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Gene therapy holds great potential for the treatment of various acquired and inherited pulmonary diseases. Among various viral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors have been most frequently used in different clinical trials of pulmonary gene therapy. In the present study, we examined the kinetics and duration of transgene expression, vector biodistribution and development of neutralizing antibodies (NAB) in mice after pulmonary application of AAV2/9 vector. The pulmonary route of application did not affect any of the measured parameters. Transgene expression and biodistribution analysis at day 450 post-application confirmed the systemic spread of the vector after pulmonary delivery. Using SPB(-/-) mice, the study shows that AAV2/9-mediated gene expression is influenced by animal gender but not mouse genotype and is insensitive to the presence of lung inflammation. Lower expression levels were observed in male compared with female mice, and transient immunosuppression with dexamethasone significantly reduced the development of NAB in both genders of mice. The study thus advances this serotype for further development and use as a therapeutic vector.

In dieser Arbeit wurden zwei Themengebiete des pulmonalen Gentransfers behandelt. Im ersten Teil wurde ein Pulveraerosol für den nicht-viralen Gentransfer mit PEI/pDNA-Komplexen entwickelt. Im zweiten Teil wurde ein AAV2/9-Vektor zum lokalen viralen Gentransfer in die Lunge untersucht. Die Entwicklung des Pulveraerosols hat den Hintergrund, dass die Applikation nicht-viraler Genvektoren in Form von wässrigen Aerosol-Formulierungen große Stabilitätsprobleme mit sich bringt, die mit der Entwicklung eines Pulveraerosols behoben werden können. Dies ist von besonderer Bedeutung bei der Verwendung von Aerosol-Formulierung in klinischen Studien, da diese zum aktuellen Zeitpunkt stets unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden müssen. Dies ist angesichts der gewünschten GMP-Bedingungen problematisch. Die Herstellung der Pulveraerosole erfolgte durch Lyophilisation von PEI/ pDNA- Komplexen zusammen mit Disacchariden (Lactose, Trehalose und Saccharose) und anschließende Zerkleinerung im CapMix. Die Untersuchung verschiedener Disaccharide als Lyoprotektoren ergab keine Unterschiede bezüglich der biophysikalischen Eigenschaften der resultierenden Formulierungen. Die Partikelgröße nahm zu, sobald die Lyophilisation nicht mit mindestens 250-fachem Disaccharidüberschuss durchgeführt wurde. Im Weiteren kam es nach Pulverisierung zu einer Partikelgrößenzunahme unabhängig von der zugesetzten Disaccharidmenge; einzig Formulierungen mit einem 50-fachen Disaccharidüberschuss resultierten in kleineren Komplexen. Nach der Lyophilisation kam es unabhängig von der zugesetzten Disaccharidmenge zu einem Anstieg des Zetapotenzials, das auch nach Pulverisierung noch erhöht war. Die Freisetzung der pDNA aus den lyophilisierten Komplexen mittels Inkubation mit Heparansulfat und anschießender Gelelektrophorese erfolgte komplett. Nach der Pulverisierung wurde die pDNA ebenfalls aus den Komplexen freigesetzt, allerdings konnte bei den Proben mit einem 50-fachen Disaccharidüberschuss nur ein Teil der pDNA freigesetzt werden. Die Charakterisierung der Pulveraerosole am Andersen Kaskadenimpaktor zeigte erste Unterschiede zwischen den eingesetzten Disacchariden. Der ermittelte MMAD war für Saccharose mit 4,3 µm am kleinsten, womit Saccharose das feinste Pulveraerosol lieferte. Mit Lactose resultierte eine MMAD von 4,7 µm und mit Trehalose einer von 5 µm. Die in vitro Untersuchungen wurden auf zwei verschiedenen Bronchialepithel-Zelllinien durchgeführt. Es konnte wie auch bei den biophysikalischen Untersuchungen kein Unterschied zwischen den Disacchariden festgestellt werden. Tendenziell kam es nach Lyophilisation zu einer leicht verbesserten Genexpression bei allen eingesetzten Disaccharidüberschüssen im Vergleich zur Kontrolle. Nach der Pulverisierung war die Genexpression vergleichbar mit derjenigen der Kontrollkomplexe, wenn mindestens ein 100-facher Disaccharidüberschuss eingesetzt wurde. Formulierungen mit einem 50-fachen Überschuss resultierten nach Pulverisierung in einer tendenziell schlechteren Expression. Die in vivo Versuche mit Luciferase zeigten die Genexpression in den Lungen der Mäuse. Nach Quantifizierung der Luciferase-Expression bezogen auf das Lungengewebe konnte für Lactose als Lyoprotektor die höchste Genexpression gezeigt werden. Die Bestimmung der in der Lunge aufgenommenen pDNA mittels Real-Time PCR resultierte in signifikant höheren Werten in der Lactose-Gruppe im Vergleich zu den beiden anderen Gruppen. Die Verwendung eines für Erythropoetin kodierenden Plasmids in Form des Lactose-Pulvers resultierte in einer signifikanten Erhöhung des Hämatokritwertes. Histologische Untersuchungen der Lungen zeigten eine geringgradige Entzündung, die mit der Einwanderung von Erythrozyten und neutrophilen Granulozyten einherging. Dies konnte sowohl nach Applikation der PEI/pDNA-Pulveraerosols aus auch nach der Verneblung von reinem Lactosepulver beobachtet werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass durch Verwendung geeigneter Lyoprotektoren die Formulierung von Pulveraerosolen mit PEI/pDNA-Komplexen möglich ist und die in vivo Applikation zu einem physiologischen Effekt führt. Damit stellt diese Applikationsform eine vielversprechende Option für den pulmonalen Gentransfer dar. Die Verwendung nicht-viraler Vektoren führt nur zu einer transienten Expression des Transgens, weshalb im zweiten Abschnitt dieser Arbeit ein viraler AAV2/9-Vektor für den pulmonalen Gentransfer untersucht wurde. Unter den viralen Vektoren bieten AAV-Vektoren verschiedene Vorteile. Der Wildtypvirus ist beim Menschen nicht pathogen, es besteht keine Gefahr der insertionellen Mutagenese und die Immunantwort nach Applikation verläuft sehr mild. Im Vergleich zu dem bisher am häufigsten verwendeten AAV2-Vektoren sind sowohl die Prävalenz neutralisierender Antikörper als auch deren Titer für AAV2/9-Vektoren deutlich niedriger, weshalb diese eine attraktive Alternative darstellen. Nach Optimierung des Vektor Backbones, konnte in Balb/c-Mäusen gezeigt werden, dass die Applikationsroute keinen Einfluss auf die Transgenexpression hat. Sowohl nach intranasaler als auch nach intratrachealer Applikation blieb die Genexpression über 450 Tage konstant. Weiterhin hatte der Mausstamm keinen Einfluss auf die Genexpression. Dies konnte durch Versuche in konditionellen SPB-/--Mäusen gezeigt werden. Des Weiteren war die Genexpression unabhängig vom Geschlecht der Mäuse. Zwar war die Expression bei den weiblichen SPB-/--Mäusen zwischen 10- und 50-fach höher im Vergleich zu den männlichen Mäusen, die Unterschiede waren aber nicht signifikant. Die Applikation des AAV2/9 in die entzündete Lunge von SPB-/--Mäusen hatte ebenfalls keinen Einfluss auf die Expression. Die Entwicklung neutralisierender Antikörper gegen den Vektor stellt die größte Hürde bei der wiederholten Applikation von AAV-Vektoren dar. Die Applikationsroute hatte keinen Einfluss auf diese Entwicklung. In beiden Gruppen waren 450 Tage nach Vektor-Applikation NAB nachzuweisen. Durch Dosisreduktion konnten zwar die NAB-Titer verringert werden, allerdings ging damit auch eine starke Verminderung der Transgenexpression einher. Weiterhin wurde die Entwicklung von NAB nicht durch das Geschlecht beeinflusst. Durch Immunsuppression mit Dexamethason konnten außerdem die Titer der NAB reduziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass es nach lokaler Applikation des AAV2/9-Vektors zur Transgenexpression in der gesamten Maus kommt. Die Verteilung des Vektors konnte durch Biodistributionsstudien belegt werden. Es zeigte sich