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Ein großes Problem der bakteriellen Atemwegserkrankungen von Geflügel sind die Anforderungen an eine wirksame Behandlung der Herde, um die Gesundheit und den Tierschutz zu gewährleisten und wirtschaftliche Verluste zu verhindern. Die Verwendung und der Missbrauch von antimikrobiellen Substanzen ist derzeit ein großes Problem, da dies meist zu einer erhöhten Inzidenz von Antibiotika- resistenten Bakterien führt. Ziel dieser Arbeit war es daher, geeignete Testmethoden zur Bestimmung der antibiotischen Sensitivität von R. anatipestifer und O. rhinotracheale gegenüber derzeit verwendeten Wirkstoffen zu entwickeln und zu etablieren. Im ersten Teil der Arbeit wurden zur Identifizierung und Charakterisierung von R. anatipestifer- und O. rhinotracheale-Isolaten, die in den Jahren 2007 bis 2012 aus verschiedenen Geflügelarten isoliert wurden, biochemische und molekularbiologische Methoden angewandt. Insgesamt konnten 108 Feldisolate eindeutig als R. anatipestifer identifiziert werden, ebenso wie 100 Feldisolate als O. rhinotracheale. Das Ergebnis der Makro-Restriktionsanalyse zeigte eine große Vielfalt von DNA- Fingerabdrücken sowohl bei R. anatipestifer als auch bei O. rhinotracheale. Im Falle von R. anatipestifer konnte eine große Vielfalt von Fragmentmustern innerhalb der Entenisolate nachgewiesen werden. Während Isolate von Puten 100% genetische Ähnlichkeit innerhalb der Untergruppe zeigten. Im Falle von O. rhinotracheale wurden die Isolate der Serotypen A, B und E in gemeinsamen Subclustern gefunden. Die Bestimmung der antibiotischen Sensitivität von R. anatipestifer und O. rhinotracheale ist aufgrund der komplexen Kultivierungsansprüche und des ungewöhnlich häufigen Auftretens von Resistenz schwierig. Daher wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit die Wirkung verschiedener Parameter untersucht (Testmedium, Inokulationsdichte, Inkubationszeit und Inkubationsatmosphäre). Ziel war es die Bouillon- Mikrodilution als Standard-Prüfmethode für R. anatipestifer zu etablieren und validieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass Müller-Hinton-Bouillon II (MHB II) suppelentiert mit 2% lysiertem Pferdeblut (lPb) ein geeignetes Kulturmedium ist. Die Inkubation bei 37 ° C für 24 Stunden unter aeroben Bedingungen ergab visuell gut ablesbare Ergebnisse in den kommerziellen Sensititre-Mikrotiterplatten. Aufgrund fehlender Breakpoints wurden die epidemiologischen Cut-off-Werte sowie die minimale Hemmkonzentration MHK50 und MHK90-Werte mit Hilfe eines statistischen Programms bestimmt. Tiamulin und alle Substanzen, die zu den Klassen der Cephalosporine und Carbapeneme gehören, haben sich als wirksam erwiesen. Die multimodale Verteilung der R. anatipestifer-Isolate gegenüber den Fluorchinolonen zeigt die Aufteilung in eine empfindliche und eine unempfindliche Population und zeigt die Notwendigkeit quantitativer Empfindlichkeitstests. Bezüglich der Aminoglycoside und Tetracycline wurde der Großteil der MHK-Werte in den hohen Konzentrationsbereichen bestimmt. Für O. rhinotracheale konnte keine Kombination von Testparametern ermittelt werden, die zu visuell gut ablesbaren Ergebnissen in den Mikrotiterplatten führte. Stattdessen konnte Mueller- Hinton-Agar mit 5% lysiertem Pferdeblut (lPb) als Medium für den E-Test sowie für den Agar-Dilutionstest hergestellt werden. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 ° C war ein visuell gutes Ablesen der Platten möglich. Bei beiden Methoden können O. rhinotracheale-Isolate nur für wenige antimikrobielle Substanzen getestet werden. Die Verfügbarkeit von E-Teststreifen mit tiermedizinisch relevanten Wirkstoffen ist begrenzt und mit hohen Kosten verbunden. Das Agar- Dilutionsverfahren hingegen führt zu einem hohen Arbeitsaufwand und wird nur in speziellen Labors durchgeführt. Jedoch können beide Verfahren eine Alternative zu herkömmlichen Diffusionstests mit der Möglichkeit einer quantitativen MHK-Bestimmung bieten., A major problem of bacterial respiratory diseases of poultry are the requirments for an effective treatment of the flock, in order to ensure the health, the animal welfare as well as to prevent economic losses. Use and misuse of antimicrobial substance is mostly lead to increase the incidence of antibiotic resistant bacteria and this is currently a huge problem. Therefore the aim of this thesis was focus on the development and establishment of suitable test methods to determine antibiotic sensitivity of R. anatipestifer and O. rhinotracheale to commen used drugs. The first part was the identification and characterization of R. anatipestifer and O. rhinotracheale isolates, which were isolated from different poultry species during the period 2007 to 2012 by using biochemical and molecular biological methods. A total of 108 field isolates could be clearly identified as R. anatipestifer, as well as 100 field isolates as O. rhinotracheale. The result of the macro-restriction analysis showed a large variety of DNA fingerprints in both, R. anatipestifer and O. rhinotracheale. In the case of R. anatipestifer, a large diversity of fragment patterns could be detected within the duck isolates, while isolates from turkeys showed 100% genetic similarity within the subgroup. In the case of O. rhinotracheale the isolates of serotypes A, B and E were found in common subclusters. The determination of the antibiotic sensitivity of R. anatipestifer and O. rhinotracheale is difficult, because of the complex cultivation requirements and the unusually frequent occurrence of resistance. Therefore, in the second part of the present work was aimed to study the effect of different parameters (Test medium, Inoculation density, Incubation time and Incubation atmosphere). The aim was to establish and validate Bouillon microdilution as a standard test method for R. anatipestifer. The obtained results proved that Mueller-Hinton broth II (MHB II) with 2% lysed horse blood (lPb) supplementation to be a suitable medium for cultivation. Incubation at 37 ° C for 24 hours under aerobic conditions gave visually good readable results in the commercial sensititre microtiter plates. Since, lack of Breakpoints the epidemiological cut-off values as well as the Minimum inhibitory concentration MIC50 and MIC90 values were determined with the help of a statistical program. Tiamulin and all substances belonging to the classes of cephalosporins and