten mittels Abrissmethode abgetragen. UV/VIS-spektroskopische Messungen ermöglichten es, die mit Hilfe der Abrissmethode entnommenen Hautschichten auf die Menge an Hornhautzellen und Testsubstanz hin zu untersuchen. Diese Kombination von Abrissmethode und UV/VIS-spektroskopischer Messung erlaubte sowohl eine exakte Lokalisation als auch eine exakte Quantifizierung der topisch applizierten Testsubstanzen innerhalb des Stratum corneum. Die so gewonnen Daten wurden verwendet, um Penetrationsprofile zu erstellen. Zusätzlich zu den UV/VIS- spektroskopischen Messungen ermöglichten die Untersuchungen mittels eines Laser-Scan-Mikroskops, den Penetrationsprozess zu visualisieren und so die Verteilung der applizierten Fluoreszenzfarbstoffe innerhalb der oberen Hornhautschichten in vivo zu beurteilen. Neben diesen zwei optischen Messungen wurden Veränderungen der Hautphysiologie, hervorgerufen durch die Bestrahlung mit wassergefilterter Infrarot-A-Strahlung, aufgezeichnet. Hierzu wurden in den Modi B und C der transepidermale Wasserverlust, die Hautfeuchte sowie die Hauttemperatur gemessen. Die hautphysiologischen Untersuchungen ergaben einen signifikanten Anstieg des transepidermalen Wasserverlustes nach wIRA- Bestrahlung. Der durchschnittliche Anstieg der Hautfeuchte nach Bestrahlung betrug 37 relative Einheiten. Die Hauttemperatur stieg nach Bestrahlung von 33°C auf 36°C. Es zeigte sich, dass die Penetrationsraten des hydrophilen Fluoreszenzfarbstoffs erhöht werden, wenn die Haut vor oder nach topischer Applikation der Formulierung mit wassergefilterter Infrarot-A-Strahlung behandelt wird. wIRA lässt sich somit als Penetrationsverbesserer einsetzen. Hinsichtlich des lipophilen Curcumin zeigen die hier vorliegenden Untersuchungsergebnisse, dass eine Bestrahlung mit wIRA zu keinerlei Veränderung der Penetrationskinetik führt. Die gesteigerten Penetrationsraten der hydrophilen Substanz unter wIRA-Bestrahlung lassen sich durch die veränderten physiologischen Hautparameter, insbesondere der erhöhten Hydratation des Stratum corneum während und nach der Bestrahlung erklären. Weitere Untersuchungen sind notwendig um die penetrationsverbessernden Eigenschaften der wassergefilterten Infrarot-A-Strahlung für möglichst viele verschiedene Dermatika optimal ausnutzen zu können und die Rolle der gewählten Grundlage besser zu verstehen., Optical methods were used to investigate the influence of water filtered infrared A radiation (wIRA) on the dermatopharmacokinetics of topically applied substances. The penetration profiles of the hydrophilic dye fluoresceine and the lipophilic dye curcumin in a standard o/w emulsion were determined by tape stripping, in combination with spectroscopic measurements. Additionally, the penetration was investigated in vivo by laser scanning microscopy. Three different protocols (mode A-C) were used. In mode A, both dyes were applied onto the skin without water filtered infrared radiation. In mode B, the skin surface was irradiated by wIRA for 30 min before application. In case C, formulations were applied onto the skin and immediately irradiated for 30 min. In all cases, tape stripping started 30 min after application of the formulations. Significant differences were obtained for the penetration profiles of the hydrophilic dye in case of treatment or pretreatment with wIRA (modes B and C) compared to the non-irradiated skin areas (mode A). In contrast to fluoresceine, lipophilic curcumin showed no differences in the penetration kinetics, as to whether the skin was treated with wIRA or not irradiated. This effect was confirmed by laser scanning microscopy measurements. Water filtered infrared A radiation effects a hydration of the stratum corneum. In hydrated skin, the penetration of the hydrophilic substance fluoresceine is enhanced.