die höchste Vektor-DNA Deposition in der Lunge. Die intratracheale Applikation lieferte eine höhere Vektor-DNA Konzentration in der Lunge kombiniert mit niedrigeren Mengen in Leber und Milz im Vergleich zur intranasalen Gruppe, allerdings waren die Unterschiede nicht signifikant. Diese Ergebnisse zeigen, dass AAV2/9-Vektoren geeignet sind, um die Langzeit-Expression eines Transgens zu erreichen. Die Effizienz dieses Vektors in entzündeten Lungen lässt auf gute Ergebnisse in einem therapeutischen Modell hoffen. Bevor dieser Vektor allerdings klinisch eingesetzt werden kann, muss nach Methoden gesucht werden, die die Biodistribution nach lokaler Applikation verhindern und die Immunogenität reduzieren., This work is divided into two parts, both regarding pulmonary gene delivery. The overall goal of the first part was the development of a powder aerosol for the delivery of PEI/pDNA complexes to the lung. The second part investigated the effect of gene expression, biodistribution and immuneresponse after pulmonary application of an AAV2/9 vector. The reason for developing a dry powder aerosol for pulmonary gene delivery is the well documented physical instability of aqueous suspensions of non-viral vector complexes over time. These instabilities include aggregation tendencies and loss of transfection efficiency, thus requiring fresh preparation each time directly prior to injection for maximal effect. Dry powder systems confer many advantages including increased stability, reduced drug loss during administration and improved portability. The technique of lyophilization was used to produce dry powder cakes followed by powderization with zirconia beads using a CapMix. Different sugars, namely lactose, sucrose and trehalose, were used as lyoprotectants. The first part of the study was directed at the biophysical characterization of complexes before and after lyophilization and after powderization. Particle size measurements of gene vector complexes showed that augmenting the amount of sugar, independent of the sugar type, used during lyophilization led to lower increase or maintenance of the particle size. Complexes lyophilized without sugar showed an enormous increase in particle size. After powderization, the particle size increased in nearly all samples. Only samples with a 50-fold excess of sucrose resulted in smaller particles in comparison to the size after lyophilization. In contrast to particle size, the increase of zeta potential is not influenced by the amount of sugar. DNA retardation assay revealed no major differences between freshly prepared, lyophilized and powderized complexes with exception of the powderized sample with an excess of 50/1 of sugar, which did not release pDNA completely. After characterizing the nanoparticles the resulting powders were analyzed by Andersen Cascade Impactor. Sucrose led to the finest powder with a MMAD of 4.3 µm, followed by Lactose (4.7 µm). The trehalose sample had a MMAD of 5 µm, thus producing the most coarse powder of all samples. These results show that although the sugars have no influence on the particle size of gene vector complexes, they do influence the MMAD of the powder aerosol. After biophysical characterization, complexes were used in transfection studies to explore their gene delivery potential in vitro. Lyophilized and powderized complexes were compared to freshly prepared complexes on BEAS-2B and 16HBE14o- cells. Lyophilization with different sugars did not lead to any difference in gene expression on both cell lines. Values measured with lyophilized samples were slightly higher than those of freshly prepared positive controls. Addition of free sugars, in amounts corresponding to concentrations presented on complexes, did not influence the transfection efficiency. After powderization process, gene delivery is retained in comparison to freshly prepared complexes. Only samples containing a 50-fold excess of sugar showed slightly decreased expression values. In vivo administration of powder aerosols resulted in gene expression in lungs of treated mice. Quantification of pDNA in lung tissue by real-time PCR resulted with lactose as lyoprotector during lyophilization in significantly, up to 3-fold higher values compared to the other two lyoprotectants. By using a plasmid coding for murine erythropoietin formulated with lactose a significant increase of the hematocrit value could be achieved, demonstrating a physiological response after powder aerosol treatment. Histological analysis of lungs treated with either PEI/pDNA lactose powder or lactose powder without gene vector complexes, showed a slide inflammation with increased numbers of erythrocytes and neutrophil granulocytes in the alveolar region. In summary, the first part of the work convincingly shows the applicability of dry powder aerosols for pulmonary gene delivery and expression of the desired transgene at physiological levels, making this technique a promising option for pulmonary gene delivery. Dominance of viral vectors in numerous gene therapy clinical trials can be attributed to their high efficiency of gene transfer. Desirable attributes like lack of pathogenicity, ability to transduce non-dividing cells, prolonged transgene expression and low immunogenicity present AAVs as potential vectors for clinical applications. The second part of this work successfully demonstrates stable long term expression using AAV2/9 based vector in two different mouse strains (BALB/c-mice and SPB-mice). After optimization of the vector backbone, no effect of either mouse genotype or pulmonary route of delivery on transgene expression could be observed. Gene expression was constant over 450 days both after intranasal and intratracheal application of the vector. Besides mouse strain, animal gender has also been shown to influence AAV mediated gene delivery. This study demonstrates no gender specific differences in transgene expression post AAV2/9 mediated gene delivery. Though there was a threefold higher gene delivery as measured by real time PCR, 10-50 fold higher expression was observed in female mice compared to their male counterparts, but all results were insignificant. Further, no significant difference in expression was observed when AAV2/9 was delivered to inflamed lungs of SPB-mice. These results point to the resistance of AAV2/9 to pulmonary inflammation. NAB development is a major limitation of viral vectors and inhibits vector readministration. Pulmonary route of administration had no influence on NAB development, as demonstrated in BALB/c-mice. By using 10- and 100-fold lower doses, significantly reduced NAB titers were achieved but lower doses also resulted in drastically reduced transgene expression. In SPB-mice, by using transient immunosuppression with dexamthasone, the development of NABs was significantly inhibited in both gender types thereby overcoming a major hurdle in the way of using AAV based vectors for gene therapy. In contrast to transgene expression and NAB development which were unaffected by the pulmonary route of application, biodistribution studies showed a trend for higher delivery to the lungs combined with lower deposition in spleen and liver when using the intratracheal route. Using real time PCR mediated vector quantification and in vivo bioluminescence imaging, systemically distribution post pulmonary gene delivery and persistent gene expression in various organs of the vector was observed. These findings bode well for the application of AAV2/9 based vectors, where long-term transgene expression is desired. The performance of AAV2/9 in the presence of lung inflammation gives hope for use in a therapeutic setting. Prior to clinical application, strategies need to be developed that limit viral biodistribution and immunogenicity.