carbapenemes have been proved to be effective. The multimodal distribution of the R. anatipestifer isolates against the fluoroquinolones shows the division into a sensitive and as well as resistance population and shows the necessity of quantitative sensitivity tests. Concerning aminoglycosides and tetracyclins, the majority of the MIC values were determined in the high concentration ranges. For O. rhinotracheale no combination of test parameters could be established, which leads to visually clearly readable results in the microtiter plates. Instead, it was possible to establish a Mueller-Hinton-Agar with 5% lysed horse blood (lPb) as the medium for the E-test as well as for the agar dilution test. A visually well reading of the plates was possible after 24 hours of incubation at 37 ° C. With both methods, O. rhinotracheale isolates can only be tested for a few antimicrobial substances. The availability of E-test strips with veterinary relevant active substances is limited and connected with high costs. The agar dilution method, on the other hand, entails a high amount of work and will only be carried out in special laboratories. However, both methods can provide an alternative to conventional diffusion tests with the possibility of quantitative MIC deterrnination.

Einleitung: Die 15-Lipoxygenase (ALOX15) ist eine Nichthämeisen enthaltende Dioxygenase, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu Hydroperoxyfettsäuren oxygeniert. Sie ist an der Synthese von bioaktiven Botenstoffen (Leukotriene, Lipoxine) sowie am Lipoproteinstoffwechsel beteiligt und spielt damit eine wichtige Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. ALOX15-Orthologe werden von fast allen Säugetierspezies exprimiert. Phylogenetisch ältere Säugetiere (Maus, Ratte, Schwein) besitzen 12-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe, während höher entwickelte Säugetiere (Schimpansen, Mensch) 15-lipoxygenierende Enzyme exprimieren. Um mögliche Triebkräfte für diese evolutionäre Veränderung der Reaktionsspezifität von ALOX15-Orthologen zu identifizieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit vier Arbeitshypothesen getestet: i) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe besitzen eine höhere Linolsäureoxygenierungsaktivität und sind damit effektivere Enzyme. ii) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe verfügen über eine höhere Membranoxygenaseaktivität. iii) 15-lipoxygenierende ALOX15-Orthologe weisen eine höhere Syntheseaktivität für antiinflammatorische Lipoxine auf. iv) Die Sensitivität gegenüber LOX-Hemmstoffen korreliert mit der Reaktionsspezifität der ALOX15-Orthologen. Methodik: Um diese Hypothesen zu testen, wurden ALOX15-Orthologe verschiedener Säugetiere rekombinant exprimiert und deren Fähigkeit zur Linolsäureoxygenierung, zur Membranoxygenierung und zur Lipoxinsynthese miteinander verglichen. Weiterhin wurde die Hemmbarkeit der Enzymorthologen durch ausgewählte Lipoxygenasehemmstoffe getestet. Ergebnisse: Es konnten keine systematischen Unterschiede zwischen 12- und 15-lipoxygenierenden ALOX15-Orthologen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Oxygenierung von Linolsäure und von Biomembranen nachgewiesen werden. Unter Verwendung verschiedener Substrate wurde gezeigt, dass die Lipoxinsynthaseaktivitäten von 15-lipoxygenierenden ALOX15-Orthologen signifikant (p, Introduction: 15-lipoxygenase (ALOX15) is a nonheme-iron containing dioxygenase that catalyzes the dioxygenation of polyunsaturated fatty acids to hydroperoxy derivatives. It has been implicated in the biosynthesis of lipid mediators such as leukotriens and lipoxins but also in lipoprotein metabolism and thus, it plays an important role in physiological and pathophysiological processes. ALOX15 genes occur in most mammalian genomes and the ALOX15-orthologs of lower mammals (mouse, rat, pig) exhibit arachidonic acid 12-lipoxygenating activities. In contrast, higher mammals (human, chimpanzee) express arachidonic acid 15-lipoxygenating enzymes. To explore the potential driving forces for these evolutionary alterations the following hypothesises were tested in this dissertation: i) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher linoleic acid oxygenase activity than 12-lipoxygenating orthologs and thus, are more effective lipid peroxidizing enzymes. ii) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher membrane oxygenase activity. iii) 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs exhibit a higher biosynthetic capacity for anti-inflammatory lipoxins. iv) The sensitivity of ALOX15-orthologs for standard LOX-inhibitors correlates with the reaction specificity of the enzymes. Methodology: To test these working hypothesises we expressed several 12- and 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs as recombinant proteins in E. coli and quantified their oxygenase activities of linoleic acid and biomembranes. We also measured their synthetic capacity for anti- inflammatory lipoxins and tested their sensitivity for standard LOX inhibitors. Results: We did not detect significant differences between 12- and 15-lipoxygenating ALOX15-orthologs when we quantified the linoleic acid and membrane oxygenase activity of the enzymes. In contrast, the biosynthetic capacity for anti-inflammatory lipoxins from different substrates was significantly (p

The serine proteases matriptase and kallikrein 7 are involved in a variety of physiological processes. A disturbed activity of these proteases is responsible for a number of diseases. Therefore, it is of therapeutic interest to be able to regulate the activity of these proteases. For this purpose, a series of substrate-analogue inhibitors for matriptase and kallikrein 7 have been developed and investigated for their inhibitory potency. Potent and selective inhibitors were developed for both proteases., Die Serinproteasen Matriptase und Kallikrein 7 sind in einer Vielzahl physiologischer Prozesse involviert. Eine gestörte Aktivität dieser Proteasen ist für eine Reihe von Erkrankungen verantwortlich. Daher ist es von therapeutischem Interesse, die Aktivität der Proteasen regulieren zu können. Zu diesem zwecke wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine Reihe von substratanalogen Hemmstoffen für Matriptase und Kallikrein 7 entwickelt und auf ihre Hemmwirkung hin untersucht. Für beide Protease konnten wirksame und selektive Inhibitoren dargestellt werden.

