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HERV-K(HML-2) ist das jüngste und am besten erhaltene humane endogene Retrovirus. Menschliche Zellen, die diese Viren alle im Genom tragen sind in der Lage funktionelle virale Hüllproteine zu exprimieren. Diese Proteine können andere Retroviren pseudotypisieren und ihren Zelltropismus dadurch verändern. Wichtige Charakteristika des Eintrittprozesses, der durch das Hüllprotein von HERV-K(HML-2) vermittelt wird, sind noch unbekannt und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe von pseudotypisierten lentiviralen Reporterviren analysiert. Als HERV-K(HML-2)-Hüllprotein wurde eine zuvor rekonstituierte Sequenz von HERV-K113 verwendet. Im Fokus der Untersuchungen stand die Identifizierung der Domäne des Hüllproteins, die an den noch unbekannten Rezeptor bindet. Dafür wurde durch einen in silico-Vergleich mit Sequenzen verwandter β-Retroviren zunächst eine putative Rezeptorbindestelle gefunden. Durch gezielte Mutagenese wurde dieser Bereich mehrfach modifiziert. Die mutierten Hüllproteine waren nicht mehr in der Lage, den Zelleintritt der Viren zu gewährleisten oder verminderten ihn erheblich, was in Übereinstimmung mit einer Rezeptorbindungsfunktion dieser Proteinregion steht. Nachfolgend wurde der Versuch unternommen, durch Austausch der gefundenen Rezeptorbindedomäne von HERV-K(HML-2) gegen die des nahen verwandten MMTV, den Virustropismus zu verändern. Die chimären Proteine wurden jedoch nicht in Retroviren eingebaut. In einem weiteren Ansatz wurden lösliche Versionen der rezeptorbindenden SU-Einheit des HERV-K(HML-2)-Hüllproteins als Fusionsprotein mit einer C-terminalen Immunglobulindomäne hergestellt. Als Kontrolle wurden homologe Proteine mit Hüllproteinen anderer Retroviren kloniert und augereinigt. In einer Reihe von Experimenten konnte die spezifische Bindung dieser Proteine an einen zellulären Rezeptor in permissiven Zellen nachgewiesen. In einem proof-of principle Experiment wurde dann die Möglichkeit zur Kopräzipitation des unbekannten Rezeptors von HERV-K(HML-2) mit Hilfe dieser Fusionsproteine gezeigt. Im Zuge der Arbeit wurde der Rezeptor noch nicht isoliert. Die Herstellung und erfolgreiche Charkterisierung der SU-Ig-Fusionsproteine leistet dazu aber eine sehr aussichtsreiche und wichtige Voraussetzung., HERV-K(HML-2) is the youngest and best-conserved human endogenous retrovirus. Human cells, which are carrying these viruses in their genome, can express functional viral envelope proteins. These proteins can be used for pseudotyping other retroviruses and therefore for changing their cell tropism. In the present work, important characteristics of the entry process mediated through the envelope protein of HERV-K(HML-2), which are still unknown, were analysed using pseudotyped lentiviral reporter viruses. A previously reconstituted sequence of HERV-K113 was used as an HERV-K(HML-2) envelope protein. This study focused on finding the domain of the envelope-protein that binds to the yet unknown receptor. To achieve this, an in silico comparison with protein sequences of closely related Betaretroviruses was performed. This comparison allowed a prediction of a putative receptor binding site, which then underwent site-directed mutagenesis leading to several modifications within the region. The generated envelope mutants were either unable to mediate the cell entry of the viruses or did it in a heavily depleted manner, indicating the receptor binding role of the region. In order to alter the virus tropism, we interchanged the then found receptor binding domain of HERV-K(HML-2) with that of the most closely related MMTV, but the chimeric proteins couldn’t be incorporated into the retroviruses. A further approach consisted of expressing a soluble version of the receptor binding subunit of HERV-K(HML-2) envelope protein as a fusion protein with a C-terminal immunoglobulin domain. As control, homologous proteins based on envelope proteins from other retroviruses were cloned and affinity-purified. In a series of experiments, the specific binding of the proteins on a cellular receptor in permissive cells could be demonstrated. In a proof-of principle experiment, the possibility of a precipitation of the unknown receptor of HERV-K(HML-2) by using the fusion proteins was shown. In the course of this work, the receptor has not yet been isolated. The production and successful characterization of SU-Ig- fusion proteins supply however a promising and important requirement for future attempts.