Das Ziel dieser Dissertation bestand in der Optimierung des nichtviralen Gentransfers insbesondere in hämatopoetische Zellen. Hierbei sollte eine möglichst hohe Transfektionseffizienz und damit hohe Transgenexpression, sowie stabile Transgenexpression erzielt werden. Die systematische Untersuchung eines Plasmid-DNA-Dimers im Vergleich mit dessen Monomer ergab deutliche Unterschiede bezüglich intrazellulärer Verteilung und Transgenexpression nach Transfektion. Bei Transfektion äquimolarer Mengen an Genkopien ergab sich bezüglich der Höhe der Transgenexpression der transfizierten Zellen kein Unterschied. Interessanterweise konnte nach Transfektion äquimolarer Mengen an Plasmid-DNA-Molekülen höhere Transgenexpression in den Zellen beobachtet werden, die mit dem Dimer transfiziert wurden. Im Weiteren wurde die intrazelluläre Lokalisation der Konkatemere nach Transfektion untersucht. Im Zusammenhang mit den relativen Mengen der jeweiligen Konstrukte im Zellkern und der zuvor bestimmten Transgenexpression ließ sich die relative Transkriptionseffizienz der beiden Konstrukte berechnen. Interessanterweise vermittelte das dimere Plasmid-DNA-Molekül mit 3,5-fach höherer Effektivität Transgenexpression als das entsprechende Monomer. Durch die spezifische Integration von Plasmid-DNA ins Genom von Zielzellen mittels Streptomyces Bakteriophage phiC31 Integrase ist es möglich grundsätzlich in vitro, als auch in vivo stabile Transgenexpression zu erreichen. Um die Möglichkeit zu untersuchen, mittels phiC31 Integrase stabilen Gentransfer in hämatopoetischen Zellen zur erreichen, wurden verschiedene Vektoren zur Integration mit unterschiedlichen Integrase-kodierenden Plasmiden kotransfiziert. Diese führten allerdings, verglichen mit Kontrollexperimenten, nicht zu erhöhter oder verlängerter Transgenexpression. Ausschließlich mit relativ hohen Mengen an Integrase-kodierender mRNA konnte erhöhte Langzeit-Transgenexpression erzielt werden. Dies steht in Kontrast zu bisherigen Untersuchungen in Zellen anderer Gewebe. Um die Aktivität der Integrase in hämatopoetischen Zellen genauer zu untersuchen, wurde ein optimierter Versuchsaufbau entwickelt. Hierbei wurde die Integrase-vermittelte Rekombination episomaler Plasmid-DNA zwischen den Wildtyp-attB- und attP-Sequenzen in hämatopoetischen Zellen und Zellen anderer Gewebe untersucht. Dabei ergab sich sowohl bezüglich Integrase- vermittelter β-Galaktosidase-Expression als auch bei der Quantifizierung der Rekombinationsprodukte eine deutlich reduzierte Aktivität der Integrase in den untersuchten hämatopoetischen Zelltypen. Um die zellspezifischen Unterschiede in der Aktivität der Integrase im Detail zu untersuchen, wurde ein direkter Vergleich von Jurkat-T-Zellen und A549-Alveolar-TypII-Zellen durchgeführt. Hierbei wurden nach Transfektion unterschiedlicher Integrase-Konstrukte jeweils circa 16-fach höhere Integraseaktivität in Lungenzellen beobachtet. Aus der Literatur ist bekannt, dass die Interaktion der phiC31 Integrase mit zellulärem DAXX-Protein zur Inhibierung der Integraseaktivität führt. Um einen Zusammenhang der reduzierten relativen Aktivität der phiC31 Integrase in hämatopoetischen Zellen mit DAXX zu untersuchen, wurde zelluläres DAXX in Jurkat -, sowie in A549-Zellen auf Protein-Ebene detektiert. Die deutlich verringerte Aktivität der Integrase in hämatopoetischen Zellen, verglichen mit anderen Geweben, könnte auf eine höhere Expression von DAXX-Protein in hämatopoetischen Zellen zurückgeführt werden. Eine Alternative zur stabilen Integration von Plasmid-DNA ins Genom stellt die stabile Transfektion extrachromosomaler Plasmid-DNA dar. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Einführung einer Scaffold Matrix Attachment Region zwischen Transgen und polyA-Schwanz im Plasmid episomale Replikation in hämatopoetischen Zellen vermittelt werden kann (Papapetrou et al., 2006). In den Untersuchungen musste allerdings nach Transfektion des Vektors pEPI1 ein mehrwöchiger Selektionsdruck mit G418 angewendet werden, um episomale Replikation und Langzeit-Expression zu erreichen. Um den Einfluss des Promotors in Kombination mit der huINF β-S/MAR zu untersuchen, und die Möglichkeit zu testen, durch den Austausch des Promotors stabile Transgenexpression ohne Selektionsdruck zu erreichen, wurden Konstrukte mit dem Ubiquitin B- oder dem Ubiquitin C-Promotor in Kombination mit der huINF β-S/MAR bezüglich Transgenexpression in vitro und in vivo charakterisiert. Sowohl unter Kontrolle des Ubiquitin B- als auch des Ubiquitin C Promotors konnte in Kombination mit der S/MAR in vitro eine erhöhte und verlängerte Transgenexpression in hämatopoetischen Zellen ohne die Anwendung von Selektionsdruck beobachtet werden. Die Untersuchungen des Status der transfizierten Plasmid-DNA zu verschiedenen Zeitpunkten nach Transfektion ergab jeweils das Vorhandensein extrachromosomaler S/MAR-enthaltenden Vektoren. In vivo konnte ebenfalls eine erhöhte Transgenexpression in Lunge und Leber der S/MAR-Konstrukte über einen Zeitraum von sechs Monaten beobachtet werden. Der in vivo Effekt der huINF β-S/MAR lag hier vor allem einer Verringerung des Gen-silencing. Zusammenfassend konnte durch die Verwendung von Plasmid-Konkatemeren die Transgenexpression deutlich gesteigert werden. Stabile Transgenexpression durch die spezifische