Rhenium(I) Complexes in Photodynamic Therapy Photodynamic therapy (PDT) has become a promising field in cancer treatment. This approach is based on a photosensitizer (PS) which is irradiated with visible light in the presence of oxygen to generate reactive oxygen species (ROS), like 1O2, ultimately leading to cell death. Until now many well-established PS depend on purely organic molecules like porphyrin derivatives, chlorines, phthalocyanines or porphycenes. However, metal complexes constitute an attractive class of compounds in PDT due to their ability to produce singlet oxygen in a more efficient way. Furthermore, they have features such as structural diversity and complexity, tunable ligand exchange kinetics or unusual reactivities. This dissertation deals with the development of rhenium(I) complexes for photoactivated cancer therapy. In order to improve their stability and excitation wavelength the scaffold of the rhenium(I) complexes with a pyridocarbazole ligand was functionalized. By replacing the monodentate ligand against a strong sigma-donor, like trimethylphosphine or imidazole, no signs of decomposition can be monitored by 1H NMR spectroscopy. The introduction of a pi-donating substituent in the indole and a sigma-accepting substituent in the pyridine moiety of the pyridocarbazole ligand leads to a bathochromatic shift of the absorbance band. In this aspect a rhenium(I) complex, which initiates apoptosis in HeLa cells at wavelengths of > 620 nm, could be synthesized. To get an idea which mechanisms may occur in the cell further experiments were carried out. In this aspect the synthesis of a biotin-labeled complex is described which was localized in HeLa cells. The rhenium(I) compound seems to accumulate in different membranes of the cell and introduces the mechanism of lipid peroxidation which leads to cell death by apoptosis. Metal complexes with a pyridocarbazole ligand are well-known protein kinase inhibitors. Therefore the rhenium(I) compounds were tested for their inhibitory properties which led to IC50 values in the nanomolar range for the protein kinase Pim1 as model system at an ATP concentration of 10 µM. Thus, the organometallics show a dual function in a single drug which render them an attractive class of compounds for photodynamic as well as targeted therapy. Phenanthroline Complexes as Protein Kinase Inhibitors One project in the Meggers group deals with the design of metal complexes as selective and potent protein kinase inhibitors. The compounds are based on a pyridocarbazole ligand which forms hydrogen bonds to the hinge region of the ATP binding pocket. One major drawback of this system is the lengthy and complicated synthesis which causes problems for scale-up procedures. Furthermore, it tends to address only a few kinases within the human kinome. This thesis describes the design of a new pharmacophore ligand which is based on a phenanthroline system. The synthesized ruthenium(II) complex is a micromolar inhibitor for the protein kinases DYRK1A, Pim1 and Pim2 at an ATP concentration of 1 µM. A cocrystal structure of the compound with Pim1 reveals that the complex forms no hydrogen bonds with the hinge region of the ATP binding site, but instead with amino acid residues, which are located at the opposite site of the binding pocket. So the organometallic might be a promising lead structure for the development of potent and selective non-hinge-binding ATP-competitive inhibitors., Rhenium(I)-Komplexe für die Photodynamische Therapie Die photodynamische Therapie (PDT) ist eine vielversprechende Methode für die Behandlung von Krebs. Hierbei wird ein Photosensibilisator (PS) in Anwesenheit von Sauerstoff belichtet, um verschiedene reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS), wie 1O2, zu produzieren, die im Anschluss den Zelltod induzieren. Bis jetzt beruhen viele der etablierten PS auf einem rein organischen Grundgerüst, wie Porphyrine, Chlorine, Phthalocyanine oder Porphycene. Bei Metallkomplexen handelt es sich aber um eine attraktive Verbindungsklasse für die PDT aufgrund ihrer Eigenschaft Singulett-Sauerstoff deutlich effektiver zu produzieren. Außerdem weisen sie eine größere strukturelle Vielfalt oder ungewöhnliche Reaktivitäten auf. Diese Dissertation beschäftigt sich mit der Entwicklung von Rhenium(I)-Komplexen für die photoaktiverte Krebstherapie. Um die Stabilität bzw. die Anregungswellenlänge dieser Verbindungen mit Pyridocarbazol-Ligand zu optimieren, wurde das Grundgerüst modifiziert. Durch den Austausch des monodentaten Liganden durch einen starken sigma-Donor, wie Trimethylphosphin oder Imidazol, konnte die Stabilität deutlich erhöht werden. Die Einführung eines pi-Donors am Indolring und eines sigma-Akzeptors am Pyridinring des Pyridocarbazol-Liganden führt zu einem bathochromen Shift der Absorptionsbande. Dadurch war es möglich, eine Rhenium(I)-Verbindung darzustellen, die sogar bei einer Wellenlänge > 620 nm den Zelltod in HeLa-Zellen induziert. Um einen Eindruck davon zu bekommen, welche Mechanismen