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Das angeborene Immunsystem verfügt über eine Vielzahl keimbahnkodierter Rezeptoren, die pathogenspezifische Muster erkennen und so eine Immunantwort auslösen können. Verantwortlich für die Detektion doppelsträngiger RNA im Zytoplasma ist die Familie der RIG I ähnlichen Rezeptoren, zu der u.a. RIG I und MDA5 gehören; im Endosomen wird doppel- und einzelsträngige RNA durch die Toll-ähnlichen Rezeptoren („Toll like receptors“, TLRs) 3, 7 und 8 erkannt. Diese Rezeptoren können unter physiologischen Bedingungen anhand von Struktur und Modifikationen zwischen zelleigener und zellfremder RNA unterscheiden, unter pathologischen Bedingungen kann es aber auch zu einer Erkennung körpereigener RNA kommen. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Erkennung zelleigener RNA im Zytoplasma. Während einer Virusinfektion kann doppelsträngige virale RNA nicht nur direkt durch die RIG I ähnlichen Rezeptoren erkannt werden, sondern auch indirekt über 2‘5‘ Oligoadenylat-aktivierte RNase L aktivieren. Dies führt zum Schneiden zelleigener RNA, wobei die gebildeten Fragmente wiederum von keimbahn-kodierten Rezeptoren erkannt werden. Diese Verstärkung des Gefahrensignals nimmt eine grundlegende Rolle in der Virusabwehr ein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Erkennung zelleigener RNase-generierter RNA-Fragmente ausschließlich über RIG I verläuft. Die Existenz spezifischer endogener RIG I Liganden wurde belegt und die Sequenzen der betreffenden Fragmente wurden mittels Next Generation Sequencing ermittelt. Hierbei handelt es sich um Strukturen aus der 28S rRNA und der ITS2, einem Prozessierungsprodukt der 45S rRNA. Der spezifische RIG I aktivierende Effekt dieser Sequenzen konnte in verschiedenen Stimulationsexperimenten nachgewiesen werden. Interessanterweise tragen die endogenen stimulatorischen RNA-Spezies im Gegensatz zum Prototyp eines RIG I Liganden kein 5' Triphosphat, sondern ein 3' Monophosphat, auch weisen sie keine typische Basenzusammensetzung mit hohem Uridingehalt auf. Stattdessen werden die außergewöhnlich GC-reichen Sequenzen vermutlich aufgrund ihrer Doppelsträngigkeit und einer Ringstruktur nahe der Schnittstelle von RIG I erkannt. Die besondere Bedeutung dieser Sequenzen wird durch die evolutionäre Konservierung dieser Strukturen belegt, auch könnten sie nicht nur eine Funktion in der Virusabwehr, sondern auch als Tumorsupressor haben. Die intrazelluläre Generierung immunstimulatorischer RNA-Spezies erfolgt nicht nur über die virusinduzierte RNase L, sondern auch über eine artifiziell in die Zelle transfizierte RNase A. Dies eröffnet die Möglichkeit zur Etablierung von RNase A als neue Adjuvansspezies. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss verschiedene Modifikationen des 18S rRNA Abkömmlings RNA63 auf dessen Erkennung durch die endosomalen TLRs 7 und 8 haben. Eine nichtmodifizierte RNA63 und solche mit einer 2'-O-Deoxy- oder Fluorgruppe werden sowohl durch TLR7 als auch durch TLR8 erkannt. Durch eine 2'-O-Methylierung allerdings lässt sich die Erkennung der RNA63 durch TLR7 hemmen, nicht aber die Erkennung durch TLR8. Somit handelt es sich bei 2'-methylierter RNA63 um einen spezifischen TLR8-aktivierenden Liganden.

Innate immunity has evolved different pattern recognition receptors to detect pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and to elicit an immune response. Whereas double stranded RNA in the cytoplasm is detected by RIG I and MDA5, double- and single stranded RNA in the endosome is recognized by Toll like Receptors (TLRs) 3, 7 and 8. Under physiological conditions, these receptors discriminate between foreign and self RNA based on certain structures and modification patters. Under pathological conditons, these receptors can also recognize self RNA. The major part of this thesis deals with the detection of self RNA as a potential danger signal in the cytoplasm. In the case of viral infection, in addition to the activation of RIG I and MDA5, double stranded RNA also leads to the activation of RNase L. Subsequently, cellular RNA is digested and fragments bound to pattern recognition receptors, which results