Integration von Plasmid-DNA mittels phiC31 Integrase konnte in hämatopoetischen Zellen durch die Interaktion der Integrase mit dem zellulären Protein DAXX nicht erreicht werden. Dagegen konnte dies nach Transfektion von Plasmid-DNA mit geeigneten Promotoren und der huINF β-S/MAR durch den extrachromosomalen Verbleib der DNA und verlängerte Transgenexpression in der Zelle erreicht werden., The overall aim of this thesis was the optimization of nonviral gene transfer particularly into hematopoietic cells. High transfection efficiencies and transgene expressions were achieved by the use of plasmid DNA (pDNA) concatemers. In further parts of the study it was investigated to which extend stable transgene expression could be achieved either with persistent extrachromosomal pDNA or with integrated pDNA into the genome of hematopoietic cells. The investigation of a pDNA dimer in comparison to its monomer resulted in significant differences regarding intracellular localization and transgene expression after transfection. When equimolar ratios of gene copies were transfected, no difference was found with respect to EGFP expression per transfected cell. Interestingly higher EGFP expression was found in dimer- transfected cells, when equimolar ratios of plasmid molecules were transfected. Further, the intracellular localization of the different constructs was investigated after transfection of equimolar ratios of either gene copies or pDNA molecules. From the relative amounts of pDNA present in the nucleus and the resulting transgene expression the relative transcription efficiency was calculated. Interestingly the dimeric pEGFP-N1 molecule mediated transgene expression with a 3.5-fold higher efficiency compared to its monomer. The bacteriophage Streptomyces phiC31 integrase is a promising tool to achieve safe and stable nonviral gene transfer, for the reason that it mediates site specific integration of pDNA into mammalian host genomes. To investigate the potential of the integrase to mediate stable gene transfer into hematopoietic cells, a variety of donor plasmids and integrase constructs were co-transfected. However this did not lead to enhanced long-term expression compared to control experiments. Only transfection of high amounts of integrase mRNA led to enhanced long-term expression. These data in hematopoietic cells are contrary to former findings in other tissues. An optimized assay was developed to further investigate the integrase activity in hematopoietic cells. Therefore, integrase-mediated recombination of episomal pDNA between wild-type attB and attP sites was determined in hematopoietic cells and cells of other tissues. Significantly reduced activity of the integrase in all investigated hematopoietic cells was observed by determination of integrase-mediated β-galactosidase activity and quantification of recombination products. To investigate this effect in further detail, additional experiments in A549 lung and Jurkat T cell lines were performed. Integrase-mediated transgene expression and recombination was determined in context with intranuclear integrase mRNA expression In independent experiments with different integrase construct, the phiC31 integrase efficacy was approximately 16-fold higher in A549 lung cells than in hematopoietic Jurkat cells. It has previously been published that the cellular protein DAXX interacts with the phiC31 integrase and inhibits its recombination efficiency. To investigate DAXX protein as a possible inhibitor of the integrase in hematopoietic cells, western blot analysis was performed. Higher levels of DAXX in hematopoietic cells might be one reason for this discrepancy. An alternative to integrating systems is the stable transfection of extrachromosomal pDNA. It has recently been published that episomal replication of pDNA can be achieved in hematopoietic cells by cloning a Scaffold Matrix Attachment Region (S/MAR) between transgene and polyA tail in the pDNA (Papapetrou et al., 2006). However, an initial selection with G418 for 2-3 weeks after transfection is necessary to mediate episomal replication and long-term transgene expression. To test the influence of the promoter in combination with the huINF β-S/MAR on the necessity of initial selection pressure, Ubiquitin C and Ubiquitin B promoter comprising constructs were transfected in vitro and in vivo. Both constructs mediated enhanced long-term transgene expression without application of G418-selection compared to the S /MAR-free plasmids. At different time points post transfection extrachromosomal S/MAR-comprising pDNA could be detected. Further, enhanced long-term expression of S/MAR comprising vectors for up to six months was found in lung and liver tissue in vivo. The in vivo effect of the S/MAR sequence rather seems to be a reduction of gene silencing. In conclusion, using a dimeric pDNA concatemer led to higher transgene expression per pDNA molecule compared to its monomer. phiC31 integrase mediated long-term transgene expression could not be achieved in hematopoietic cells presumably due to the interaction of the integrase with cellular DAXX protein. In contrast transfection of pDNA comprising Ubiquitin C or Ubiquitin B promoters and S/MAR led to enhanced transgene expression due to improved extrachromosomal persistence of these vectors.

