Search

Diese Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen ionischer Flüssigkeiten (ILs) auf die Resistenzentwicklung gegenüber das Antibiotikum Ciprofloxacin (CIP) bei Escherichia coli (E. coli). Dabei wurden fünf ILs mit CIP modifiziert, um aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe-ILs (API-ILs) zu bilden und die unterschiedlichen Stärken der antimikrobiellen Eigenschaften der ILs zu verbessern. In diesem Fall ist CIP das Anion und die ILs sind das Kation der API-ILs. Zum einen soll herausgefunden werden, ob die fünf API-ILs die Resistenzentwicklung von E. coli MG1655 beeinflussen und falls dies der Fall ist, wie schnell dies geschehen kann. Zum anderen soll die minimale Hemmkonzentrationen vor und nach der experimentellen Evolution verglichen werden, um mögliche Resistenzentwicklung bei den verwendeten Wirkstoffen zu ermitteln. Die Resistenzentwicklung wurde anhand verschiedener Assays bestimmt. Methode: Die experimentelle Evolution stellt die Hauptmethode dieser Arbeit dar. Hier wurden die Bakterien sechs aufeinanderfolgenden Tagen in flüssigen Luria-Bertani-Medium (LB) mit den jeweiligen Wirkstoffen (CIP und API-ILs) in unterschiedlichen Konzentrationen passagiert. Um die Konzentrationen zu bestimmen, wurde die minimale Hemmkonzentration (MHK) vor der experimentellen Evolution bestimmt. Diese MHK wurde dann mit der nach der experimentellen Evolution bestimmten MHK verglichen. Anschließend wurde eine zweitägige Stabilitätspassage durchgeführt, um sicherzustellen, dass die während der experimentellen Evolution beobachteten Veränderungen stabil waren. Ergebnisse: CIP zeigte bei drei von fünf E. coli-Subkulturen erwartungsgemäß innerhalb einer kurzen Zeitspanne von vier Tagen Resistenzen. Hingegen dauerte es bei einigen Subkulturen, die mit API-ILs behandelt wurden, etwas länger, bis sie Resistenzen zeigten. Drei API-ILs, nämlich API-IL2, API-IL3 und API-IL4, wirkten stark antimikrobiell und hemmten bzw. unterdrückten das Wachstum von vier – von insgesamt fünf – Subkulturen. Die beiden anderen API-ILs (API-IL1 und API-IL5) waren in der Lage, auf zwei von fünf Subkulturen eine hemmende Wirkung auszuüben. Zudem wiesen die MHKs vor und nach der experimentellen Evolution Unterschiede auf, die die Entstehung einer Resistenz bestätigen. Conclusio: Diese Studie zeigt, dass die Resistenzentwicklung von Bakterien durch die Wahl des Kations in API-ILs beeinflusst werden kann. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Eigenschaften des Kations eine wichtige Rolle bei der Modulation der antimikrobiellen Aktivität von ILs spielen und somit auch die Resistenzentwicklung bei Bakterien beeinflussen können. Obwohl die vorliegende Studie erste Hinweise darauf liefert, dass die Struktur von ILs die Resistenzentwicklung bei Bakterien beeinflussen kann, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diese Ergebnisse zu bestätigen. Insbesondere müssen künftige Studien eine größere Anzahl von Proben und verschiedene Selektionsregime umfassen, um die statische Signifikanz dieser Beobachtung zu bestätigen. This thesis focuses on the effects of ionic liquids (ILs) on resistance development to the antibiotic ciprofloxacin (CIP) in Escherichia coli (E. coli). Thereby, five ILs were modified with CIP to form active pharmaceutical ingredient-ILs (API-ILs) and improve different levels of antimicrobial properties of the ILs. The anion of API-ILs was CIP, which was paired with different cations of ILs in the experiment. The first goal was to find out whether the five API-ILs affect the resistance development of E. coli MG1655 and to assess the rate at which this phenomenon occurs. The second goal was to compare the minimum inhibitory concentration (MIC) before and after experimental evolution, to determine possible resistance development with the APIs used. Resistance development was determined using different assays. Methods: Experimental evolution is the main method used in this work. The bacteria here were passaged for six consecutive days in Luria-Bertani (LB) medium, containing the respective agents (CIP and API-ILs) at different concentration. To determine the concentrations, the MIC was determined prior to experimental evolution. This MIC was then compared to the MIC determined