innerhalb der Zelle ablaufen, wurden weitere Experimente durchgeführt. In diesem Zusammenhang konnte ein biotinylierter Komplex dargestellt werden, der in HeLa-Zellen lokalisiert wurde. Diese Rhenium(I)-Verbindung scheint sich in verschiedenen Membranen der Zelle anzulagern und dort den Mechanismus der Lipidperoxidation zu starten. Metallverbindungen mit einem Pyridocarbazol-Liganden sind sehr bekannte Proteinkinase-Inhibitoren. Aus diesem Grund wurden die Rhenium(I)-Komplexe ebenfalls auf ihre inhibitorischen Eigenschaften untersucht, was sich in IC50-Werten im nanomolaren Bereich für die Proteinkinase Pim1 bei einer ATP-Konzentration von 10 µM widerspiegelt. Diese Verbindungen zeigen also eine duale Funktionalität, da sie photozytotoxische Eigenschaften besitzen und Proteinkinasen inhibieren. Phenanthrolin-Komplexe als Proteinkinase-Inhibitoren Ein Teilgebiet der Arbeitsgruppe Meggers beschäftigt sich mit der Darstellung von Metallverbindungen als selektive und potente Proteinkinase-Inhibitoren. Die Komplexe basieren auf einem Pyridocarbazol-Liganden, der Wasserstoffbrücken-Bindungen zu der Scharnierregion der aktiven Tasche einer Kinase ausbilden kann. Ein großer Nachteil dieses Systems ist die aufwendige Synthese, die zu Problemen bei der Durchführung in größeren Maßstäben führt. Außerdem besitzt der Pyridocarbazol-Ligand eine Präferenz für einige Proteinkinasen. Diese Arbeit beschreibt die Darstellung eines neuen Pharmakophor-Liganden, der auf einem Phenanthrolin-Grundgerüst beruht. Der synthetisierte Ruthenium(II)-Komplex ist ein micromolarer Inhibitor für die Proteinkinasen DYRK1A, Pim1 und Pim2 bei einer ATP-Konzentration von 1 µM. Eine Co-Kristallstruktur der Verbindung mit Pim1 zeigt, dass der Komplex keine Wasserstoffbrücken-Bindungen mit der Scharnierregion der aktiven Tasche ausbildet. Stattdessen wechselwirkt er mit Aminosäure-Seitenketten, die auf der gegenüberliegenden Seite lokalisiert sind. Diese Organometallverbindung könnte also eine vielversprechende Leitstruktur für die Entwicklung potenter und selektiver Proteinkinase-Inhibitoren sein, die nicht mit der Scharnierregion wechselwirken.

The transcription factor STAT5 belongs to the family of Signal Transducer and Activator of Transcription and subdivides into STAT5A and STAT5B which share 96% sequence homology on the amino acid level. STAT5A is involved in hematopoiesis, immunity and mammary differentiation. The phosphorylation of a conserved tyrosine is essential for the activation of STAT transcription factors leading to the dimerization of two STAT proteins through reciprocal SH2 domain-phosphotyrosine interactions. The phosphorylated STAT dimers accumulate in the nucleus where they bind to specific promoter sequences and finally induce target gene expression. Persistent activation of STAT5 was detected amongst others in breast, prostate, ovarian and head and neck cancer. In addition, its important role in the development of myeloid neoplasms was demonstrated. The constitutively active kinase BCR-ABL is the result of a characteristic chromosomal translocation and leads to the development of chronic myeloid leukemia (CML). STAT5A is persistently phosphorylated at tyrosine 694 in BCR-ABL positive cells and therefore activated. Activation of STAT5 is essential for the initiation and maintenance of CML in murine models of the disease. Interestingly, activated STAT5A is localized predominantly in the cytoplasm of BCR-ABL positive leukemic cells, although phosphorylation at its main tyrosine typically causes nuclear accumulation of the transcription factor. The underlying mechanism was topic of the following investigation. Fluorescent STAT5A fusion proteins were cloned for confocal laser scanning microscopy. After cytokine stimulation the fusion proteins were phosphorylated at Y694, translocate into the nucleus and subsequently induce gene expression of a reporter gene. This verifies fluorescently labeled STAT5A as a functional transcription factor. Cytoplasmic localization of activated STAT5A was validated in CD34+ progenitor cells from a CML patient in chronic phase and in a CML cell line (K562). However, ectopic expression of BCR-ABL in non-myeloid cells leads to the accumulation of activated STAT5A. The Src family kinases (SFKs) Hck and v-Src phosphorylated STAT5A at Y694 but prevented BCR-ABL induced nuclear accumulation of the fluorescently labeled transcription factor. It turned out that the cytoplasmic retention depends on the kinase activity of SFKs. Inhibition of the kinase activity in K562 cells led to the nuclear accumulation of STAT5A and enhanced target gene expression. Furthermore, an intact SH2 domain is essential for the cytoplasmic retention of STAT5A and the robust interaction with the SFKs. FLT3-ITD, a constitutively active receptor tyrosine kinase found in acute myeloid leukemia, induced nuclear accumulation of STAT5A even if Hck is coexpressed. Thus, SFK-induced cytoplasmic retention of STAT5A is not universally valid and depends on the STAT5A activating oncogene.