Die Gentherapie stellt einen neuartigen und viel versprechenden Ansatz für die zukünftige Behandlung angeborener oder erworbener Krankheiten dar, bei denen herkömmliche Therapieformen bislang nur geringe Effizienz zeigen. Hierbei ist die Lunge im Hinblick auf viele akute und chronische Erkrankungen wie beispielsweise Zystischer Fibrose, Asthma oder Tumoren ein wichtiges Zielorgan. Eine therapeutische Anwendung der Gentherapie setzt den erfolgreichen Transfer der applizierten Nukleinsäure in die Zielzelle voraus. Transkription eines Gens kann nur dann erfolgen, wenn die DNA den Zellkern erreicht. Die momentan größte Herausforderung besteht somit in der technologischen Entwicklung geeigneter Gentransfervektoren. Derzeitige Gentransfersysteme lassen sich in virale und nichtvirale Methoden einteilen. Obwohl Viren bislang deutlich höhere Transfektionseffizienzen zeigen konnten, bergen sie aufgrund immunogener und mutagener Eigenschaften unkalkulierbare Risiken. Dies führte zur Entwicklung nichtviraler Systeme, welche eine weit sicherere Alternative darstellen. Innerhalb der kationischen Polymere stellt Polyethylenimin (PEI) ein effizientes nichtvirales Gentransferagens dar, welches bereits Gegenstand vieler Untersuchungen war. Nichtsdestotrotz konnte im Vergleich zu viralen Systemen noch keine ausreichend hohe Transfektionseffizienz, insbesondere bei in vivo Applikationen, erreicht werden. Zusätzlich besitzt PEI eine hohe Zytotoxizität. Die Modifikation kationischer Polymere mit zielgerichteten Liganden scheint vor diesem Hintergrund eine viel versprechende Methode zur Schaffung intelligenterer Systeme darzustellen. Dies ist insbesondere im Hinblick auf eine höhere Genexpression und Selektivität erstrebenswert. Verschiedenste Liganden wie zum Beispiel Transferrin, Folsäure oder EGF wurden bereits erfolgreich für den Rezeptor-vermittelten nichtviralen Gentransfer beschrieben. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung und Charakterisierung neuartiger zielgerichteter Gentransfersysteme auf der Basis von verzweigtem PEI. Verwendete Liganden waren dabei das Glykoprotein Lactoferrin, der Arzneistoff Clenbuterol und das Peptidhormon Insulin. Im Hinblick auf die spätere pulmonale in vivo Anwendung erfolgten die in vitro Untersuchungen bevorzugt mit Lungenzellen. Dabei wurden insbesondere Alveolarepithel- und Bronchialepithelzellen verwendet. Um das Potential eines Liganden abschätzen zu können, wurden zu Beginn jeder Studie in vitro Rezeptoruntersuchungen durchgeführt. Diese erfolgten durch Inkubation hergestellter Fluoreszenzfarbstoff-Ligand-Konjugate oder mittels Antikörper- basierter Methoden. Hierbei konnte beobachtet werden, dass Lactoferrin- Rezeptoren bevorzugt auf Bronchialepithelzellen exprimiert werden. Im Gegensatz dazu wurde eine hohe Anzahl von Rezeptoren für Clenbuterol und Insulin insbesondere auf Alveolarepithelzellen gefunden. Die Einbringung der Liganden in die Gentransferkomplexe erfolgte auf unterschiedlichen Wegen. Lactoferrin und Clenbuterol wurden jeweils durch biochemische Reaktionen kovalent an das PEI-Grundgerüst gekoppelt. Somit waren diese schon während der Komplexbildung mit Plasmid DNA anwesend. Im Gegensatz dazu wurde Insulin durch nichtkonvalente Adsorption aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen an die Oberfläche bereits komplexierter PEI/pDNA-Partikel gebunden. Für alle Komplexe wurden verschiedene molare Verhältnisse zwischen Polymer und Ligand hergestellt und untersucht. Bei der biophysikalischen Charakterisierung der Partikel konnte beobachtet werden, dass die Anwesenheit hoher Anteile der Liganden zu Komplexen mit einem größeren hydrodynamischen Durchmesser führte. Dies zeigte sich unabhängig von der Tatsache, auf welche Weise die Einführung des Liganden stattfand. Die Größenzunahme dürfte jedoch in unterschiedlichen Ursachen begründet sein. Während hohe Anteile kovalent an PEI gebundener Liganden (Lactoferrin bzw. Clenbuterol) wahrscheinlich die Komplexierung mit Plasmid-DNA stören, basiert ein Anstieg der Komplexgröße bei elektrostatischer Adsorption auf der Partikeloberfläche vermutlich auf einer Zunahme der Schichtdicke gebundenen Insulins. Diese Vermutungen wurden durch Messungen der Oberflächenladung der Polyplexe bestätigt. Die Adsorption von Insulin an der Oberfläche von PEI/pDNA-Komplexen führte zu einem drastischen Abfall des Zeta- Potentials bis hin zu negativen Werten, bei denen Aggregation der Partikel beobachtet werden konnte. Auch die Clenbuterol-Konjugation führte zu einer Reduzierung des Zeta-Potentials, welche jedoch deutlich schwächer ausgeprägt war. Im Gegensatz dazu resultierte die Kopplung von Lactoferrin diesbezüglich zu keiner relevanten Änderung. Gleichzeitig konnte mittels gelelektrophoretischer Untersuchungen jedoch gezeigt werden, dass in allen Fällen die Plasmid-DNA vollständig durch die Polymere komplexiert werden konnte. Bei in vitro Transfektionsstudien konnte für Lactoferrin-modifizierte Konjugate auf Bronchialepithelzellen ein Maximum der Genexpression bei einem Konjugationsverhältnis von 1 zu 20 zwischen Lactoferrin und PEI ermittelt werden. Dieses zeigte bei einem N/P-Verhältnis von 4 im Vergleich zu unmodifizierten PEI/pDNA-Partikeln eine signifikante 5-fache Steigerung der Transfektionseffizienz. Die Spezifität der Zunahme konnte durch Inhibierungsuntersuchungen mit einem Überschuss an Lactoferrin gezeigt werden. Auf Alveolarepithelzellen hingegen führte die Modifikation mit Lactoferrin zu keiner signifikanten Steigerung. In vivo Versuche zur Lunge wurden mittels Instillation und Vernebelung als Applikationsarten durchgeführt. Es konnte jedoch kein Vorteil der Genexpression durch die Lactoferrin-Modifizierung von PEI/pDNA-Komplexen beobachtet werden. Hier bleibt zu klären, inwiefern Lactoferrin in vivo strukturell erhalten bleibt und ob die verwendete Lactoferrin-Spezies eine Rolle spielt. Verschiedene Anteile an Clenbuterol wurden in die Transfektionskomplexe durch Herstellung von Mischungen aus PEI-g-Clen mit unmodifiziertem PEI eingeführt. Die höchste in vitro Gentransfereffizienz zeigte eine molare Zusammensetzung von 1,3 Clenbuterol- Liganden pro Molekül Polyethylenimin, welche bei einem N/P-Verhältnis von 8 im Vergleich zu PEI/pDNA-Polyplexen in einem signifikanten 14-fachen Anstieg der Luziferaseexpression resultierte. Dieser Vorteil war über einen weiten N/P-Bereich von 6-20 erkennbar. Der Abfall der Genexpression durch Zugabe eines Überschusses an freiem Clenbuterol ließ auf einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus schließen. Die Clenbuterol-Modifikation der Gentransferpartikel führte auf zwei weiteren Zelllinien (murines Alveolarepithel, humanes Zervixkarzinom) ebenfalls zu einer signifikanten Steigerung der Transfektionseffizienz, wohingegen auf Bronchialepithelzellen kein Effekt festgestellt werden konnte. Diese Ergebnisse korrelierten mit der beta2-Rezeptorendichte auf den jeweiligen Zelllinien. In vivo Untersuchungen mit Clenbuterol als Ligand wurden auf drei verschiedenen Applikationswegen durchgeführt. Während bei der Instillation kein Unterschied zwischen den Gruppen erkennbar war, führte die Modifikation von PEI/pDNA-Partikeln mit Clenbuterol nach Vernebelung zu einem 1,6-fachen und nach intravenöser Applikation zu einem signifikanten 2,7-fachen Anstieg der Genexpression innerhalb der