Das E2F-assozierte Phosphoprotein EAPP interagiert mit den aktivierenden Mitgliedern der E2F Transkriptionsfaktor Familie, wodurch es die Transkription von Genen steigert, die das Fortschreiten des Zellzyklus fördern, und zugleich störend auf E2F1-induzierte Apoptose einwirkt. Deshalb wird vermutet, dass EAPP eine Rolle in der Tumorgenese spielt, was durch seine häufige Hochregulierung in transformierten Zelllinien bekräftigt wird. EAPP kann ebenso unabhängig von E2F agieren da es beispielsweise als Reaktion auf Stress oder DNS Schädigung die Expression von p21 stimuliert indem es an dessen Promoter bindet. Um die zelluläre oder molekulare Rolle eines Proteins zu untersuchen ist es oft hilfreich, die Aktivität dieses Proteins zu regulieren, was zum Beispiel durch Fusion mit den Ligandenbindungs Domänen von nuklearen Hormonrezeptoren erzielt werden kann. Ein aktuelles Beispiel dafür ist die N-terminale Fusion von EYFP und der Ligandenbindungs Domänen des Estrogenrezeptors mit E2F1 von Shats et al. (2017). Das Ziel dieses Projekts war es, das Plasmid von Shats et al. zu verwenden, um Liganden-abhängige EYFP-ER-EAPP Fusionsproteine zu kreieren, welche eingesetzt werden können, um die zelluläre Rolle von EAPP weiter zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde E2F1 mit verschiedenen EAPP Varianten ersetzt, nämlich Wildtyp (wt) EAPP, phospho-mutiertem (pm) EAPP und vier EAPP Trunkierungen. Die kreierten Konstrukte wurden mittels Sequenzierung und Restriktionsverdau verifiziert und stabil oder transient in U2OS und T98G Zellen transfektiert. Als die Reaktion der Konstrukte auf Tamoxifen und die daraus resultierenden Auswirkungen auf den Verlauf des Zellzyklus und die Reaktion auf DNS Schädigungen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Western blotting und Durchflusszytometrie untersucht wurden, stellte sich heraus, dass die nukleare Translokation von EAPP nur in einem geringen Maß Liganden-reguliert war, während keine Hinweise für eine Liganden-abhängige Regulierung seiner transkriptionellen Aktivität gefunden wurden. Zudem gaben Western blot und RNA-seq Ergebnisse Grund zu der Annahme, dass die transkriptionelle Aktivität von EAPP beeinträchtigt wurde da keine Veränderungen in der Expression von bekannten EAPP und/oder E2F Zielgenen in U2OS wt + EYFP-ER-EAPP wt/pm Klonen im Vergleich zu U2OS wt Zellen vorhanden waren. Eine weitere Beobachtung, die gemacht wurde, war, dass EYFP-ER-EAPP wt fähig war, Tamoxifen-abhängige subnukleare Foci zu formen, was sich jedoch als Artefakt herausstellte, vermutlich verursacht durch die Überexpression und der daraus resultierenden Aggregation des Fusionsproteins mit Promyelocytic Leukemia (PML) nuklear Körpern. Dies führte zu der Entdeckung, dass EAPP vermeintliche Sumoylierungsstellen und ein SUMO interaction motif (SIM) besitzt. Schlussendlich wurde durch RNA-seq gezeigt, dass EYFP-ER-EAPP pm eine weitaus größere Auswirkung auf das allgemeine Expressionsprofil von U2OS wt Zellen hatte als EYFP-ER-EAPP wt. Es ist jedoch unklar, ob dieser Effekt nur klonal bedingt war. Die RNA-seq Ergebnisse wiesen zudem auf einige potenzielle neue EAPP Zielgene hin, wie etwa POU3F2, COL6A3 und ENOSF1, die noch validiert werden müssen. Außerdem deuteten die Ergebnisse auf eine Involvierung von EAPP in der Regulierung von Genen, die mit der Strukturierung von Kollagen und der extrazellulären Matrix zusammenhängen, hin. Abschließend ist zu sagen, dass, auch wenn die kreierten EYFP-ER-EAPP Konstrukte nicht voll funktionsfähig waren und daher nicht erlaubt haben, die Funktionen von EAPP weiter aufzuklären, die Ergebnisse, die während dieses Projekts gemacht wurden, einige interessante Fragen aufgebracht haben, die als Input für zukünftige Studien dienen