Das Protein Hsp90 ist ein molekulares Chaperon, dass an der Aktivierung von essentiellen zellulären Proteinen wie den Signaltransduktionskinasen Src und Raf, den Transkriptionsfaktoren Hsf und p53, sowie Steroidhormonrezeptoren beteiligt ist. Mehr als 150 Hsp90-abhängige Substratproteine konnten bis heute identifiziert werden, deren Aktivierung vermutlich durch Multiproteinkomplexe bestehend aus Hsp90, p23/Sba1, Hop/Sti1 und FKBP51 erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde die ATP-Hydrolyse durch das molekulare Chaperon Hsp90 untersucht, da diese für die Aktivierung der Substrate erforderlich ist. Dabei stellte sich heraus, dass der dimere Assoziationsgrad von Hsp90 für die effiziente Hydrolyse von ATP unerlässlich ist. Einer der Gründe dafür ist, dass die N-terminalen Domänen des dimeren Proteins während eines ATPase-Zyklus transient dimerisieren und dabei ihre ATPase-Aktivität stimulieren. Als wichtiger Bereich zur Vermittlung dieser Interaktion wurden die ersten 24 Aminosäuren von Hsp90 identifiziert. Das Protein Sti1, das die ATPase von Hsp90 inhibiert, wurde als kompetitiver Inhibitor identifiziert und diese Wirkung darauf zurückgeführt, dass die N-terminale Dimerisierung in seiner Anwesenheit verhindert wird. Das Protein Sba1 dagegen inhibiert die ATPase von Hsp90, indem es mit dem transienten N-terminal dimerisierten Zustand interagiert und die Hydrolyserate dadurch verringert. Die Interaktionsweise dieser Proteine zeigt – in Kombination mit den Multiproteinkomplexen, die bei der Prozessierung von Substraten gefunden werden – wie der Austausch der einzelnen Komponenten dieser Mutliproteinkomplexe durch die Konformationsänderungen im Protein Hsp90 während der ATP-Hydrolyse reguliert werden könnte. Dadurch sind Schlüsse auf die Substratprozessierung von Hsp90 möglich. The protein Hsp90 is a molecular chaperone that promotes the activation of essential cellular proteins, like the signal transduction kinases Src and raf, the transcription factors Hsf and p53, and the steroid hormon receptors. More than 150 Hsp90-dependent substrates have been identified to date. Their activation is achieved by complex multi-protein assemblies based on the proteins Hsp90, p23/Sba1, Hop/Sti1 and FKBP51. In this thesis the main topic was the ATP hydrolysis by Hsp90, as this reaction has been found to be required for the activation of substrate proteins. Findings showed that the association to dimers is of crucial importance for the efficient hydrolysis. One of the reasons is that the N-terminal domains of the dimeric protein associate during the ATPase cycle transiently and cross-stimulate their ATPase activities. The first 24 amino acids of the protein were identified as important interaction site for this reaction. The protein Sti1 – known to inhibit the ATPase activity of Hsp90 – was identified as competitive inhibitor and its effect on Hsp90 was elucidated, as in its presence the N-terminal dimerisation of Hsp90 is strongly inhibited. The protein Sba1 in contrast inhibits the ATPase of Hsp90 by interacting with the transient N-terminal dimerised state and thereby slows the turnover of Hsp90. The way of interaction of these proteins shows – in combination with the known multi-protein complexes involved in substrate processing – how the exchange of components of these complexes is regulated by the conformational changes in the protein Hsp90 during the ATP hydrolysis reaction. This allows to speculate on the processing of substrates by Hsp90.