Lunge. Quantitative Bestimmungen im Lungengewebe mittels Real Time PCR zeigten, dass in diesen Fällen Clenbuterol-modifizierte Konjugate in der Lage waren, mehr Plasmid-DNA in das Zielgewebe zu transportieren. Bei der Auswertung des Verhältnisses von Genexpression und Plasmid-Menge innerhalb des Lungenhomogenisates konnte festgestellt werden, dass die Vernebelung die mit Abstand höchste Effektivität besitzt. Diese zeigte, bezogen auf die deponierte Menge an Plasmid-DNA, gegenüber der intravenösen Applikation eine etwa 110-fache und gegenüber der Instillation eine etwa 350-fache Steigerung der Luziferaseexpression. Unabhängig davon konnte mittels eines in vitro Versuches gezeigt werden, dass die Vernebelungsprozedur zu keiner Zerstörung komplexierter Plasmid-DNA führte, wohingegen unkomplexierte Plasmid-DNA den Scherkräften der Vernebelungskammer ausgesetzt war und dabei Schaden nahm. Die Oberflächenmodikation mit Insulin führte bei PEI/pDNA-Komplexen zu einer Steigerung der in vitro Transfektionseffizienz auf Alveolarepithel-, jedoch nicht auf Bronchialepithelzellen. Ein Verhältnis von 5 µg Insulin pro µg Plasmid-DNA resultierte in einem Maximum mit einer im Vergleich zu unmodifizierten PEI/pDNA-Partikeln 16-fach höheren Luziferaseexpression. Untersuchungen mittels Koinkubation freien Insulins zeigten, dass die Zunahme nicht auf proliferative Effekte des Liganden zurückzuführen war. Des Weiteren konnte die Notwendigkeit der Anwesenheit von verzweigtem Polyethylenimin gezeigt werden, nachdem die Addition von Insulin bei Verwendung von linearem PEI zu keiner Erhöhung der Genexpression führte. Insgesamt spielt auch die Toxizität der Gentransferkomplexe eine wichtige Rolle im Hinblick auf die spätere klinische Applikation. PEI ist als toxisches Gentransferagens bekannt. Hohe Toxizität des Polymers wurde bereits mehrfach in vitro, wie auch in vivo berichtet. Es konnte für alle drei Liganden demonstriert werden, dass durch deren Einführung in PEI/pDNA-Komplexe die in vitro Toxizität, evaluiert durch die metabolische Zellaktivität, signifikant gesenkt werden konnte. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass Lactoferrin, Clenbuterol und Insulin als zielgerichtete Liganden geeignet sind, in Verbindung mit verzweigtem Polyethylenimin intelligentere Systeme für den Gentransfer in die Lunge zu bilden. Diese zeichnen sich insbesondere durch ihre höhere Genexpression, durch selektive Unterscheidung zwischen Alveolar- und Bronchialepithel und durch geringere Toxizität aus., Gene therapy represents a novel and attractive approach for the future treatment of inherited or acquired diseases, where conventional clinical procedures have poor efficacy. The lungs are an important target organ for gene therapeutic intervention with respect to many acute and chronic diseases like cystic fibrosis, asthma and cancer. Therapeutic implementation of gene therapy requires the successful transfer of the applied nucleic acid into the target cell. Transgene expression results only when the DNA is transported into the cell nucleus. Presently, the greatest obstacle revolves around the engineering of appropriate gene delivery systems. Current gene delivery systems can be divided into viral and nonviral methods. Although viruses show much higher transfection efficiencies so far, their usage is limited due to safety concerns, such as immunogenicity and integration into the host genome. This has stimulated efforts into the development of nonviral systems, which represent a more safe alternative. Among cationic polymers, polyethylenimine (PEI) is an effective nonviral gene transfer agent and has already been subject of many investigations. Nevertheless, it shows relatively low transfection efficiency compared to viral systems, in particular for in vivo applications. In addition, PEI exhibits a high cytotoxicity. The modification of cationic polymers with targeting ligands seems to be a promising method to create more efficient systems, in particular with respect to both higher gene expression and selectivity. Numerous ligands have already been evaluated for nonviral receptor-mediated gene delivery, like transferrin, folic acid or EGF (see CHAPTER 1.5). The current work was aimed at the development and characterization of novel targeted gene transfer systems. Therefore, the glycoprotein lactoferrin, the chemical drug clenbuterol and the peptide hormone insulin were used to modify branched polyethylenimine. With regard to the pulmonary in vivo application, all in vitro investigations were preferentially performed on lung cells, in particular alveolar epithelial and bronchial epithelial cells. To evaluate the potential of a targeting ligand, initial in vitro receptor investigations were performed. For this purpose, cells were incubated with fluorescently labelled specific ligands or antibodies. It could be seen that lactoferrin receptors were predominantly expressed on bronchial epithelial cells, while in contrast, a high number of receptors for clenbuterol and insulin were found particularly on alveolar epithelial cells. Introduction of the ligands to the gene transfer complexes was performed in different ways. Lactoferrin as well as clenbuterol were conjugated through biochemical reactions to the PEI backbone. As a result of this, they were already present during complexation process with plasmid DNA. In contrast to that, insulin was bound to the surface of already complexed PEI/pDNA particles due to electrostatic adsorption. For all complexes, numerous molar ratios between polymer and ligand were evaluated. Biophysical characterization of the particles showed that the presence of high ratios of ligand to polymer resulted in complexes with larger hydrodynamic diameters, independently of the method used for introducing the targeting ligand. This increase of size could be due to different reasons. Whereas high ratios of ligands covalently attached to PEI (lactoferrin or clenbuterol) may interfere with the complexation to plasmid DNA, the increase of complex size for electrostatic adsorption on the particle surface may probably be due to greater coating thickness of the bound insulin. These assumptions were further confirmed by surface charge measurements of the polyplexes. Adsorption of insulin to the surface of PEI/pDNA complexes led to a strong decrease of zeta potential to negative values, concomitant with particle aggregation. Conjugation of clenbuterol also resulted in reduction of zeta potential, but only with lower impact. In contrast, coupling of lactoferrin did not result in any relevant changes. At the same time, gel retardation assays showed that plasmid DNA was successfully complexed by all polymers, irrespective of the formulation. In vitro transfection studies with lactoferrin-modified conjugates on bronchial epithelial cells showed a maximum of gene expression for a lactoferrin to PEI ratio of 1:20. Using a N/P ratio of 4, a significant increase in transfection efficiency compared to unmodified PEI/pDNA particles was observed. Specificity could be demonstrated in inhibition experiments with an excess of free lactoferrin. In contrast, modification with lactoferrin had no effect on alveolar epithelial cells. In vivo experiments were performed in mice via nasal instillation and aerosol application. However, with respect to gene