after experimental evolution. A two-day stability passage was then performed to ensure that the changes, observed in E. coli during experimental evolution, were stable. Results: CIP showed resistance in three of five E. coli subcultures within a short period of four days, as expected. In contrast some subcultures treated with API-ILs have been observed to exhibit a slightly delayed outset of resistance. Three API-ILs, namely API-IL2, API-IL3, and API-IL4, had strong antimicrobial effects and inhibited or suppressed the growth of four – out of a total of five – subcultures. The other two API-ILs (API-IL1 and API-IL5) were able to exert an inhibitory effect on two of five subcultures. Moreover, the MICs before and after experimental evolution showed difference confirming the emergence of resistance. Conclusion: This study demonstrates that the development of resistance in bacteria can be influenced by the choice of cation in API-ILs. The results suggest that the properties of the cation play an important role in modeling the antimicrobial activity of ILs and thus may also influence the development of resistance in bacteria. Although the present study provides preliminary evidence that the structure of ILs may influence resistance development in bacteria, further studies are needed to confirm these results. In particular, future studies will need to include a larger number of samples and different selection regimes to confirm the static significance of this observation.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Anwendung des Gammamodells zur Modellierung des Keimwachstums mittels Microsoft Excel zur Berechnung. Zu diesem Zweck wurden die Probleme mit dem bestehenden Model für die Sterilisation untersucht und anschließend das Model adaptiert zur Vorhersage des Keimwachstums. Es werden verschiedene Fälle von Wachstumskurven betrachtet und Aussagen für die notwendige Keimzahl, Dauer der Fermentation und an Anzahl der Daten um eine gute Vorhersage zu treffen getätigt. Weiters beinhaltend diese Arbeit ein Formular für Excel zur einfachen Anwendung des Modells auf Datensätze mit bis zu 500 Datenpunkten und geht auf eventuell auftretende Probleme bei der Anwendung auf spezifische Formen von Wachstumskurven ein. Schlussendlich wird das Model in der Praxisanwendung getestet und die Unterschiede zwischen der theoretischen Analyse von Datensets und der Praxisanwendung betrachtet. This thesis deals with the application of the gamma model to model the growth of microorganisms while using Microsoft Excel for the calculation. For this purpose the problems with the existing model for sterilisation have been examined and the model adapted afterwards. Different cases of growth curves are examined to gather information about the amount of microorganisms, the length of the fermentation and the necessary amount of data points to create a good prognosis. It also includes a standard form for the easy application of the model for data sets with up to 500 data points and deals with problems that might occur when dealing with specific cases of growth curves. Finally it is tested in practical application and considers the differences between the theoretical analysis of data sets and the real application. vorgelegt von: Philipp Krebernik Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2014

In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine molekulare Analyse des RCMV CD200-Homologes (vCD200). Die Entdeckung und Charakterisierung viraler Homologe zu zellulären Genen ist sowohl aus humanmedizinischer als auch veterinärmedizinischer Sicht ein wichtiger Aspekt der virologischen Forschung. Dies trifft insbesondere dann zu, wenn virale Proteine immunmodulatorische Eigenschaften besitzen. Die Beschreibung gerade solcher Mechanismen verbessert das Verständnis der Virus-Wirt-Interaktion und stellt eine Grundlage für die Entwicklung neuer antiviraler Substanzen dar. Voraussetzung solcher Untersuchungen in vivo ist das Vorhandensein eines Modellsystems, wozu in der vorliegenden Arbeit das RCMV genutzt wurde, sowie eine Vielzahl virologischer und immunologischer Werkzeuge für eine umfangreiche Genanalyse. Das RCMV CD200-Homolog (vCD200) bindet an einen inhibitorischen Rezeptor (CD200R), der auf Makrophagen