in an amplification of the danger signal. In this thesis, it could be shown that the fragments of self-RNA are exclusively recognized by RIG I. It was proven that this RIG I activation is not a common effect of digested RNA but caused by specific RNA structures. The sequences of these molecules were obtained by Next Generation Sequencing. The endogenous RIG I ligands are derived from expansion segments in the 28S rRNA and from ITS2, a processing product of the 45S rRNA. Their specific RIG I activating effect could be shown in different immunostimulation experiments. Unlike the common model of an ultimate RIG I ligand, they do not bear a 5’ triphosphate but a 3’ monophosphate and are not rich in uridine but in guanosine and cytosine. Instead, the endogenous RIG I ligands seem to be detected due to their double-strandness and a certain loop structure. Involvement of ITS2 indicates a further link not only between antiviral response and RNase L but also between RNase L, rRNA biogenesis and cancer development. Generation of immunostimulatory RNA species is not only limited to virus induced RNase L but can also be obtained by artificial transfection of RNase A into a cell. Consequently, RNase A might be established as a novel species of adjuvant. In the second part of this thesis, the impact of modifications on the TLR7 and 8 mediated recognition of 18S rRNA derived RNA63 was analysed. Unmodified RNA63 and RNA63 bearing a 2’-O-deoxy or 2’-O-fluor modification all activate TLR7 and TLR8 while 2’-O-methylation inhibits TLR7 depended signaling and is solely detected by TLR8. This is why TLR8 activation is more resistent to RNA-modifications than TLR7activation. Consequently, 2’-O-methylated RNA63 is a specific TLR8 ligand., Das angeborene Immunsystem verfügt über eine Vielzahl keimbahnkodierter Rezeptoren, die pathogenspezifische Muster erkennen und so eine Immunantwort auslösen können. Verantwortlich für die Detektion doppelsträngiger RNA im Zytoplasma ist die Familie der RIG I ähnlichen Rezeptoren, zu der u.a. RIG I und MDA5 gehören; im Endosomen wird doppel- und einzelsträngige RNA durch die Toll-ähnlichen Rezeptoren („Toll like receptors“, TLRs) 3, 7 und 8 erkannt. Diese Rezeptoren können unter physiologischen Bedingungen anhand von Struktur und Modifikationen zwischen zelleigener und zellfremder RNA unterscheiden, unter pathologischen Bedingungen kann es aber auch zu einer Erkennung körpereigener RNA kommen. Der Hauptteil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Erkennung zelleigener RNA im Zytoplasma. Während einer Virusinfektion kann doppelsträngige virale RNA nicht nur direkt durch die RIG I ähnlichen Rezeptoren erkannt werden, sondern auch indirekt über 2‘5‘ Oligoadenylat-aktivierte RNase L aktivieren. Dies führt zum Schneiden zelleigener RNA, wobei die gebildeten Fragmente wiederum von keimbahn-kodierten Rezeptoren erkannt werden. Diese Verstärkung des Gefahrensignals nimmt eine grundlegende Rolle in der Virusabwehr ein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Erkennung zelleigener RNase-generierter RNA-Fragmente ausschließlich über RIG I verläuft. Die Existenz spezifischer endogener RIG I Liganden wurde belegt und die Sequenzen der betreffenden Fragmente wurden mittels Next Generation Sequencing ermittelt. Hierbei handelt es sich um Strukturen aus der 28S rRNA und der ITS2, einem Prozessierungsprodukt der 45S rRNA. Der spezifische RIG I aktivierende Effekt dieser Sequenzen konnte in verschiedenen Stimulationsexperimenten nachgewiesen werden. Interessanterweise tragen die endogenen stimulatorischen RNA-Spezies im Gegensatz zum Prototyp eines RIG I Liganden kein 5' Triphosphat, sondern ein 3' Monophosphat, auch weisen sie keine typische Basenzusammensetzung mit hohem Uridingehalt auf. Stattdessen werden die außergewöhnlich GC-reichen Sequenzen vermutlich aufgrund ihrer Doppelsträngigkeit und einer Ringstruktur nahe der Schnittstelle von RIG I erkannt. Die besondere Bedeutung dieser Sequenzen wird durch die evolutionäre Konservierung dieser Strukturen belegt, auch könnten sie nicht nur eine Funktion in der Virusabwehr, sondern auch als Tumorsupressor haben. Die intrazelluläre Generierung immunstimulatorischer RNA-Spezies erfolgt nicht nur über die virusinduzierte RNase L, sondern auch über eine artifiziell in die Zelle transfizierte RNase A. Dies eröffnet die Möglichkeit zur Etablierung von RNase A als neue Adjuvansspezies. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss verschiedene Modifikationen des 18S rRNA Abkömmlings RNA63 auf dessen Erkennung durch die endosomalen TLRs 7 und 8 haben. Eine nichtmodifizierte RNA63 und solche mit einer 2'-O-Deoxy- oder Fluorgruppe werden sowohl durch TLR7 als auch durch TLR8 erkannt. Durch eine 2'-O-Methylierung allerdings lässt sich die Erkennung der RNA63 durch TLR7 hemmen, nicht aber die Erkennung durch TLR8. Somit handelt es sich bei 2'-methylierter RNA63 um einen spezifischen TLR8-aktivierenden Liganden.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten, welche die chromatographische Effizienz in der miniaturisierten HPLC beeinflussen. Der Einfluss der Kanalgeometrie auf die chromatographische Effizienz von gepackten Mikrochipkanälen wurde untersucht. Es wurden HPLC/UV Mikrochips mit Trennkanälen von quadratischem, trapezoidalen und gaußförmigen Querschnitt eingesetzt. Die Mikrochips wurden Laserablation und Lamination der Polyimidfolien hergestellt. Als Packungsmaterialien wurden 3 oder 5 µm-große sphärische C8-Kieselgelpartikel verwendet und unter optimierten Bedingungen in den Trennkanal gepackt. Die Dispersionseigenschaften der ungepackten Trennkanäle wurden vermessen und mit berechneten Daten der axialen Dispersionseigenschaften von Zylindern verglichen. Packungsdichten und Bodenhöhen der verschiedenen gepackten Betten werden miteinander verglichen und deren Unterschiede erklärt. Die Packungen der 3 µm Partikel reflektieren das Dispersionsverhalten der Leerkanäle. Die Dispersion in den 5 µm Packungen korreliert mit den erhaltenen Packungsdichten, die wiederum durch die Anzahl und die Erreichbarkeit der Ecken in den jeweiligen Kanalquerschnitten limitiert sind. Interpartikuläre Porositäten und Zwischenkornvolumina von gepackten Kapillarsäulen und kommerziell erhältlichen analytischen Umkehrphasensäulen wurden mittels intrapartikulärem Donnan-Ausschluss einer kleinen, nicht-retardierten und ko-ionischen Verbindung (Nitrationen) bestimmt. Die Anwendbarkeit der Methode wurde für Kieselgel, Umkehrphasen- und Kationenaustauschermaterialien mit unterschiedlichen Partikelgrößen, Porendurchmessern und Partikelkonstruktion (vollporös und core-shell) in Abhängigkeit der Ionenstärke der mobilen Phase untersucht. Die Nitrationen werden bei niedrigen Pufferkonzentrationen vollständig von dem intrapartikulären Porenraum der Partikel ausgeschlossen, deutlich sichtbar durch eine Plateauregion, in welche die Elutionsvolumina der Nitrationen laufen. Für die kommerziellen HPLC-Säulen wurden deutliche Plateauregionen beobachtet, sogar im Falle von sehr dicht gepackten core-shell und 1,8 µm Partikeln. Dies zeigt, dass die Donnan-Ausschlussmethode sehr gut geeignet ist, die interpartikulären Porositäten schnell und einfach bis auf die dritte Nachkommastelle zu bestimmen. Die erhaltenen interpartikulären Porositäten stimmen mit den Werten der inversen Größenausschlussmethode gut überein. Einschränkungen in der Anwendbarkeit treten erst auf, wenn der Donnan-Ausschluss (elektrostatischer Ausschluss) oder der mechanische Ausschluss der inversen Größenausschlusschromatographie auch im Zwischenkornraum der gepackten Betten auftreten. Dies ist der Fall für sehr kleine, hochgeladene Partikel oder sehr großen Porendurchmessern. Graduelle Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase während einer Gradientenelution beeinflusst die Elektrosprayionisation bei direkter Kopplung mit einem Massenspektrometer. Der Einfluss der Eluentzusammensetzung auf den Elektrospraymodus und die damit einhergehenden Änderungen der Spraystabilität und des MS-Signals werden mittels Infusions- und Injektionsexperimenten untersucht. Die verwendete HPLC/ESI-MS Konfiguration bestand aus einem Mikrochip mit Anreicherungssäule, Trennkanal und Make-up Flusskanal. Eine Nanopumpe wurde an den Trennkanal angeschlossen, eine zweite bediente den Make-up Flusskanal mit einem inversen Lösungmittelgradienten. Die beiden Lösungsmittelströme wurden vor der Elektrosprayspitze zusammengeführt, so dass an der Elektrosprayspitze eine identische Eluentzusammensetzung über den gesamten Gradientenlauf vorlag. Signalparameter eines Analyten wurden mit und ohne Kompensation über den Make-up Fluss aufgezeichnet und mit der Spraystabilität und dem jeweiligen Elektrospraymodus korreliert. Die Anwendung des post-column Make-up Flusses verbesserte die Spray- und Signalstabilität erheblich, ohne die chromatographische Effizienz zu beeinträchtigen.