expression, no benefit could be demonstrated by the modification of PEI/pDNA complexes with lactoferrin. Further studies will be necessary to address the questions, if the structure of lactoferrin stays intact in vivo and if the used lactoferrin species also plays an important role. Different amounts of clenbuterol were introduced into transfection complexes by mixing PEI g Clen with unmodified PEI. Highest in vitro gene expression efficiency was obtained with a molar composition of 1.3 clenbuterol ligands per molecule of PEI, which showed a significant 14-fold increase in luciferase expression compared to PEI/pDNA polyplexes at a N/P-ratio of 8. This could be demonstrated over a wide range of N/P-ratios from 6 to 20. After addition of an excess of free clenbuterol gene expression decreased, which indicated a receptor-mediated mechanism. Significant benefit of clenbuterol-modification could also be shown on two additional cell lines (murine alveolar epithelial, human cervix carcinoma), whereas no effect was seen on bronchial epithelial cells. These results correlated well with the density of beta2-receptors on respective cell lines. In vivo experiments in mice with clenbuterol as a targeting ligand were performed via three different application routes. Whereas no difference in gene expression within the lungs of mice was seen after nasal instillation, modification of PEI/pDNA particles with clenbuterol resulted in a 1.6-fold increase after aerosol delivery and a significant 2.7-fold increase following intravenous injection of complexes. Quantitative Real Time PCR measurements of lung tissue showed that clenbuterol-modified conjugates were able to transport a higher amount of plasmid-DNA into the target tissue. Calculating the ratio of gene expression versus the amount of quantified plasmid-DNA, aerosol delivery was identified to have the highest efficiency. Related to the deposited amount of plasmid-DNA, aerosol delivery showed a 110-fold increase of luciferase expression compared to intravenous application and a 350-fold increase compared to instillation. In addition, it could be demonstrated that aerosolisation procedure did not cause any damage to the complexed plasmid-DNA, whereas uncomplexed plasmid DNA was exposed to the shearing forces of the aerosolisation chamber and thus destroyed. Surface modification of PEI/pDNA complexes with insulin resulted in an increase of in vitro transfection efficiency on alveolar, but not on bronchial epithelial cells. A ratio of 5 µg insulin per µg of plasmid-DNA resulted in a maximum, showing a 16-fold higher luciferase expression compared to unmodified PEI/pDNA particles. Coincubation experiments with free insulin revealed that the increased expression was not caused by proliferative influences of the ligand. Furthermore, it could be demonstrated that this effect was polymer-specific. Addition of insulin in combination with linear PEI did not result in increased gene expression. Toxicity of gene transfer complexes also plays a major role with regard to their later clinical applications. PEI is known as a toxic gene transfer agent. High toxicity has been reported in several studies both in vitro and in vivo. It could be demonstrated for all three ligands, that after their introduction to PEI/pDNA complexes, in vitro toxicity, evaluated by measurements of the metabolic cell activity, was significantly reduced. In summary, this work demonstrates that lactoferrin, clenbuterol and insulin represent suitable targeting ligands, which form with branched polyethylenimine efficient nanoparticulate systems for successful gene transfer to the lung. Additionally, these complexes have the desired attributes of higher gene expression, lower toxicity and targeted delivery to alveolar or bronchial epithelial cells.

Eine mögliche Strategie des Gentransfers in die Lunge ist die Verwendung von PEI-pDNA Komplexen, die als Aerosol oder via intranasaler Instillation appliziert werden können. In dieser Arbeit wurden mehrere Ansätze verfolgt, um den nichtviralen Gentransfer in Lungengewebe zu verbessern und die Kinetik der Genexpression sowie die Auswirkung auf die Lungenfunktion zu bestimmen. Nach intranasaler Instillation von PEI-pDNA Komplexen in Mäuse war die pDNA- Clearance aus dem Lungengewebe um das 3,5-fache höher als nach Aerosolapplikation. Eine Luziferaseexpression als Zeichen eines erfolgreichen Gentransfers konnte nach intranasaler Instillation nur kurzfristig 24 h nach der Behandlung detektiert werden. Nach Aerosolapplikation war die Luziferaseexpression nach 72 h am höchsten und blieb bis zum letzten gemessenen Zeitpunkt (7 Tage) konstant. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der geringeren Clearance nach Aerosolapplikation. Die Luziferaseexpression konnte nach Aerosolapplikation von CpG-freier pDNA weiter gesteigert werden. Bezüglich der Lungenfunktion fand sich sowohl nach Aerosolapplikation als auch nach intranasaler Instillation von PEI-pDNA z.B. eine erniedrigte Compliance der Lunge, was möglicherweise auf eine durch die Behandlung ausgelöste Entzündungsreaktion zurückzuführen ist. Diese zeigte sich auch in histologischen Untersuchungen der Mauslungen. Wurde statt der CpG-haltigen pDNA CpG-freie pDNA vernebelt, war die Lungenfunktion weniger eingeschränkt und es zeigte sich keine Veränderung der Lungenhistologie. In dieser Arbeit wurde außerdem untersucht, ob die pDNA mittels magnetischer Ablenkung gezielt an den Ort einer möglichen Erkrankung in der Lunge gelenkt werden kann. Dazu wurden PEI-pDNA Komplexe zusammen mit SPION formuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die magnetische Ablenkung von SPION in der Mauslunge funktioniert und zu einer gezielten, erhöhten Deposition von pDNA führt. Die Lungenfunktion wird durch die Verwendung von SPION dabei nicht zusätzlich eingeschränkt. Eine neue Methode zur Steigerung der Gentransfereffizienz wurde etabliert, die auf der Verwendung des Glucocorticoidrezeptors (GR) als Transkriptionsfaktor beruht. Wird GR durch Dexamethason aktiviert, führt dies zu einem Transport des GR aus dem Zytoplasma in den Zellkern einer Zelle. Wird vorher pDNA, die Glucocorticoidrezeptor-responsive Elemente enthält (GRE), an GR gebunden, kann der Transfer von pDNA aus dem Zytoplasma in den Zellkern verbessert werden. In in vivo Versuchen, in denen PEI-pDNA mittels Aerosol im Mausmodel appliziert wurde, konnte eine verbesserte Genexpression (4,7-fach) nach Gabe von pEGFPLucGRE2 im Vergleich zu pEGFPLuc nachgewiesen werden, wenn 2 h nach der Aerosolapplikation Dexamethason intraperitoneal appliziert wurde. Eine Herausforderung in der Zukunft wird sein, die Methode der Aerosolapplikation von Gentransferkomplexen auf ein Großtiermodel und letztendlich auf Patienten zu übertragen und zu optimieren. Insbesondere sollte dabei CpG-freie DNA verwendet werden, da sich dadurch die Verträglichkeit und die Gentransfereffizienz verbessern lassen., One strategy of gene transfer to the lung is to use PEI-pDNA complexes, which can be applied via aerosol or intranasal instillation. In this work different strategies were followed to enhance nonviral gene transfer into mice lungs and to improve the kinetic of gene expression. Additionally, the influence of gene transfer on lung function of mice was determined. The pDNA-clearance out of lungs was 