exprimiert wird. Bereits untersuchte virale CD200-Homologe führten zur Formulierung einer Hypothese: nach Infektion von Zellen mit RCMV führt die Bindung des vCD200 an den CD200R zu einer verminderten Aktivierung von Makrophagen und damit zu einer geringeren Produktion des Enzyms iNOS innerhalb dieser Zellen. Dies resultiert in einer verminderten NO-Ausschüttung durch die Makrophagen, und somit einer verringerten Entzündungsreaktion im umliegenden Gewebe. Infolgedessen wird die Replikation der Viren durch verminderte inflammatorische Stimuli im Gewebe erleichtert.Im ersten Teil der Arbeit wurde eine RCMV CD200-Revertante (RCMV-revCD200) zur bereits bestehenden RCMV CD200-Deletionsmutante (RCMV-ΔCD200) des RCMV-E Wildtyp-Virus (RCMV-wt) hergestellt. Diese wurde in vitro charakterisiert und wies die gleichen Eigenschaften wie RCMV-wt auf. Alle drei Viren zeigten auf Rattenembryofibroblasten (REF) vergleichbare Wachstumseigenschaften. Im Anschluss wurden Lysate einer REF/Makrophagen co-Kultur mithilfe des Western Blot untersucht. Dazu wurden zunächst REF mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert, und 24 h später die gleiche Anzahl Makrophagen zu den infizierten REF gegeben. Weitere 24 h später wurden die Lysate aus dem Zellgemisch gewonnen. Das Lysat der co-Kultur, die mit RCMV-ΔCD200 infiziert worden war, zeigte, entsprechend der Hypothese, eine dezent höhere iNOS- Expression im Vergleich zu den anderen Lysaten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Methoden (TaqMan-PCR und Durchflusszytometrie) zum Nachweis und zur Quantifizierung der Gene CD200, vCD200, CD200R und iNOS etabliert. Es wurde Gewebematerial (peritoneale Exsudatzellen und Milz) aus Ratten, die mit den Viren RCMV-wt, RCMV-revCD200 und RCMV-ΔCD200 infiziert worden waren, ex vivo untersucht. Entgegen der in der Hypothese formulierten Annahme zeigten die peritonealen Exsudatzellen von Tieren, die mit RCMV-wt oder RCMV-revCD200 infiziert worden waren, im Vergleich zu den Zellen von Tieren, die mit RCMV- ΔCD200 infiziert worden waren, keine verringerte iNOS-Produktion. Das gleiche gilt auch für die Untersuchungen der Milz der Tiere. Eine Transkription der Gene vCD200, CD200 und CD200R konnte in den untersuchten Geweben nachgewiesen werden. Durch Quantifizierung des Virushüllproteins Glykoprotein B konnte eine vergleichbare Viruslast aller infizierten Tiere zwei und sechs Tage nach Infektion gezeigt werden. Mithilfe der Virustitration konnte zwei Tage nach Infektion Virus in der Milz und Leber infizierter Tiere nachgewiesen werden. Einen überraschenden Befund stellte die im Rahmen einer immunhistochemischen Färbung durchgeführte Betrachtung der Expression der MHC-Klasse-II-Moleküle in der Milz der Tiere dar. Die Milz-Schnitte zeigten, dass alle mit RCMV-ΔCD200 infizierten Tiere eine deutlich stärkere Expression von MHC-Klasse-II- Molekülen aufwiesen, als mock-infizierte oder mit RCMV-wt und RCMV-revCD200 infizierte Tiere., The aim of the presented work was to accomplish a functional analysis of the RCMV CD200- homologue (vCD200). The better understanding of viral homologues leads to a better understanding of the virus-host-interactions which opens new possibilities to develop efficient drugs. The premise for an in-vivo analysis is the existence of an animal model which is given here by RCMV. vCD200 binds to an inhibitory receptor (CD200R) that is mainly expressed on myeloid cells, e.g.macrophages. Myeloid cells can be regulated through cell-cell interactions that are triggered by matched sets of activating of inhibitory receptors. The results of other studies that proved an inhibitory role for other, already better known, viral CD200-homologues lead to forming a hypothesis about the function of the RCMV CD200-homologue: The interaction between vCD200 and the CD200R leads to an inhibitory effect within the macrophage resulting in less production of the enzyme iNOS. This means less generation of NO in the surrounding tissues finally resulting in less inflammation. Gaining a gene that mediates a function like that is of huge benefit for the virus because less inflammation in tissues surrounded by virus infected cells means easier replication for the virus within its host. In the first part of the presented work a