Fast alle Zellen reagieren auf mechanische Reize mit elektrophysiologischer und/ oder biochemischer Antwort. Versuche haben gezeigt, dass außer MG-63 Osteosarkomzellen auch andere Osteosarkomzellinien oder Zellen wie Osteoblasten, Chondrozyten, Endothelzellen und Herzmuskelzellen auf mechanische Dehnung mit einer ERK1 und 2-Aktivierung reagieren. Durch Mechanotransduktion wurde die Signalkaskade der humanen MG-63 Osteosarkomzellen näher untersucht. Durch in die Signalkaskade eingreifenden Inhibitoren wie BAPTA AM (Calcium-Komplexbilder), Gö 6976 (Inhibitor der calciumabhängigen PKC bei den hier verwendeten Konzentrationen) und Gö 6983 (Inhibitor der PKC außer der µ-Isoform bei den hier verwendeten Konzentrationen) und mechanischer Dehnung der MG-63 Osteosarkomzellen soll das Aktivitätsverhalten von ERK1 und 2 untersucht und dabei herausgefunden werden, welche Isoform der PKC an der Signalkaskade beteiligt ist. Durch einen MTT-Zellproliferationsassay hat sich bei der 5. Zellpassage durch Dehnung der Zellen um 4000µstr mit 1Hz und 30 Zyklen eine vermehrte Stoffwechselaktivität und damit eine gesteigerte Zellproliferation um 28,48% gezeigt. Es wurden drei verschiedene Versuchsreihen durchgeführt, wobei bei den Dehnungsversuchen die Zellen um 4000µstr mit 1Hz und 30 Zyklen gedehnt wurden. Die Zellen wurden nach der Dehnung unterschiedlich lange von 30sec bis 15 Minuten inkubiert. In einer anderen Versuchsdurchführung wurden die Zellen nur mit den Inhibitoren BAPTA AM, Gö 6976 und Gö 6983 behandelt. In einer weiteren Versuchsreihe wurden die Zellen vor der Dehnung mit den oben genannten Inhibitoren behandelt. Nach der jeweiligen Versuchsdurchführung wurden die Zellen lysiert und jeweils 50µg Zellprotein-Gemisch der einzelnen Zellproben durch Elektrophorese aufgetrennt. Durch einen Western-Blot wurden dann die Proteinbanden auf eine PVDF-Membran transferiert und anschließend durch einen colorimetrischen Nachweis mit einem Primär-, Sekundärantikörper und einer an den Sekundärantikörper gekoppelten alkalischen Phosphatase durch Farbreaktion sichtbar gemacht. Durch alleinige Dehnung der Zellen zeigte sich je nach der ERK1 und 2-Grundaktivität eine Aktivierung oder Herunterregulierung der ERK1 und 2. Bei der 3.und 12. Zellpassage mit niedriger ERK1 und 2-Grundaktivität zeigte sich eine ERK1 und 2-Aktivierung mit einem Maximum nach einer Inkubationszeit von 1min nach der Dehnung bei der 3. Zellpassage und einem Maximum erst nach 15min bei der 12. Zellpassage. Wegen schneller (1min) und langsamer (15min) Signaltransduktionszeit werden sowohl calciumabhängige und calciumunabhängige Signalkaskaden vermutet. Überraschenderweise zeigte sich bei der 9. Zellpassage eine Herunterregulierung der ERK1 und 2-Aktivität mit einem Minimum nach 2-minütiger Inkubationszeit nach der Dehnung. Durch Behandlung der Zellen mit den oben genannten Inhibitoren zeigte sich eine paradoxe Aktivierung der ERK1 und 2. Eine paradoxe Aktivierung wurde bereits im humanen THP-1 Zellen durch Inhibition von c-Raf und in humanen HL60-Leukämiezellen durch Inhibition der p38MAPK nachgewiesen. Eine paradoxe Aktivierung erfolgt auf zwei verschiedenen Wegen. Durch Inhibition der PKC oder hiernach auch Calcium kommt es kompensatorisch zu einer Aktivierung eines übergeordneten Signalproteins, durch welches letztendlich ERK1 und 2 aktiviert werden. Andererseits wird durch Inhibition der PKC der negative Feedback-Mechanismus der PKC durchbrochen und damit die Autoinhibition der PKC unterdrückt, was eine Aktivierung der PKC zur Folge hat und letztendlich eine ERK1 und 2-Aktivierung bewirkt. Zellen der 6. Passage zeigten durch Behandlung mit Gö 6983 vor der Dehnung, dass die Dehnung zwar auch eine Aktivierung der ERK1 und 2 bewirkt, aber die Aktivierung bei steigenden Konzentrationen von Gö 6983 abnimmt. Dagegen zeigte sich bei der 9. Passage ein umgekehrtes Bild der Aktivierung mit einer Zunahme bei steigenden Konzentrationen., By signal transduction due to mechanical loading the signal cascade from MG-63 osteosarcoma cells was investigated. By inhibitors like BAPTA AM (calcium chelator), Gö 6976 (inhibitor of the calcium dependent PKC by using certain concentrations) and Gö 6983 (inhibitor of the PKC except of the µ-isoform by using certain concentrations) and mechanical loading the behavior of ERK1 and 2 activation was analyzed and it was tried to find out which isoform of the PKC contributes to the signal transduction. An MTT-cell proliferation assay showed through mechanical loading of the 5-th cell passage of MG-63 osteosarcoma cells with 4000µstr, 1Hz and 30 cycles that the cells were mechanosensitive because of increased proliferation of about 28,48%. Exclusive stretching the cells with 4000µstr, 1Hz and 30 cycles showed an ERK1 and 2 activation of the 3-rd and the 12-th cell passage with a maximum after 1min of the 3-rd cell passage and a maximum after 15min of the 12-th cell passage. Because of the fast (1min) and slow (15min) time of signal transduction there are calcium dependent and calcium independent signal cascades supposed. Surprisingly the 9-th cell passage showed a down regulation of the ERK1 and 2 activity with a minimum of 2min after stretching. Treatment of the cells with BAPTA AM, Gö 6976 and Gö 6983 demonstrated a paradoxical activation of ERK1 and 2. Treatment of the 6-th cell passage with Gö 6983 before mechanical loading resulted in an activation of ERK1 and 2 but the activation decreased by increasing concentration of Gö 6983. By contrast the 9-th cell passage showed an inverse behaviour with an activation of ERK1 and 2 by the increase of concentration of Gö 6983.