können. Zwei Fragen von besonderer Bedeutung sind, ob EAPP sumoyliert wird und welche Rolle die Phosphorylierung von EAPP für die Regulierung seiner transkriptionellen Aktivität spielt. The E2F-associated phosphoprotein EAPP interacts with the activating members of the E2F transcription factor family, thereby increasing the transcription of genes promoting cell cycle progression while also interfering with E2F1-induced apoptosis. Thus, EAPP is believed to have a role in tumorigenesis which is corroborated by its frequent upregulation in transformed cell lines. EAPP can also act independently from E2F as it, for example, stimulates the expression of p21 in response to stress or DNA damage by binding to its promoter. In order to study the cellular or molecular role of a protein, it is often helpful to regulate the activity of that protein, which can, for example, be achieved by fusion to the ligand-binding domains of nuclear hormone receptors. A recent example for this is the N-terminal fusion of EYFP and the ligand-binding domain of the estrogen receptor to E2F1 by Shats et al. (2017). The aim of this project was to employ the plasmid from Shats et al. to create ligand-dependent EYFP-ER-EAPP fusion proteins which may be applied to further investigate the cellular role of EAPP. For this purpose, E2F1 was replaced with different EAPP variants, namely wild-type (wt) EAPP, phospho-mutated (pm) EAPP and four EAPP truncations. The created constructs were verified by sequencing and by restriction digest and were stably or transiently transfected into U2OS and T98G cells. By examining the response of the constructs to tamoxifen and the thereof resulting impact on cell cycle progression and the DNA damage response by fluorescence microscopy, Western blotting and flow cytometry it was revealed that the nuclear translocation of EAPP was only ligand-regulated to a minor degree, while no evidence was found for a ligand-dependent regulation of its transcriptional activity. Moreover, Western blot and RNA-seq results gave reason to believe that the normal transcriptional activity of EAPP was impeded as there were no changes in the expression of known EAPP and/or E2F target genes in U2OS wt + EYFP-ER-EAPP wt/pm clones compared to U2OS wt cells. Another observation made was that EYFP-ER-EAPP wt was capable of forming tamoxifen-dependent subnuclear foci which, however, turned out to be an artifact presumably caused by the overexpression of the fusion protein and its thereof resulting aggregation with promyelocytic leukemia (PML) nuclear bodies. This lead to the finding that EAPP possesses putative sumoylation sites and a SUMO interaction motif (SIM). Finally, RNA-seq showed that EYFP-ER-EAPP pm had a by far greater impact on the overall expression profile of U2OS cells than EYFP-ER-EAPP wt, but it is unclear whether this effect was only clonal. The RNA-seq results also indicated several potential new EAPP target genes, like POU3F2, COL6A3 and ENOSF1, which will have to be validated. Furthermore, the results hinted at an involvement of EAPP in the regulation of genes related to collagen and extracellular matrix structuring. To conclude, even though the created EYFP-ER-EAPP constructs were not fully functional and did thus not allow to further elucidate the functions of EAPP, the findings made during this project did raise several interesting questions that could provide input for future studies. Two questions of particular significance are whether or not EAPP is sumoylated and what role the phosphorylation of EAPP plays in regulating its transcriptional activity. Vorgelegt von: Katharina Jonas Molecular Biotechnology Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018