recombinant virus (RCMV-revCD200) of the already existing RCMV CD200 deletion mutant (RCMV-ΔCD200) was produced via co-transfection and tested in vitro. RCMV-revCD200 and RCMV-ΔCD200 were compared with the RCMV wildtype virus (RCMV-wt) and it was shown that all three viruses had the same replicationabilities in vitro. Afterwards a cell co-culture of macrophages and fibroblastic cells were infected with the three viruses (RCMV-wt, RCMV- revCD200, RCMV-ΔCD200) and iNOS expression was investigated in western blot. According to the hypothesis, the cells of the co-culture that was infected with RCMV-ΔCD200 showed a slightly higher expression of iNOS. In the second part of the presented work tissues from animals infected with RCMV-wt, RCMV- revCD200, RCMV-ΔCD200 were investigated with methods that allow a quantification of the results found in the in vitro studies. To accomplish this quantitative experiments were established such as fluorescence activated cell sorting (FACS) and TaqMan-PCR. Macrophages gained from the peritoneum of the animals were examined for iNOSproduction in FACS and TaqMan-PCR. Additionally the expression of the genes vCD200, CD200, CD200R and iNOS were analysed in the peritoneal cells as well as in the spleen of the animals. A result of lower expression of iNOS in the macrophages of those animals infected with RCMV-wt or RCMV-revCD200 in comparison with RCMV-ΔCD200 could not be found in the presented work. The transcription of the genes playing a role in the inhibition of the macrophages: vCD200, CD200 and CD200R could be detected in the investigated tissues of the animals. All animals got tested for expression of gB and it could be shown that all animals that were infected with the viruses were equally positive for gB expression.Virus was detected with plaque assay in both liver and spleen of infected animals two days after infection. A surprising finding could be obtained in an immune histochemical staining of the spleens for the MHC-class-II-molecule. This glycoprotein plays an important role within the antigen presentation of body-foreign peptide fragments towards CD4+ T-cells. These cells then activate other cells of the immune systems which can lead to an elimination of the pathogen. In the spleens of uninfected animals or those animals infected with the RCMV-wt or RCMVrevCD200 compared to those animals infected with RCMV-ΔCD200 showed less expression of MCH class-II molecules.

Superfetation (SF) ist die erneute Konzeption während bereits bestehender Trächtigkeit. Dieses Phänomen wird für den EFH schon lange vermutet. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich im Rahmen eines experimentellen Ansatzes in einer Zuchtpopulation (Feldforschungsstation des IZW) mit der Frage der Existenz der SF und seiner Funktionsweise. Die Fragestellung entwickelte sich als Fortsetzung einer Studie des IZW zur Reproduktionsfähigkeit von freilebenden EFH in Nordrhein-Westfalen. Insgesamt wurden 663 bzw. 163 Untersuchungen an 55 verschiedenen weiblichen bzw. 34 männlichen Individuen durchgeführt. Dabei wurden 159 Trächtigkeiten in 45 Häsinnen diagnostiziert und ausgewertet. Die Datenaufnahme erstreckte sich über drei vollständige Zuchtsaisonzyklen. Die Ergebnisse und Schlussfolgerungen der Studie lassen sich wie folgt darstellen: 1\. Charakterisierung der pränatalen Entwicklung des EFH: Mit Hilfe von Langzeitultraschalluntersuchungen an tragenden Häsinnen wurde die sonografische Erscheinung der pränatalen Entwicklung sowie der Ovarien und deren Funktionskörper qualitativ und quantitativ beurteilt. Weiterhin wurden endokrinologische Aspekte und Störungen der pränatalen Entwicklung untersucht. \- Die mittlere Trächtigkeitsdauer betrug 41,9 ± 0,8 Tage (n=35). \- Es wurden neun verschiedene biometrische Parameter an den Konzeptus gemessen, sowie die qualitative Entwicklung ultrasonografisch beurteilt. Mit Hilfe der linearen und nichtlinearen Regression wurden Wachstumskurven für die gesamte pränatale Entwicklung berechnet. Daraus wurden Gleichungen zur Berechnung des Gestationsalters einer tragenden Häsin erstellt. \- Qualitativ wurden typische sonografische Eckpunkte für verschiedene Trächtigkeitsstadien beschrieben. Hervorzuheben ist die sonografische Detektion von Gelbkörpern (C.ll.) am 3. Tag post conceptionem (p.c.) und die erste Detektion von Keimblasen am 6. Tag p.c. \- Die Entwicklung der C.ll. wurde verfolgt und für die gesamte Trächtigkeit dargestellt. Dies schloss die postnatale Regression ein. Daraus wurde ein mathematisches Modell berechnet. Die follikuläre Entwicklung folgte keinem spezifischen Schema. \- Der Serumprogesteronspiegel (P4) stieg bis zum 10. Tag p.c. bis auf ein Plateau an, erhöhte sich kurz vor der Geburt und fiel dann auf basales Niveau ab. Im Serumestrogenspiegel (E2) ließen sich keine Gesetzmäßigkeiten erkennen. \- Embryonale Verluste und Resorptionen traten in mehr als der Hälfte der Trächtigkeiten auf. Die Arbeit liefert detaillierte Beschreibungen zur sonografischen Detektion und Diagnostik dieser Phänomene. In 3,5% der Trächtigkeiten kamen embryonale Retardierungen vor. Aus allen Eckpunkten wurde ein Schema zur Beurteilung des Gestationsalters einer Häsin mit unbekanntem Deckzeitpunkt erstellt. 2\. Existenz und Funktionsweise der Superfetation: \- Die mittlere Zwischentragezeit bei permanenter Anpaarung betrug 38,1 ± 1,1 Tage und war signifikant kürzer als die physiologische Trächtigkeitsdauer (n=18, p, Successful reproductive strategies are important to maximize reproductive output and therefore Darwinian fitness. Superfetation (SF) is the ability to conceive during an existing pregnancy. For a long time, it has been proposed that SF occurs in the European brown hare. The EBH- populations have been declining across Europe over recent decades. To ensure survival of this species it will be important to understand its reproductive strategies. In this study we initially characterised pregnancy and prenatal development in EBH using ultrasound technology. Furthermore we investigated the occurrence, mechanisms and potential advantages of SF. Data was collected from hares in a breeding colony at the field research station of the IZW over three full seasonal cycles. Altogether 663 and 163 examinations, on 55 females and 34 males respectively, were conducted. A total of 159 pregnancies in 45 females were diagnosed and evaluated. Results and conclusions are summarized: 1\. Characterization of EBH prenatal development: During pregnancy long-term ultrasound examinations were carried out to follow the development of the fetus as well as to examine and evaluate the appearance of the reproductive tract of the female. Furthermore, hormonal levels were assessed as well as malfunctions during pregnancy. The collected data was used to develop a comprehensive model of prenatal development in EBH. The model can be used in future studies to assess gestational age when the conception date is unknown. \- Mean pregnancy length was 41.9 ± 0.8 days (n=35). \- Embryonic loss and resorption occurred in more than half of all pregnancies. In addition, embryonic retardation was observed in 3.5% of all pregnancies. This study provides detailed description for the ultrasound detection and diagnosis of the malfunctions. \- During prenatal development nine biometric parameters (embryonic vesicle, biparietal diameter, crown-rump-length, thorax diameter, femur length, kidney diameter, eye diameter, eye lens diameter) were measured. From these parameters growth curves, spanning the entire prenatal development, were calculated using linear and non-linear regression models. Mathematical equations were developed to determine the gestational age in pregnant females. \- Ultrasound data was used to define characteristic pregnancy stages. For instance, Corpus luteum (C.ll) of pregnancy and embryonic vesicles could first be detected on day 3 and 6 p.c., respectively. The C.ll. development was followed during the course of pregnancy including postnatal regression. A mathematical model was established describing C.ll. development. The follicular development did not follow a particular pattern. \- The serum progesterone (P4) level followed a characteristic pattern as previously described. On the other hand the serum estrogen (E2) level did not show any obvious trend. 2\. Existence and functional mechanisms of Superfetation: \- In permanent breeding pairs mean interbirth interval was significantly shorter than mean pregnancy length (38.1 ± 1.1 days (n=18) vs 41.9 ± 0.8 days (n=35) p