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit verschiedenen Aspekten, welche die chromatographische Effizienz in der miniaturisierten HPLC beeinflussen. Der Einfluss der Kanalgeometrie auf die chromatographische Effizienz von gepackten Mikrochipkanälen wurde untersucht. Es wurden HPLC/UV Mikrochips mit Trennkanälen von quadratischem, trapezoidalen und gaußförmigen Querschnitt eingesetzt. Die Mikrochips wurden Laserablation und Lamination der Polyimidfolien hergestellt. Als Packungsmaterialien wurden 3 oder 5 µm-große sphärische C8-Kieselgelpartikel verwendet und unter optimierten Bedingungen in den Trennkanal gepackt. Die Dispersionseigenschaften der ungepackten Trennkanäle wurden vermessen und mit berechneten Daten der axialen Dispersionseigenschaften von Zylindern verglichen. Packungsdichten und Bodenhöhen der verschiedenen gepackten Betten werden miteinander verglichen und deren Unterschiede erklärt. Die Packungen der 3 µm Partikel reflektieren das Dispersionsverhalten der Leerkanäle. Die Dispersion in den 5 µm Packungen korreliert mit den erhaltenen Packungsdichten, die wiederum durch die Anzahl und die Erreichbarkeit der Ecken in den jeweiligen Kanalquerschnitten limitiert sind. Interpartikuläre Porositäten und Zwischenkornvolumina von gepackten Kapillarsäulen und kommerziell erhältlichen analytischen Umkehrphasensäulen wurden mittels intrapartikulärem Donnan-Ausschluss einer kleinen, nicht-retardierten und ko-ionischen Verbindung (Nitrationen) bestimmt. Die Anwendbarkeit der Methode wurde für Kieselgel, Umkehrphasen- und Kationenaustauschermaterialien mit unterschiedlichen Partikelgrößen, Porendurchmessern und Partikelkonstruktion (vollporös und core-shell) in Abhängigkeit der Ionenstärke der mobilen Phase untersucht. Die Nitrationen werden bei niedrigen Pufferkonzentrationen vollständig von dem intrapartikulären Porenraum der Partikel ausgeschlossen, deutlich sichtbar durch eine Plateauregion, in welche die Elutionsvolumina der Nitrationen laufen. Für die kommerziellen HPLC-Säulen wurden deutliche Plateauregionen beobachtet, sogar im Falle von sehr dicht gepackten core-shell und 1,8 µm Partikeln. Dies zeigt, dass die Donnan-Ausschlussmethode sehr gut geeignet ist, die interpartikulären Porositäten schnell und einfach bis auf die dritte Nachkommastelle zu bestimmen. Die erhaltenen interpartikulären Porositäten stimmen mit den Werten der inversen Größenausschlussmethode gut überein. Einschränkungen in der Anwendbarkeit treten erst auf, wenn der Donnan-Ausschluss (elektrostatischer Ausschluss) oder der mechanische Ausschluss der inversen Größenausschlusschromatographie auch im Zwischenkornraum der gepackten Betten auftreten. Dies ist der Fall für sehr kleine, hochgeladene Partikel oder sehr großen Porendurchmessern. Graduelle Änderungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase während einer Gradientenelution beeinflusst die Elektrosprayionisation bei direkter Kopplung mit einem Massenspektrometer. Der Einfluss der Eluentzusammensetzung auf den Elektrospraymodus und die damit einhergehenden Änderungen der Spraystabilität und des MS-Signals werden mittels Infusions- und Injektionsexperimenten untersucht. Die verwendete HPLC/ESI-MS Konfiguration bestand aus einem Mikrochip mit Anreicherungssäule, Trennkanal und Make-up Flusskanal. Eine Nanopumpe wurde an den Trennkanal angeschlossen, eine zweite bediente den Make-up Flusskanal mit einem inversen Lösungmittelgradienten. Die beiden Lösungsmittelströme wurden vor der Elektrosprayspitze zusammengeführt, so dass an der Elektrosprayspitze eine identische Eluentzusammensetzung über den gesamten Gradientenlauf