Henipaviren sind hochpathogene Paramyxoviren, von denen zurzeit nur zwei Vertreter bekanntermaßen Infektionen im Menschen oder Nutztieren verursachen können. Das Hendra-Virus kommt in Australien vor und verursacht vor allem respiratorische Infektionen in Pferden. Das Nipahvirus (NiV) stammt aus Südostasien, wo es regelmäßig kleinere Ausbrüche schwerer Enzephalitiden im Menschen verursacht. Generell sind Henipavirus-Infektionen zoonotische Infektionen, wobei fruchtfressende Flughunde der Gattung Pteropus das natürliche Reservoir darstellen. Bis vor wenigen Jahren ging man davon aus, dass die Verbreitung der Viren auf Südostasien und Australien beschränkt ist. Im Jahr 2009 gelang es jedoch in Afrika aus Flughunden der Gattung Eidolon helvum neue Henipavirus-ähnliche RNA-Sequenzen isolieren. Eines dieser neu entdeckten afrikanischen Henipaviren, GH-M74a (M74), konnte vollständig sequenziert und kloniert werden. Da es bis heute nicht möglich war, vermehrungsfähige Viren aus Flughunden zu isolieren, basiert die Einschätzung ihres zoonotischen Potentials zurzeit auf Funktionsanalysen einzelner viraler Proteine im Vergleich zu den homologen Proteinen humanpathogener Henipaviren. Aufgrund ihrer wichtigen funktionellen Bedeutung für eine erfolgreiche Infektion neuer Wirtszellen und die Virusausbreitung von Zelle zu Zelle sollten in dieser Arbeit die beiden Oberflächen-Glykoproteine, das Rezeptor-bindende G und das Fusions-vermittelnde F-Protein, des neu entdeckten M74-Isolats funktionell charakterisiert werden. Hierfür wurden die M74-Glykoproteine zunächst in den Expressionsvektor pCAGGS kloniert. Um ihre Detektion zu ermöglichen wurden sie mit einem HA- bzw. FLAG-tag versehen. Mit Hilfe indirekter Immunfluoreszenz-Analysen wurde dann erst einmal nachgewiesen, dass alle klonierten Konstrukte exprimiert werden. Die Fähigkeit der beiden M74-Glykoproteine bei Koexpression Zell-Zell-Fusion zu vermitteln war allerdings gering und auf sehr wenige Zelllinien beschränkt. Ein Fusionsassay mit den heterotypischen NiV-G bzw. F-Proteinen ergab, dass der Hauptgrund für die geringe Fusionsaktivität im M74-F-Protein liegt. Anschließende Western Blot Analysen zeigten zwar eine mit dem NiV-F vergleichbar gute Gesamtexpression, M74-F wurde jedoch deutlich ineffektiver proteolytisch aktiviert und war kaum in fusionsaktiver Form auf der Zelloberfläche nachweisbar. Koimmunfluoreszenzen mit dem NiV-F zeigten außerdem deutliche Unterschiede in der intrazellulären Verteilung der beiden Proteine. Darüber hinaus wiesen Inhibitionsstudien zwar auf eine Endozytose-abhängige Spaltung des M74-F hin, zeigten aber, dass das M74-F nicht durch die NiV-F aktivierenden endosomalen Proteasen Cathepsin B und L gespalten wird. Dies spricht eindeutig für unterschiedliche intrazelluläre Transportwege. Um zu klären, ob dieser veränderte Transport und die geringe Oberflächenexpression auf bestimmte Protein-Bereiche zurückzuführen sind, wurden im zweiten Teil der Arbeit verschiedene M74-F Chimären sowie Deletions- und Punktmutanten untersucht. Die Tatsache, dass mit keiner der eingebrachten größeren und kleineren Mutationen, die Funktionalität verbessert werden konnte, lässt vermuten, dass die im Vergleich zu anderen humanpathogenen Henipaviren geringere Oberflächenexpression und Fusionsaktivität des M74-F-Proteins, eine konservierte intrinsische Eigenschaft ist. Eine solch reduzierte Bioaktivität eines Fusionsproteins könnte durchaus einen Vorteil für ein Flughund-Henipavirus darstellen. So könnte eine zu starke Ausbreitung im Reservoir-Wirt vermieden werden, was eine langfristige Infektion und somit das „Überleben“ der Viren ermöglichen könnte. Eine solch reduzierte Aktivität würde darüber hinaus auch das zoonotische Potential eines afrikanischen Henipavirus stark einschränken.