3.5-times higher after intranasal instillation of PEI-pDNA complexes to mice compared to the clearance after aerosol application. Luciferase expression as a sign for effective gene transfer was observed only 24 h after intranasal instillation. After aerosol application, the highest expression rate was detected after 72 h and remained at high levels up to day seven. This result is consistent with the lower clearance rate after aerosol application. Luciferase expression could be further enhanced in experiments, which used CpG-depleted pDNA for aerosol gene delivery. Concerning lung function parameters, compliance of lungs was reduced after intranasal instillation as well as after aerosol application. This may be due to an inflammatory effect caused by the treatment with PEI-pDNA complexes. This was also observed in histological examinations and may be caused by CpG motives in the pDNA used for the treatment. After aerosol application of CpG-depleted PEI-pDNA complexes, lung function of mice was less impaired and histology of mice lungs was not changed compared to untreated control mice. Hence, the usage of CpG- depleted pDNA also resulted in improved lung function parameters, beside increased gene expression levels. To further improve gene delivery into the lung the targeted aerosol delivery to the lung with aerosol droplets comprising superparamagnetic iron oxid nanoparticles (SPION) – so called nanomagnetosols – in combination with a target directed magnetic gradient field was examined. PEI-pDNA complexes were formulated together with SPION. It was shown, that magnetic deflection of SPION in mice lungs was possible and a targeted and increased deposition of pDNA was achieved. Lung function was not deteriorated additionally by the usage of SPION. Furthermore, in this work a new method to increase gene transfer efficiency was established, which is based on the usage of the glucocorticoid receptor (GR) as transcription factor. After activation of GR by dexamethasone, GR is transported from the cytoplasm into the nucleus of a cell. pDNA containing a glucocorticoid responsive element (GRE) can bind to GR in the cytoplasm. Therefore, binding of the GR to its GRE and activation by its ligand (dexamethasone) can be used for the active transport of pDNA from the cytoplasm into the nucleus. In in vivo experiments PEI-pDNA complexes were applied to mice via aerosol. After application of pEGFPLucGRE2 gene expression increased about 4.7-times compared to pEGFPLuc, if dexamethasone was injected intraperitoneally 2 h after aerosol application. One challenge in the future will be to transfer the method of aerosol application of gene transfer complexes to a big animal model and finally to patients and to optimize these methods. In particular, CpG-depleted pDNA should be used because tolerance and gene transfer efficiency are increased.

Die vorliegende Arbeit zeigt am Beispiel von C17.2 NS Zellen, die CD1 Mäusen im Alter von 19 bis 100 Tagen über eine laterale Schwanzvene verabreicht worden waren, die Möglichkeit des Gentransfers ins ZNS auf. Anhand des lacZ-Reportergens und seiner Genprodukte konnten injizierte NS Zellen im gesamten Untersuchungszeitraum von 2 bis 38 Tagen nach der i.v. Injektion im murinen Gehirn wiedergefunden werden. Der Nachweis der injizierten Zellen erfolgte mittels X-Gal-Färbung, PCR Amplifikation und Western Blot Analysen. Durch eine Inhalationsanästhesie mit Diethyläther konnte die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke und somit die Migrationsrate der i.v. injizierten Zellen ins ZNS erhöht werden. Der Transplantationserfolg war unabhängig von der Anzahl der injizierten Zellen und vom Geschlecht der Rezipienten-Mäuse. Es fielen signifikant erniedrigte Nachweisraten für die i.v. injizierten Zellen am Tag 14 nach i.v. Injektion sowie bei der Gruppe der 26 bis 28 Tage alten Versuchstiere auf. Diese signifikant erniedrigten Nachweisraten konnten bei einer kritischen Betrachtung der vorliegenden Arbeit durch den Versuchsaufbau erklärt werden und weisen auf Schwachpunkte beim experimentellen Aufbau und der Durchführung der Analysen hin. Aufgrund der geringen Gesamtzahl an Versuchstieren (n = 96) ergab sich eine Abhängigkeit der verschiedenen untersuchten Parameter und somit eine nur beschränkte Aussagekraft der statistischen Untersuchungen. Bei den durchgeführten Analysen wurde die regionale Verteilung der nach i.v. Injektion in die zentralnervöse Substanz integrierten C17.2 NS Zellen berücksichtigt. Es ergab sich eine Verteilung der Zellen auf die kortikalen, oberflächlichen Abschnitte von Großhirn, Kleinhirn und Hirnstamm. Verglichen mit den Organen Lunge und Milz des murinen Organismus und dem Verweilen im Blut war der Nachweis der i.v. injizierten Zellen im ZNS erhöht. In einem in vitro Modell konnte anhand von Proteinextrakten aus dem murinen ZNS eine erhöhte Affinität von C17.2 NS Zellen zu zentralnervösem Gewebe nachgewiesen werden. Zusammenfassend konnte die vorliegende Studie am Beispiel der C17.2 NS Zellen zeigen, dass eine Integration transplantierter NS Zellen in die zentralnervöse Zytoarchitektur möglich ist. Hierbei stellt die i.v. Injektion eine einfache und effektive Methode der Transplantation dar. Durch genetische Modifikation der i.v. verabreichten Zellen wird der Transfer fremder Gene in das Gehirn möglich, was künftig im Rahmen der ZNS Pathogenese von therapeutischer und wissenschaftlicher Relevanz sein dürfte. C17.2 neural stem cells (NS cells) were detected in murine brains 2 to 38 days after intravenous (i.v.) injection via the lateral tail vein of 19 to 100 days old mice. The NS cells were marked by the lacZ reporter gene. They were detected in X-Gal stained whole mounts of murine brains, by western blot analysis of murine brain lysates and by PCR amplification of DNA isolated from murine brains. Migration of i.v. injected NS cells into the brain was increased in animals treated with diethylether. The number of injected cells or the sex of the recipient mice had no influence on transplantation efficiency. A significant decrease of migration of i.v. injected cells into the brain was seen on day 14 after injection. The same effect was shown in the group of 26 to 28 days old recipients. Both are circumstantial effects and are a result of experimental conditions and performance of the analyses. The small number of experimental animals (n = 96) caused an interdependence of different investigated parameters. The reliability of statistical calculations was limited. I.v. injected C17.2 NS cells were detected in the cerebrum, the cerebellum and the brain stem of investigated brains. They were localised in the superficial, cortical areas of the CNS. In comparison to tissue from lung or spleen or the blood of the recipients detection of i.v. injected NS cells was significantly higher in brain tissue. The increased affinity of C17.2 NS cells to CNS tissue was confirmed in an in vitro model with protein extracts from murine brains. This study shows that i.v. injected NS cells migrate from the blood into the CNS. I.v. injection was confirmed to be an easy and efficient way for transplantation into the CNS. By genetic modification of injected cells gene delivery into the brain becomes possible. Therefore this model could offer new strategies for science and therapy of CNS pathologies.