Farnesyltransferase catalyzes the transfer of a farnesyl residue to a specific C-terminal amino acid sequence. This transfer is the first and most important step in the posttranslational modification of proteins. Farnesylated proteins are important in cell proliferation, gene expression, changes of the cyto skeleton and production of second messengers. Therefore, inhibition of protein farnesylation has received major attention in the development of anti-cancer drugs. But the main focus does not only concentrate on the design of anti-tumor-therapeutics alone but also on the development of new anti-infective drugs. Protein prenylation occurs in Plasmodium falciparum (causative agent of Malaria tropica), Trypanosoma brucei (sleeping sickness), Trypanosoma cruzi (Chagas disease) and Leishmania major (Leishmaniasis). Thus, the main focus of this dissertation is the development of anti-parasitic farnesyltransferase inhibitors with a benzophenone-based core structure in a structure-based approach. These inhibitors exhibit high in vitro-activity against Plasmodium falciparum and Trypanosoma cruzi with IC50-values in the low nanomolar range. Further optimisation resulted in the first farnesyltransferase inhibitors with in vivo-activity against Plasmodium falciparum described in literature. Likewise farnesyltransferase inhibitors with oral in vivo-activity against Trypanosoma cruzi have been synthesized. First evaluation of these compounds against Leishmania-species show promising results., Das Enzym Farnesyltransferase katalysiert mit der Übertragung eines Farnesylrestes auf eine spezifische C-terminale Aminosäuresequenz den ersten und entscheidenden Schritt in der posttranslationalen Modifikation vieler Proteine. Farnesylierte Proteine spielen eine entscheidende Rolle bei der Zellproliferation, Genexpression, Veränderungen des Zytoskeletts und bei der Produktion von Botenstoffen. Aus diesem Grund ist die Deaktivierung dieses Signaltransduktionsweges ein Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Chemotherapeutika gegen Krebs. Allerdings liegt der Schwerpunkt der Forschung nicht mehr nur allein bei der Entwicklung von Medikamenten gegen maligne Tumore, sondern erweiterte sich mit dem Nachweis der Proteinfarnesylierung in Plasmodium falciparum (Erreger der Malaria tropica), Trypanosoma brucei (Schlafkrankheit), Trypanosoma cruzi (Chagas-Krankheit) und verschiedenen Leishmania-Arten (Leishmaniose) auf die Entwicklung neuer Antiinfektiva. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in einem strukturbasierten Ansatz anti-parasitär wirksame Farnesyltransferaseinhibitoren mit Benzophenon-Grundstruktur entwickelt. Diese Inhibitoren zeigen mit IC50-Werten im niedrigen nanomolaren Bereich sehr gute in vitro-Aktivität gegen Plasmodium falciparum und Trypanosoma cruzi. Mit der weiteren Optimierung der Wirksamkeit dieser Inhibitoren wurden die ersten in vivo-wirksamen Farnesyltransferaseinhibitoren gegen Plasmodium falciparum überhaupt entwickelt, die in der Literatur veröffentlich worden sind. Ebenso wurden Farnesyltransferaseinhibitoren entwickelt, die bei oraler Applikation in vivo-Aktivität bei Trypanosoma cruzi-infizierte Mäusen zeigen. Erste Testungen dieser Inhibitoren gegen Leishmania-Arten zeigen ebenfalls viel versprechende Ergebnisse.

Die Aufgabenstellung dieser Dissertation war die Entwicklung und Validierung von zwei neuartigen Leitstrukturen im Hinblick auf das strukturbasierte Design. Im Fokus stand die Etablierung der Aminohydroxysulfone als neue Substanzklasse zur Inhibierung verschiedener Vertreter aus der Familie der Aspartylproteasen. Inhibitoren aus dieser Substanzklasse waren bisher nicht bekannt und fanden in der Wirkstoffforschung noch keine Beachtung. Daher waren die Aminohydroxysulfone als neue Leitstruktur schon aus patentrechtlichen Gründen interessant. Zuerst werden die Konzepte zur Darstellung der Aminohydroxysulfone vorgestellt und die Substanzklasse anhand von bereits bekannten Aspartylproteaseinhibitoren als neue, privilegierte Leitstruktur in den Kontext der Wirkstoffforschung eingeordnet. Die geplanten Arbeiten umfassten die diastereoselektive Synthese des chemischen Grundkörpers, die biologische Testung ausgewählter Verbindungen gegen HIV-1 Protease und Cathepsin D und die Bestimmung des Bindungsmodus sowohl durch computergestütztes Docking als auch durch Kokristallisation der dekorierten Aminohydroxysulfone mit den Enzymen. Anschließend wird die neue Substanzklasse der Pyrrolidindimethanamine als neue, heterozyklische, nicht-peptidische Leitstruktur für die HIV-1 Protease vorgestellt. Zunächst werden die Ideen und Hintergründe, die zur Auswahl der Pyrrolidindimethanamine geführt haben, diskutiert. Anschließend werden anhand der Kristallstruktur des HIV-1 Protease Komplexes mit dem Inhibitor Amprenavir (PDB-Code: 1HPV) die strukturellen Voraussetzungen für eine korrekte Adressierung der Bindetasche in unterschiedlichen Aspartylproteasen auf das Grundgerüst der neuen Leitstruktur übertragen. Weiterhin werden die diastereoselektive Synthese des Grundgerüsts und eine mögliche Dekoration der Pyrrolidindimethanamine vorgestellt und anhand von Docking Simulationen weitere Optimierungen der Leitstruktur vorgeschlagen. Im letzten Teil werden die durchgeführten Bioassays für die HIV-1 Protease und