[no abstract]

Die Fusionsreaktion des Coronavirus MHV wird vom S-Protein vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Eintrittsweg von MHV-A59 in Mauszellen untersucht. Die Infektivität kann durch lysosomotrope Substanzen und Inhibitoren der Clathrin-abhängigen Endozytose gehemmt werden. Der Eintritt von MHV-A59 in Mauszellen erfolgt über die Clathrin-abhängige Endozytose und setzt die anschließende Fusion der viralen und zellulären Membran bei niedrigem pH-Wert voraus. Fluoreszenzmikroskopische Studien zur Interaktion fluoreszenzmarkierter MHV-A59 Partikel mit Mauszellen bestätigen, dass MHV-A59 über Endozytose aufgenommen wird. Nach Bindung der Viren an die Zellen und anschließende Erniedrigung des pH-Wertes kommt es zur Färbung der Plasmamembran. Die Erniedrigung des pH-Wertes in Abwesenheit des Rezeptors führt zu einer irreversiblen Konformationsumwandlung im viralen Fusionsprotein, die die Inaktivierung der Fusionsaktivität und den Verlust der Infektivität zur Folge hat. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung des endozytotischen Weges für den viralen Eintritt von MHV-A59 hin. Ein niedriger pH-Wert eines zellulären endosomalen Kompartiments induziert vermutlich die Konformationsänderung im S-Protein und löst die Fusionsreaktion aus. Ein vorläufiges 3D-Modell des S-Proteins von MHV-A59 konnte erstellt werden. Darüber hinaus wurde die Struktur und Fusionsfähigkeit des S-Proteins von SARS-CoV analysiert. Ein Zell-Zell-Fusionsassay konnte nachweisen, dass die Fusion zwischen S-Protein und ACE2-exprimierenden Zellen sowohl abhängig vom pH-Wert als auch von der proteolytischen Spaltung in S1- und S2-Untereinheit ist und durch Erniedrigung des pH-Wertes zusätzlich verstärkt werden kann. Im abschließenden Teil der Arbeit wurde auf Basis theoretischer Untersuchungen eine Vorhersage des mutmaßlichen Fusionspeptids des S-Proteins von MHV-A59, welches alle wesentlichen Merkmale eines internen Fusionspeptids aufweist, vorgenommen. Es liegt nahe der "Heptad-Repeat" (HR) Domäne HR1., Fusion of the Coronavirus MHV-A59 is mediated by the viral S-protein. The entry pathway of MHV-A59 into murine cells was studied in this work. Infection was strongly inhibited by lysosomotropic compounds and substances interfering with clathrin-dependent endocytosis, suggesting that MHV-A59 is taken up via endocytosis and delivered to acidic compartments. Fluorescence microscopy of labeled MHV-A59 confirmed that the virus is taken up via endocytosis. When the virus was bound to cells and the pH was lowered to 5.0, we observed a strong labeling of the plasma membrane. Electron microscopy revealed low pH triggered conformational alterations of the S-ectodomain. These alterations are likely to be irreversible because low pH-treatment of viruses caused an irreversible loss of fusion activity. The results imply that endocytosis plays a major role in MHV-A59 infection and that the acidic pH of the endosomal compartment triggers a conformational change of the S-protein mediating fusion. Furthermore the conformation of the trimeric spike protein of the murine hepatitis virus A59 was characterized by cryoelectron microscopy. A preliminary 3D-reconsruction of the native structure could be accomplished. Besides we studied the structure and fusion capability of the spike protein expressed by SARS-CoV. The cell-based fusion assay revealed that fusion of spike protein and ACE2-receptor expressing cells was strongly dependent on low pH and on proteolytic cleavage of the S-protein into S1 and S2 subunit. Additionally fusion could be significantly increased by lowering of the pH. The theoretical part of the thesis allowed the identification of the putative fusion peptide, which showed main characteristics of internal fusion peptides. It allows the heptad regions of the spike protein to assemble in the six-helix bundle structure (6HB). This structure is of great importance to initiate the approximation of viral and cellular membrane and thus to induce fusion.