vorlag. Signalparameter eines Analyten wurden mit und ohne Kompensation über den Make-up Fluss aufgezeichnet und mit der Spraystabilität und dem jeweiligen Elektrospraymodus korreliert. Die Anwendung des post-column Make-up Flusses verbesserte die Spray- und Signalstabilität erheblich, ohne die chromatographische Effizienz zu beeinträchtigen., This work deals with separation efficiency and column characteristics of particle-packed HPLC microchips. The impact of conduit geometry on the chromatographic performance of typical particulate microchip packings is investigated. For this purpose, HPLC/UV-microchips with separation channels of quadratic, trapezoidal, or Gaussian cross-section were fabricated by direct laser ablation and lamination of multiple polyimide layers and then slurry-packed with either 3 or 5 µm spherical porous C8-silica particles under optimized packing conditions. Experimentally determined plate height curves for the empty microchannels are compared with dispersion coefficients from theoretical calculations. Packing densities and plate height curves for the various microchip packings are presented and conclusively explained. 3 µm packings display a high packing density irrespective of their conduit geometries and their performance reflects the dispersion behaviour of the empty channels. Dispersion in 5 µm packings correlates with the achieved packing densities, which are limited by the number and accessibility of corners in a given conduit shape. Interparticle void volumes and porosities of packed capillaries and of commercially available, analytical, reversed-phase HPLC columns have been determined using intraparticle Donnan exclusion of a small, unretained, co-ionic tracer (nitrate ions). The operational domain of this approach has been characterized for bare silica, reversed-phase, and strong cation-exchange materials with different particle sizes, intraparticle pore sizes, and construction (fully porous or core-shell) in dependence of the mobile phase ionic strength. At low buffer concentrations nitrate ions are completely electrostatically excluded from the intraparticle mesopore space, which is reflected by a plateau region in the elution curves. The elution volume in the plateau region equals the interparticle void volume. Clearly defined plateau regions were observed for all columns, even those densely packed with core-shell and sub-2 µm particles, enabling the accurate determination of interparticle porosities to three decimal places in a fast and convenient way. Interparticle porosities agree well with those analyzed by inverse size-exclusion chromatography (ISEC). Limitations to the use of Donnan exclusion (electrostatic exclusion) and ISEC (mechanical exclusion) arise as either type of exclusion becomes noticeable also in the cusp regions between particles, or as the intraparticle pores are so large that complete electrostatic and size exclusion are difficult to realize. Dynamic changes in mobile phase composition during high performance liquid chromatography (HPLC) gradient elution coupled to mass spectrometry (MS) sensitively affect electrospray modes. The impact of the eluent composition on spray stability and MS response by infusion and injection experiments with a small tetrapeptide in water-acetonitrile mixtures was investigated. The employed HPLC/ESI-MS configuration uses a microchip equipped with enrichment column, separation column, and make-up flow (MUF) channel. One nano pump is connected to the separation column, while a second one delivers solvent of exactly inverted composition to the MUF channel. Both solvent streams are united behind the separation column, before the ESI tip, such that the resulting electrosprayed solution always has identical composition during a gradient elution. Analyte peak parameters without and with MUF compensation are determined and discussed with respect to the electrospray mode and eluent composition. The post-column MUF significantly improves spray and signal stability over the entire solvent gradient, without compromising the performance of the HPLC separation column. It can also be conveniently implemented on microchip platforms.