Cathepsin D und die Aufreinigung der HIV-1 Protease zur möglichen Kokristallisation mit den synthetisierten Inhibitoren vorgestellt., Aspartic proteases are a widely known enzyme class that play an important role in the regulation of physiological processes such as blood pressure (Renin),digestion (Pepsin) and degradation of endocytosed proteins (Cathepsin D). They are also crucial for the progress of severe diseases caused either by parasites like malaria (Plasmepsin) and viruses like HIV (HIV protease) or neurodegenerative disorders including Alzheimer disease (b-Secretase). Since the catalytic mechanism of aspartic proteases was first postulated, several transition state analogues have been designed by replacing the dipeptidyl cleavage site of the specific peptide substrate. A key structural element in most transition state isosteres is a hydroxyl moiety that interacts with the two catalytically active aspartic acids via hydrogen bonds. This secondary hydroxyl group replaces a catalytic water molecule in the active site and mimics the tetrahedral intermediate that is usually formed upon amide bond hydrolysis of the native substrate. Here, we present a series of hydroxyethylenesulfones as novel transition state analogues. In this study the hydroxyethylenesulfones have been synthesized and evaluated for their ability to inhibit aspartic protease. The novel lead structure motif is derived from scaffolds of already known inhibitors targeting distinct aspartic proteases. One further rational design strategy for pyrrolidinedimethylenediamines was derived by adoption of key structural elements from classical peptidomimetics linked with a non-peptide heterocyclic core structure. It is illustrated the structural requirements for our novel prototype inhibitor in a schematic manner starting from crystal structures of HIV protease and Cathepsin D with the classical peptidomimetic pepstatin. The incorporated hydroxyl group in the statine core interacts via hydrogen bonds with the catalytic aspartic acids. Further important hydrogen bonds can be recognized by two indicated carbonyl groups which either interact with the flap water in the active site of HIV protease or the nitrogens of Gly 79 and Asp 80 of the Cathepsin D backbone.In order to evaluate whether the pyrrolidinediemethylenediamines are a valid new lead structure the central pyrrolidine core was decorated with already optimized site chains derived from the HIV protease inhibitor Amprenavir and the Cathepsin D inhibitor.

Das Enzym Farnesyltransferase katalysiert die Übertragung eines Farnesylrests auf die Cysteinseitenketten von Proteinen mit einer spezifischen C-terminalen Aminosäuresequenz. Diese posttranslationale Modifikation ist für die Verankerung dieser Proteine in Membranen verantwortlich. Viele Proteine, die auf diese Weise modifiziert werden, sind an der Signaltransduktion oder der Regulation der Zellzyklus beteiligt. Daher stellt die Farnesyltransferase schon seit längerem ein interessantes Target zur Entwicklung neuer Anti-Tumor-Therapeutika dar. Inzwischen wurde Farnesyltransferase-Aktivität auch in verschiedenen Protozoenarten nachgewiesen. Daher sind Farnesyltransferase-Inhibitoren auch als potentielle Anti-Malaria-Wirkstoffe von Interesse. Ausgangspunkt dieser Arbeit sind Phenylacylaminoderivate, die als thiolfreie Farnesyltransferase-Inhibitoren in unserem Arbeitskreis entwickelt worden sind. Diese zeigen mit IC50-Werten im niederen mikromolaren Bereich nur moderate Wirksamkeit. Mit Hilfe der gefundenen Struktur-Wirkungs-Beziehungen und computer-gestützten Analysemethoden wurden verschiedene Arylacrylsäure- und Biarylacrylsäurederivate entwickelt. Die Wirksamkeit gegenüber dem isolierten Enzym konnte hierdurch bis auf einstellige nanomolare Werte verbessert werden. Bezüglich der antiplasmoidalen Wirksamkeit stehen uns inzwischen über ein halbes Dutzend Verbindungen mit IC50-Werten im zweistelligen nanomolaren Bereich gegenüber einem multiresistenten P. falciparum-Stamm zur Verfügung., Farnesyltransferase catalyzes the transfer of a farnesyl residue to cystein side chains of proteins with a specific C-terminal amino acid sequence. This posttranslational modification is necessary for protein anchorage in membranes. Most of the proteins modified in this fashion are involved in signal transduction or regulation of the cell cycle. Therefore, farnesyltransferase is an interesting target for the development of anti tumor drugs. Furthermore, because farnesyltransferase activity has been demonstrated in protozoans, farnesyltransferase inhibitors are interesting as potential anti malaria drugs, as well. The main focus of this work is the synthesis of phenylacylamino derivatives, which have been established as non-thiol farnesyltransferase inhibitors. These compounds exhibit activity with IC50-values in the low micromolar range. By evaluating the structure-activity relationship of this series and using computer-based analysis, we were able to develop different arylacrylic acid and biarylacrylic acid derivatives. These compounds showed enhanced activity against the isolated enzyme with IC50-values in the lower nanomolar range. In addition, ten compounds showed antiplasmodial activity against a multiresistent strain of plasmodium falciparum with IC50-values of less than 100 nM.