Among other humoral factors, cytokines get secreted by a variety of cell types in response to different external stimuli and induce a multitude of biological effects. IL-6-type cytokine family members activate the Jak/STAT signalling pathway and hence modulate processes such as apoptosis, proliferation, angiogenesis and migration of cells. The cytokine IL-6 possesses great clinical relevance because dysregulation of IL-6 expression can be observed in many chronic inflammatory diseases as well as in cancer. A particular concept for IL-6 inhibition was achieved by preventing receptor activation through sequestration of the cytokine. In a previous study, an IL-6 inhibitor was constructed by a fusion of the ligand binding domains of the human IL-6 receptor components, namely domains D1 to D3 of gp130 and D2-D3 of IL-6R alpha. The present study aimed at the generation of an IL-6-inhibitor based on the murine receptor proteins for the future validation of the fusion protein concept in aminal studies. Although murine and human IL-6R alpha and gp130 proteins show a very high degree of homology, no IL-6 binding could be achieved by an analogous fusion of murine receptor domains. This unexpected result illustrates functional differences in respect of ligand binding between human and murine IL-6R alpha. Based on a model structure of murine IL-6R alpha derived from the solved crystal structure of the human IL-6 receptor complex, a set of amino acids was identified which could potentially influence IL-6 binding and account for the observed differences in the human and murine systems. By generation of specific deletion- and point-mutations within the immunoglobulin-like domain of the full-length murine IL-6R alpha protein the functional relevance of particular amino acid residues within a 12 amino acid stretch (preD1-region) was investigated. This region at the amino-terminus of the protein is connected to domain D2 via a disulfide bond linking the cysteine residues C6 and C171. The disulfide bond is important for the positioning of several hydrophobic N-terminal amino acids (LVL-motif) which interact with amino acid residues located in the beta-strands C and D of domain D2, a region which is in the immediate vicinity of the so-called site I-interface between IL-6R alpha and IL-6. Using life cell imaging and flow cytometry, it was shown that the deletion or substitution of Cysteine C6 within the preD1-region of murine IL-6R alpha shows a dominant negative effect both on localization (surface expression) and protein function (IL-6 binding). By the mutation of this particular cysteine a mutation outside the „classical“ CBM was generated which impairs IL-6 binding. Another motif of functional relevance in murine IL-6R alpha consists of three hydrophobic N-terminal amino acid residues (L1V2L3-motif). By the generation of a triple mutant where the hydrophobic amino acids were replaced by amino acids with small polar side chains, the cooperative effect of these residues in regard to IL-6 binding was characterized. Substitution of this motif resulted in a significantly diminished activation of the JAK/STAT-signal transduction pathway despite a comparable surface expression of the receptor constructs. At a later stage, it could also be shown that this mutation showed reduced IL-6 binding in the context of a mIL-6R alpha/gp130 fusion protein (inhibitor concept). Based on these findings, the protein domains which are crucial for ligand binding in the murine receptor system were defined and a functional IL-6 inhibitor was generated. For this, the domains D1 to D3 of murine gp130 were connected to domains D1 to D3 of murine IL-6R alpha. This mIL-6-R fusion protein (mIL-6-RFP) was capable of neutralizing IL-6 of different species (human, mouse, rat) with comparable efficiency, whereas no inhibition of structurally related cytokines of the IL-6-type-cytokine-family such as IL-11 and OSM was detectable. In vitro, mIL-6-RFP showed a 30-times stronger inhibition of IL-6-dependent proliferation of cells than an antagonistic IL-6R alpha antibody. Moreover, it was demonstrated that mIL-6-RFP efficiently inhibited the so-called trans-signalling which is elicited by IL-6 in combination with a soluble form of IL-6 receptor. In the course of this study a strategy for optimization of protein secretion was established, resulting in a considerable increase of protein amount in mammalian expression systems. The generated mIL-6-RFP also displayed a satisfactory stability in plasma samples of animals if expressed in-vivo in rats. With the generation of mIL-6-RFP a highly potent and specific IL-6 inhibitor is available for the use in animal studies (mouse/ rat). This will permit a further characterization of the role of IL-6 in various disease models and could ultimately lead to the use of this macromolecular inhibitor in anti-IL-6 therapy.

Drei Typen von Antikörperfragmenten wurden für die Umweltanalytik in E. coli hergestellt. Zum Nachweis der Pyrethroid-Insektizide wurde unter Einsatz des Phagen-Displays ein single-chain Fv (scFv)-Fragment aus Pyrethroid-spezifischen Hybridomzellinien synthetisiert, das an das Derivat des Pyrethrtoids Permethrin bindet. Über Subklonierung von scFv-Fragmenten in ein geeignetes Expressionssystem wurden s-Triazin-spezifische Fab-Fragmente konstruiert, deren Bindungseigenschaften mit den scFv-Fragmenten identisch waren. Ein bifunktionelles Fusionsprotein aus der alkalischen Phosphatase und dem Atrazin-spezifischen scFv-Fragment wurde durch Modifikation eines Vektorsystems generiert. Three different types of antibody fragments were generated in E. coli for application in environmental analysis. To detect the pyrethroid insectizides a single-chain Fv (scFv) fragment binding to the derivative of the pyrethroid permethrin was synthesized from pyrethroid-specific hybridoma cell lines using phage display. In order to construct s-triazine specific Fab fragments scFv fragments were subcloned in a suitable E. coli expression system without loosing their binding properties. By the modification of a vector system a bifunctional fusion protein consisting of an atrazine-specific scFv fragment and the enzyme alkaline phosphatase was generated.

1\. Titelseite, Inhaltsverzeichnis 1 2\. Einleitung 7 3\. Methoden 26 4\. Ergebnisse 38 5\. Diskussion 56 6\. Zusammenfassung 73 7\. Literaturverzeichnis 76 8\. Anhang 87, Die kardiodepressive Wirkung vieler Zytokine und ihre erhöhten Serumspiegel bei einer Vielzahl kardiologischer Erkrankungen sind schon seit mehreren Jahren bekannt. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle des Zytokins Interleukin-2 (IL-2) bei 90 männlichen Sprague Dawley-Ratten nach einem Myokardinfarkt untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit wurde über vier unterschiedlichen Zeiträume (6 Stunden, 24 Stunden, 6 Tage und 3 Wochen) nach einem operativ ausgelösten Myokardinfarkt endogenes IL-2 durch IL2-IgG2b (ein IL-2 Fusionsprotein) in vivo funktionell inhibiert. Anschließend wurden die Tiere erneut narkotisiert und mittels Linksherzkatheter hämodynamisch charakterisiert und die Herzen dann exzidiert und immunhistologisch und histochemisch zum Nachweis von IL-1beta, IL-2, TNF-alpha und Kollagen aufgearbeiten. Mit dieser Arbeit konnte erstmals der Nachweis auf Proteinebene erbracht werden, dass schon in der frühen akuten inflammatorischen Phase nach einem Herzinfarkt vermehrt IL-2 im Myokard zu finden ist und dass dessen Menge in der folgenden Granulationsphase sogar weiter zunimmt. Dabei konnte gezeigt werden: 1\. Durch eine Inhibition von IL-2 konnte eine signifikante Verbesserung der Hämodynamik in allen vier Untersuchungszeiträumen nachgewiesen werden. (Steigerung gegenüber Kontrollen in Prozent: LVP + 21-51 %, Kontraktilität + 74,4 - 32,2 %, Relaxation + 80 - 46 %). Am ausgeprägtesten waren diese Effekte in der sehr frühen Phase (6 Stunden) nach einem Infarkt. 2\. Es konnte ein histologisches Korrelat zu der verbesserten Herzfunktion in diesen Phasen gefunden werden. So war durch eine IL-2-Inhibition die Menge des kardiodepressiven Zytokins IL-1beta nach 24 Stunden signifikant reduziert (um 77%). Nach drei Wochen wiesen mit IL2-IgG2b behandelte Tiere eine signifikant geringer ausgeprägte reaktive Fibrose im nichtinfarzierten Myokard (Reduktion um 40%) auf bei kaum beeinflusster reparativer Fibrose im Infarktbereich. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede in den Gruppen hinsichtlich der Letalität oder der Infarktgröße (40 - 45 % der Gesamtfläche des linken Ventrikels). Eine direkte positiv inotrope Wirkung des verwendeten IL2-IgG2b konnte ausgeschlossen werden. Daher meinen wir, dass IL-2 und die IL-2 ausgelöste Aktivierung weiterer Zytokine eine bedeutende Rolle bei der linksvenrikulären Dysfunktion nach einem Myokardinfarkt zukommen., The cardiodepressant effects of many cytokines and their increased serum levels in severeal cardiological diseases have been well known for several years. In this context we investigated the role of the cytokine Interleukin-2 (IL-2) in 90 male Sprague Dawley rats after myocardial infarction. In this experiment we inhibited endogenic IL-2 in vivo by using IL2-IgG2b (an IL-2 fusion proteine) while four different periods of time (6 hours, 24 hours, 6 days and 3 weeks). Afterwards the animals were anesthetized for a second time and hemodynamicly assesed using a cardiac catheter. Finally the hearts were excised and forwarded for immunhistological and histochemical studies regarding IL-1beta, IL-2, TNF-alpha and collagen. This is the first publication showing on a proteine level that IL-2 is increased in myocardial tissue after myocardial infarction in the early inflammatory phase and is even more increasing in the phase of granulation thereafter. It could be shown: 1. By inhibiting IL-2, the animals hemodynamics could be improved significantly at every time point examined (improvement compared to controlls in per cent: left ventricular pressure + 21-51 %, contractility + 74,4 - 32,2 %, relaxation + 80 - 46 %). The effect was marked at the very early phase (6 hours post MI). 2\. We showed that improvement of left ventricular function correlated with our histological findings. For example the amount of the cardiodepressive cytokine IL-1beta within cardiac tissue was reduced just after 24 hours in the treated group (by 77%). After three weeks animals treated with IL2-IgG2b showed a signifivantly reduced reactive fibrosis in the non-infarcted myocardium compared to controls (reduced by 40%). The reparative fibrosis in the infarcted myocardium remained unchanged. No significant differences between the groups regarding lethality or size of infarction (approx. 40-45 % of the left ventricle) were seen. A positive inotropice effect of the IL2-IgG2b used was ruled out. Thus we conclude that IL-2 and the IL-2 triggered activation of further cardiodepressant cytokines play an important role in left ventricular dysfunction post MI.